一种高通量、高含量、液态的 Pathosystem线虫
2018年7月1日
在这里, 我们描述了一个协议, 它是一个适应性强, 全宿主, 高内容筛选工具, 可用于研究宿主病原体相互作用, 并用于药物发现。
这种方法可以回答宿主病原体相互作用和药物发现中的问题，例如各种毒力因子的重要性以及小分子改善起源的能力。该技术的主要优点是它以小体积的液体形式进行。首先，在 BSL 2 生物安全柜内工作时，将铜绿假单胞菌从冷冻原液中划线到 LB 琼脂板上。
将板在 37 摄氏度下孵育 16 至 24 小时，然后将板在 4 摄氏度下存放长达一周。在设置检测板前两天，使用板中的单个菌落接种 3 至 5 mL 无菌 LB 肉汤。将培养物在 37 摄氏度下孵育 12 至 16 小时。
根据文本方案制备慢杀灭或 SK 培养基后，用来自新鲜过夜 LB 培养物的 350 毫升铜绿假单胞菌，接种每个 10 厘米的 SK 板。使用无菌细菌撒布器均匀传播细菌，并让板在生物安全柜中干燥。
然后，将板在 37 摄氏度下孵育 24 小时。为了在 24 孔深孔板的单个孔中并行测试多种 RNAi 细菌菌株，将来自先前制备的含有细菌的 RNAi 的每个克隆的单个菌落接种到 4 毫升补充羧青霉素的 LB 中。将板放入针对多孔板优化的振荡培养箱中，在 37 摄氏度和 950 rpm 下放置 16 小时，然后以 2， 000 g 离心 5 分钟收集细菌。倒置平板并剧烈摇动上清液。
使用 100 μL S Basal 重悬 RNAi 细菌。将重悬的细菌移液到补充有 IPTG 和羧苄青霉素的多孔 NGM 板的适当数量的孔中，并让板干燥。根据文本方案制备 L1 蠕虫后，通过每 10 厘米板吸取大约 5， 000 条蠕虫来准备用于基本实验的板，用 RNAi 或 OP50 超级食物接种。
为了设置 RNAi 筛选，在接种有 RNAi 的 24 孔板中每孔移液大约 300 条蠕虫。如果使用的菌株是温度无菌的，请将蠕虫在 15 摄氏度下孵育约 16 小时，然后将它们转移到 25 摄氏度下 44 小时，以完成发育并防止胚胎发生。为了进行液体杀灭测定，使用细胞刮刀从 SK 板中去除铜绿假单胞菌，并将细菌重悬于大约 5 毫升的基础链球菌中。
使用分光光度计测量细菌悬浮液的 OD 600。在 S.Basal 中制备 24 毫升稀释的铜绿假单胞菌原液，OD 600 等于 09，然后加入 21 毫升液体 SK 培养基，并使用多通道移液器将 45 微升细菌和培养基转移到 384 孔板的每个孔中。将蠕虫从源头清洗到 50 毫升锥形管中，让它们在重力下沉降。
吸出上清液至 5 毫升，然后用总共 50 毫升 S.Basal 重悬蠕虫，再重复洗涤两次。根据文本方案，使用蠕虫分选仪将大约 22 条蠕虫分选到 384 孔板的每个孔中，然后使用透气膜密封板并在 25 摄氏度下孵育 24 至 48 小时。在所需的时间，使用洗板机和 S.Basal 清洗 384 孔板总共 5 次。
最容易犯的错误之一是在蠕虫完全沉降之前吸出 384 孔板。需要练习才能准确看到蠕虫是否已经完全稳定下来。最后一次洗涤后，将上清液吸出至 20 μL。
然后，每孔加入 50 微升 98 微摩尔核酸染色剂，最终浓度为 0.7 微摩尔。将板在室温下孵育 12 至 16 小时。在所需的孵育期后，使用洗板机至少清洗板 3 次。
对于数据采集，使用分光光度计或自动显微镜对透射光和荧光进行成像。在 24 孔板的每孔中加入 1 毫升 S 基础，每孔含有 300 个蠕虫。通过摇动板轻轻搅动蠕虫，然后将蠕虫转移到空的、无菌的 24 深孔板中。
让蠕虫在重力作用下稳定下来，大约 5 分钟。吸出上清液，每孔留下约 1 毫升，然后向每个孔中加入 7 毫升 S 基础。再重复洗涤两次，然后在最后一次洗涤后吸出除大约 400 μL 上清液外的所有上清液。
将细菌移液到 384 孔板中以避免饥饿后，使用蠕虫分选仪的重采样器功能将 22 条蠕虫分选到 384 孔板的每个孔中。最后，在分选后，添加小分子或其他实验特定材料。如图所示，当遵循本视频中概述的步骤时，只有在铜绿假单胞菌存在的情况下才会观察到秀丽隐杆线虫的时间依赖性杀伤。
相比之下，在没有关键细菌营养补充剂的情况下，几乎不会观察到杀伤。如此处所示，铜绿假单胞菌在 37 摄氏度和 25 摄氏度的两步孵育，这对于传统的慢杀灭测定至关重要，最初是在液体杀灭中实现的，在该测定中是可有可无的。该方案可耐受广泛的初始细菌浓度，从低至 OD 600 等于 0025，并且仍然表现出时间和浓度依赖性杀伤，尽管时间确实发生了变化。
此外，通常只需 4 个孔就足以获得具有统计学意义的数据。当信噪比较高时，此处显示了处理效用的一个示例，如在此示例中，分析很简单，区分正条件和负条件是微不足道的。在这些情况下，即使是较弱的命中也可以很容易识别。
一旦掌握，该技术可以在每个 384 孔板大约 60 到 75 分钟的手动作时间内完成，不包括分选。在尝试此过程时，请务必记住将所有组分添加到您的培养基中，否则毒力会受到影响。该检测简化了基于整个生物体表型的筛选在宿主病原体研究中药物发现中的应用。
看完这个视频，你应该对如何进行液基秀丽隐杆线虫发病机制分析有一个很好的了解。该程序可以通过用其他病原体来改变，例如用粪肠杆菌代替铜绿假单胞菌，从而促进寻找其他细菌感染的治疗方法。不要忘记，与铜绿假单胞菌或粪肠球菌等传染性细菌一起工作可能很危险。
执行此程序时，应始终采取适当的预防措施，例如适当的培训、良好的个人防护设备和适当的技术。
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概述
本文描述了一种用于研究宿主-病原体相互作用并辅助药物发现的高内容筛选工具的协议。该方法强调在液体格式下使用小体积，使其适用于各种实验。
关键研究组成部分
科学领域
- 宿主-病原体相互作用
- 药物发现
- 微生物毒力因子
背景
- 了解宿主-病原体相互作用对开发新疗法至关重要。
- 毒力因子在病原体行为和感染中扮演重要角色。
- 小分子可能会减轻病原体效应。
- 高内容筛选允许同时有效分析多种因素。
研究目的
- 开发用于研究宿主-病原体相互作用的协议。
- 通过高内容筛选促进药物发现。
- 评估毒力因子和小分子的影响。
使用的方法
- 将冷冻库存的铜绿假单胞菌涂布到LB琼脂平板上。
- 在37度C下孵育16到24小时。
- 用单个菌落接种无菌LB肉汤进行培养。
- 在BSL 2生物安全柜中进行测定。
主要结果
- 该方法允许评估各种毒力因子。
- 可以测试小分子减轻病原体效应的能力。
- 小体积液体格式提高了实验效率。
- 结果可以为未来的药物开发策略提供信息。
结论
- 该协议为研究宿主-病原体动力学提供了一个多功能工具。
- 它支持潜在治疗剂的识别。
- 未来的应用可能扩展到其他病原体和药物类别。
常见问题
Executive Industry Relevance
This liquid-based C. elegans pathosystem enables high-throughput phenotypic screening in a liquid format, reducing false positives by eliminating toxic or bio-unavailable compounds early in discovery. The assay supports rapid interrogation of host-pathogen interactions and virulence factors, accelerating target validation and lead identification in antimicrobial discovery. Its compatibility with RNAi screening and small molecule testing provides a scalable, reproducible platform for de-risking therapeutic hypotheses before costly biochemical purification or animal model studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates host factors in pathogen killing via RNAi screens in 24- or 96-well formats to clarify therapeutic targets.
- Operational Value: Enables whole-genome screens in months, reducing time to identify host-directed drug targets.
- Predictive Value: Supports phenotypic readouts that reflect in vivo-like host-pathogen dynamics, improving target confidence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Uses liquid format with small volumes to enable high-content, high-throughput screening in 384-well plates.
- Operational Value: Requires as few as four wells for statistically significant data, improving assay efficiency and reagent conservation.
- Assay Readiness: Compatible with automated imaging and spectrophotometry for quantitative, reproducible readouts.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Adapts to Gram-positive pathogens like E. faecalis without preinfection, improving safety and reducing contamination risk.
- Disease Relevance: Models time-dependent killing relevant to chronic infection phenotypes.
- Preclinical Continuity: Supports screening of small molecules that ameliorate pathogenesis, informing lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within early discovery workflows, supporting hypothesis testing in host-pathogen interactions and enabling progression from target identification to phenotypic lead screening.
- Discovery Biology: Facilitates interrogation of virulence factors and host genetic contributions to pathogenesis.
- Screening: Enables standardized, liquid-based phenotypic screening with quantitative worm survival readouts.
- Analytics: Generates time- and concentration-dependent killing curves amenable to statistical analysis and hit selection.
- Translational Research: Connects host-target modulation to pathogen attenuation, supporting mechanistic de-risking.
- Enterprise Reuse: Platform adaptable to multiple pathogens, supporting broad antimicrobial target discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces false positives by removing cytotoxic or bio-unavailable compounds early in screening.
- Operational Value: Liquid format with small volumes increases throughput and reduces hands-on time to 60–75 minutes per 384-well plate.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing phenotypic efficacy data in a whole-organism context.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of host-directed or virulence-targeting antimicrobial candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans handling, RNAi feeding, and pathogen culture under BSL-2 conditions.
- Depends on access to worm sorters, multichannel pipettes, microplate washers, and automated imagers or spectrophotometers.
- Needs standardization of worm sorting, bacterial seeding, and incubation timing across teams and sites.
- Adaptation to alternative pathogens requires validation of killing kinetics and liquid compatibility.
- Limitations include dependency on synchronized worm staging and potential variability in RNAi feeding efficiency.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:25
Preparation and Maintenance of P. aeruginosa and RNAi Bacteria
2:34
Maintenance and Preparation of C. elegans
3:21
Liquid Killing Assay Setup
5:56
Adaptation for Screening Multiple C. elegans Strains or Knockdowns
7:06
Results: C. elegans-P. aeruginosa Liquid Killing Pathosystem
8:37
Conclusion
