Name: 一种高通量、高含量、液态的 Pathosystem线虫 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 了解一种高通量、高含量的液态秀丽隐杆线虫病原体系统筛选方法，用于研究宿主与病原体相互作用及药物发现。该方法采用小体积液体格式，可高效评估毒力因子和小分子化合物的效果。

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本研究由德克萨斯州癌症预防与研究研究所（CPRIT）资助项目RR150044、Welch基金会研究资助C-1930以及美国国立卫生研究院授予NVK的K22 AI110552项目资助。资助机构在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

注意：P. aeruginosa 和 E. faecalis 属于生物安全二级病原体，必须采取适当的安全防护措施，以防止意外感染并尽量减少对实验台面的污染。所有与病原体接触过的培养基和材料均须进行灭菌和/或妥善丢弃。更多指导方针可参见美国疾病控制与预防中心（CDC）发布的《微生物学和生物医学实验室生物安全》（BMBL）第五版。
1. 铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的制备与培养
<ol>
	<li>从冻存菌种中挑取P. aeruginosa在LB（Lysogeny Broth）琼脂平板上划线。37 °C培养16至24小时。 
	注意：为确保无菌操作，P. aeruginosa实验应在BSL-2生物安全柜内进行。采取适当的安全防护措施，以最大限度降低病原体感染或污染的风险。</li>
	<li>将该平板转移至4 °C保存。此平板可在4 °C下保存，并用于接种培养物，最长可使用一周。一周后，需对平板进行去污染处理并丢弃，重新制备新的LB划线平板。 
	注意：P. aeruginosa的毒力在长期储存后会下降。</li>
	<li>在设置检测平板前两天，从步骤1.1制备的平板上挑取单个P. aeruginosa菌落，接种于3–5 mL无菌LB液体培养基中。在37 °C下培养12至16小时。 
	注意：培养时间不得超过16小时。在营养丰富的液体培养条件下，P. aeruginosa PA14开始发生裂解。</li>
	<li>制备无菌的10 cm平板，内含Slow Kill培养基（每升含3 g NaCl、3.5 g蛋白胨、1 mM CaCl2、1 mM MgSO4、25 mL磷酸盐缓冲液（配制比例：132 mL K2HPO4 (1M) 和868 mL KH2PO4 (1M)），以及18 g琼脂）。 
	注意：可提前制备平板。平板可在4 °C密封容器中保存最多3周。</li>
	<li>每块10 cm Slow Kill平板（SK平板）接种350 μL来自新鲜过夜LB培养物的P. aeruginosa。使用无菌涂布棒将细菌均匀涂布于培养基表面，并在BSL-2生物安全柜中晾干。</li>
	<li>将平板在37 °C下培养24小时。</li>
</ol>
2. RNAi 细菌的制备
<ol>
	<li>从冷冻保存的菌种中划线或点种含有RNAi的细菌菌株至含有适当抗生素的LB琼脂平板上（对于Ahringer和Vidal文库，使用含100 µg/mL羧苄青霉素和15 µg/mL四环素的LB平板）。 
	注意：操作非致病性细菌时，应使用BSL-2 A/B级生物安全柜或BSL-1级层流罩，以确保培养物无菌，并最大限度减少文库交叉污染的风险。</li>
	<li>在37 °C下培养平板24小时。</li>
	<li>将平板在4 °C下保存，最多可保存两周。
	<ol>
		<li>两周后丢弃平板，并更换为新制备的平板。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过分别挑取各克隆的单个菌落，接种至含有羧苄青霉素的4 mL LB液体培养基中，可在24孔深孔板的单个孔或无菌试管中平行测试多个RNAi菌株。 
	注意：已有报道指出四环素会降低RNAi效率。因此，该培养基中不应添加四环素。</li>
	<li>将24孔深孔板放入适用于多孔板的摇床培养箱中，在37 °C、950 rpm条件下振荡培养16小时。 
	注意：使用常规摇床培养箱难以在多孔板中获得均匀的细菌生长。摇床必须能够以至少750 rpm的速度振荡，才能保证培养物正常生长。若无专用摇床，也可在单独的试管中分别培养每种菌液。如需，可在培养后将菌液转移至24孔板进行离心。</li>
	<li>以2,000 × g离心5分钟收集细菌。</li>
	<li>通过倒置平板并剧烈震荡弃去上清液。将RNAi细菌重悬于100 µL S基础培养基中（5.85 g NaCl、1 g K2HPO4、6 g KH2PO4溶于1 L超纯水中，经高压灭菌处理）。</li>
	<li>用移液器将重悬的细菌加入适量孔数的多孔NGM平板中（线虫生长培养基，每升含3 g NaCl、2.5 g蛋白胨、1 mM CaCl2、1 mM MgSO4、25 mL磷酸盐缓冲液（每升含132 mL K2HPO4 (1M) 和868 mL KH2PO4 (1M)）以及18 g琼脂），并补充IPTG（终浓度1 mM）和羧苄青霉素（终浓度100 μg/mL）。
	<ol>
		<li>6孔板每孔使用3.5 mL NGM培养基，24孔板每孔1 mL，96孔板每孔150 µL。</li>
		<li>6孔板每孔加入100 μL细菌悬液，24孔板每孔50 μL，96孔板每孔20 μL。静置晾干。 
		注意：通常在无菌流式罩中进行干燥，以促进快速且均匀的干燥过程。均匀干燥至关重要。避免过度干燥，因琼脂开裂会导致线虫钻入，从而造成线虫丢失，并可能堵塞液体处理系统。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备好的平板应立即使用，或在4 °C下密封保存，最多可保存两周以备后续使用。 
	注意：为防止平板干燥，可用塑料封口膜密封，或置于密闭容器中并放入湿润的纸巾以保持湿度。</li>
</ol>
3. C. elegans 的维持与准备
注意：在开始实验之前，需按以下步骤制备同步化的成年雌雄同体 gravid 蠕虫群体。
<ol>
	<li>洗涤怀卵成虫（即， 从4至6个10厘米的NGM平板中，向每个平板加入4 mL S Basal溶液，轻轻摇晃，使含有多个可见胚胎的性腺个体悬浮，然后将液体倒入15 mL锥形管中。</li>
	<li>通过离心（1,000 × g，30 秒）收集线虫。</li>
	<li>吸走上清液，注意不要扰动虫体沉淀。</li>
	<li>向虫体沉淀中加入3.5 mL线虫漂白液（终浓度为0.5 M NaOH、1%次氯酸钠，溶于无菌水中），倒置混匀1分钟。</li>
	<li>短暂涡旋，然后在1,000 × g离心30秒。</li>
	<li>吸出或倾去上清液，注意不要扰动虫体沉淀。</li>
	<li>向虫体沉淀中加入 3.5 mL 新鲜的线虫漂白液。</li>
	<li>在漂白液中剧烈混合线虫。每隔一段时间（约每10秒）在解剖显微镜下观察线虫，观察线虫角质层是否破裂并释放出卵。当大多数成虫线虫已溶解（约95%）时，加入S Basal缓冲液将漂白液稀释至15 mL，以终止消化反应。 
	注意：卵壳对次氯酸钠的耐受性高于成虫组织，但长时间暴露仍可导致卵壳溶解。为避免卵壳溶解，卵与线虫漂白液的接触时间不应超过7分钟。若卵壳受损严重，胚胎将死亡。</li>
	<li>以1,000 × g离心30秒使胚胎成团，随后吸除或倾倒上清液，注意勿移除胚胎沉淀。</li>
	<li>用S基础培养基重悬线虫，最终体积为15 mL，以稀释残留的次氯酸钠溶液。</li>
	<li>重复洗涤步骤（3.9&#160;- 3.10) 再重复三次，共计连续洗涤四次。</li>
	<li>第四次洗涤后，吸除上清液，并向15 mL锥形管中加入最多5至6 mL无菌S Basal溶液。目的是将胚胎重悬至浓度约为每50条线虫 &#181;L. 
	注意：S 基础培养基的用量取决于卵团的大小；卵团越大，所需的 S 基础培养基越多。</li>
	<li>在室温下于台式旋转仪上孵育锥形管过夜，或在15℃下孵育48小时 &#176;C. 幼虫将孵化，但由于营养缺乏，幼虫发育将在L1阶段（L1滞育）停滞。</li>
	<li>在解剖显微镜下检查胚胎，确认大多数胚胎已孵化并停滞在L1发育阶段。</li>
	<li>通过取样20条线虫确定线虫数量 &#181;L 虫液制备物，并用 80 &#181;L 型 S 基础培养基。用移液器加入 10 &#181;将稀释后的线虫溶液各1 L直接加入空白NGM平板中，重复操作2次。
	<ol>
		<li>统计每个点中的幼虫数量并计算平均值。将该平均值除以2，得到每份样本中线虫的近似数量 &#181;线虫制备中的L阶段。制备好的线虫可用于传代培养板或实验。 
		注意：4至5天后，饥饿的幼虫将开始死亡；此时应弃置该样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为扩增菌株，将适量的L1期线虫（5,000 - 6,000条）用移液器接种至3 - 4块直径10 cm、点种浓缩OP50的NGM平板上 大肠杆菌 – “超级食品” (E. coli OP50 以 25 倍浓度点样（即， 1 L 在LB培养基中过夜培养的OP50可制备40 mL 25倍浓缩的OP50超级食物；每块10 cm NGM平板上点样2 mL该浓缩细菌悬液。</li>
	<li>为准备实验用平板，请执行以下操作之一（对于“基本方案”，采用3.17.1的设置；对于“RNAi筛选设置”，根据需要使用步骤3.17.2至3.17.4）：
	<ol>
		<li>用移液器将约 5,000 条线虫转移至接种有 RNAi 或 OP50 超级食物的 10 cm 培养皿中。</li>
		<li>在接种了RNAi的6孔板中，每孔加入约500条线虫。</li>
		<li>在接种了RNAi的24孔板中，每孔加入约300条线虫。</li>
		<li>在接种了RNAi的96孔板中，每孔加入约100条线虫。 
		注：有关RNAi接种方法的说明，请参见《RNAi细菌制备》中的步骤2.7–2.9。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>如果使用的是可育品系的线虫，将线虫在25℃下培养 &#176;在约44至48小时内培养至所需年龄。一旦群体达到适当年龄，应尽快使用这些线虫，以尽量减少实验过程中线虫体内卵孵化带来的影响。</li>
	<li>如果所使用的菌株具有温度敏感型不育特性（例如，fer-15(b26); fem-1(hc17) 或 glp-4(bn2)），将线虫在15℃下孵育 &#176;C 培养约 16 小时，然后转移至 25 &#176;C 培养 44 小时以完成发育并防止胚胎发生。</li>
</ol>
4. 液体杀伤实验设置（基本方案）
注意：本方案适用于一种细菌菌株和一种线虫来源。
<ol>
	<li>使用细胞刮刀，去除 P. aeruginosa 从SK平板上挑取菌落并重悬于约5 mL S基础培养基中。根据需要进行放大培养。使用分光光度计测量细菌悬液的光密度（OD600)</li>
	<li>制备24 mL稀释的储备液 P. aeruginosa 在 S 基础培养基中，OD600 &#8776; 0.09（终浓度为3倍）。参见4.6.2了解每孔的最终成分，并相应调整细菌稀释液的体积。</li>
	<li>加入21 mL液体Slow Kill培养基（每升含3 g NaCl、3.5 g蛋白胨，并添加CaCl₂、MgSO₄、KH₂PO₄和KH₂PO₄）2 和 MgSO₄4 至终浓度为 1 mM）。使用多通道移液器，转移 45 &#181;将细菌和培养基的混合物各 L 加入 384 孔板的每个孔中。</li>
	<li>从源头冲洗线虫即，步骤 3.17.1）转移至 50 mL 圆锥管中，静置使线虫在重力作用下沉降。吸除上清液至剩余 5 mL。用总共 50 mL S 基础培养基重悬。</li>
	<li>重复步骤 4.4 两次。</li>
	<li>使用蠕虫分选仪，将约22条蠕虫分选至384孔板的每个孔中。 
	注意：该装置每次将每条线虫落入约1.1 &#181;升液体中，22条线虫相当于25条 &#181;L，使总体积达到70 &#181;L/孔
	<ol>
		<li>每个孔的最终组成为70 &#181;L. 45 &#181;将该体积的 L 作为细菌培养基加入（0.03 OD）600 24 中的细菌 &#181;L S 基础培养基，以及 21 &#181;L SK 添加 CaCl2 和 MgSO₄4）。其余的25 &#181;将L加入含有22条蠕虫的体系中。</li>
		<li>如果此处使用的分选仪（参见 材料表) 不可用时，可将线虫稀释至终浓度为 1 条线虫/&#181;L in S 基础培养基中，并用移液器加入 25 &#181;每孔使用多通道移液器加入L。然而，结果可能表现出更高的变异性。或者，也可使用Leung及其同事所述的蠕动泵液体分配器。19.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>线虫分选至384孔板后，用透气膜密封，并将板置于25 ℃培养 &#176;C，24 - 48 小时。</li>
	<li>在预定时间，使用微孔板清洗仪用S Basal溶液清洗384孔板，共清洗5次。
	<ol>
		<li>第二次洗涤后，吸除大部分培养基，保留约20 &#181;L. 使用微孔板涡旋振荡器剧烈振荡培养板至少30秒，以使孔底的任何碎片松动。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>最后一次洗涤后，吸除上清液至剩余20 &#181;L. 加入50 &#181;L 值为 0.98 &#181;M 核酸染料（参见 材料表)/孔，加入384孔板中，终浓度为0.7 &#181;M.</li>
	<li>室温孵育 12 - 16 小时。该染料仅对死亡的线虫进行染色。在完成所需的孵育时间后，使用微孔板洗涤仪清洗平板以去除多余的染料（至少洗涤 3 次）。</li>
	<li>使用分光光度计或自动显微镜采集数据，对透射光和荧光（531 nm 激发，593 发射）进行成像。
	<ol>
		<li>使用低倍物镜以获取整个孔的完整图像。</li>
		<li>或者，可采用流式蠕虫分析法。该技术利用大型物体流式细胞仪作为蠕虫荧光检测装置，测量完整生物体的大小和荧光强度。即， 秀丽隐杆线虫以与流式细胞术高度相似的方式。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用自动化图像分析软件（例如 CellProfiler，一种基于 MatLab 的免费图像分析平台） <a href="http://cellprofiler.org/">http://cellprofiler.org/</a>）以无偏倚的方式计算每孔中线虫的荧光面积和总面积。 
	注意：这些数值的商代表每孔的死亡比例。若某孔中20条线虫中有7条被染色，则死亡比例为0.35或35%。
	<ol>
		<li>首次使用前，必须通过人工评分对自动化图像处理流程进行验证。该验证通过比较自动化流程的结果与通过目视检查图像并记录每张图像中死亡线虫比例所得的评分来完成。验证过程可确保自动化图像处理参数的准确性，并正确反映数据。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 适用于筛选多种 C. elegans 品系或基因敲降（RNAi 筛选设置）的优化方案
注意：这是针对24孔板设置描述的RNAi筛选。
<ol>
	<li>在24孔板的每个孔中加入1 mL S Basal（参见步骤3.17.3）。通过轻轻振荡平板使线虫悬浮，然后将线虫转移至一个空的无菌24深孔板中。让线虫依靠重力自然沉降（约5分钟）。</li>
	<li>吸除上清液，每孔保留约1 mL。向每个孔中加入7 mL S Basal。</li>
	<li>重复步骤5.1–5.2至少2次。最后一次洗涤后，吸除上清液，每孔保留约400 µL。</li>
	<li>使用线虫分选仪的重取样（Resampler）功能，将24孔板线虫悬液中的22条线虫分选至384孔板的每个孔中（每个24孔板的孔可分配至8–12个384孔板的孔）。
	<ol>
		<li>为避免线虫饥饿，在分选前需用移液器将细菌加入384孔板中（可使用仅作为食物的菌株，如OP50，或致病菌株）。 
		注意：致病菌可通过执行步骤2.3–2.5或6.4–6.5加入；食物来源的细菌可参照P. aeruginosa的相同方案进行稀释和添加。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>线虫分选至384孔板后，加入小分子化合物或其他实验特异性材料。</li>
</ol>
6. 适用于 E. faecalis 的改进方法
注意：仅描述与P. aeruginosa检测方法的不同之处。
<ol>
	<li>准备一份新鲜的来源 E. faecalis 通过将细菌从冻存菌种接种到BHI（脑心浸液）琼脂平板上，并在37℃培养16至24小时 &#176;C. 
	注意：执行 E. faecalis 在BSL-2级生物安全柜内进行实验，以确保无菌条件。采取适当的安全防护措施，以最大限度降低病原体感染或污染的风险。</li>
	<li>平板可在 4℃ 保存 &#176;C 培养最长一周。此后更换为新鲜培养板。</li>
	<li>分选线虫前一晚，取单个菌落接种于3 - 5 mL无菌BHI培养基中 E. faecalis 37℃孵育12 - 16小时 &#176;C，同时振荡。</li>
	<li>将细菌加入孔中，操作同前 P. aeruginosa （3倍）&#160;S 基础培养基中的细菌，OD600&#8776;0.09). 
	注意：对于 E. faecalis，最终孔内成分为： E. faecalis （OD600&#8776;0.03），BHI = 10% v/v，其余体积用S基础培养基补足。请注意25 &#181;L型S基础培养基将与线虫一同提供。 
	注意： E. faecalis 产生厚实的生物膜，会吸收荧光染料，导致图像模糊。即使进行充分洗涤，也可能无法完全去除该生物膜。此时，可使用多通道移液器将线虫转移至无培养基的平板上。为便于转移，可在S Basal溶液中加入Tween 20，使其终浓度为0.1%（v/v）Tween 20。这有助于将线虫从生物膜中脱离。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何利益冲突需要披露。

该检测方法（或类似的检测方法，其中用其他病原体替代铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）或粪肠球菌（E. faecalis））具有多种用途，包括用于药物发现。此外，该方法还适用于回答基本的生物学问题，例如鉴定毒力因子、阐明宿主防御通路，以及确定宿主-病原体相互作用中涉及的调控机制。
尽管 P. aeruginosa 液体杀伤实验具有较高的稳健性，但在操作过程中仍有若干关键环节需格外注意，以最大限度降低实验失败的风险。首先，如前所述，用于实验的细菌来源平板 P. aeruginosa 接种物必须保持新鲜，否则细菌可能会丧失毒力，即使其在LB培养基中过夜生长。其次，关键是要确保向其中添加钙和镁 P. aeruginosa 杀伤实验。缺乏该条件将显著削弱毒力。最后值得注意的是，在HT115（用于RNAi实验）上培养的线虫比在OP50上培养的线虫死亡时间显著延迟（N. Kirienko，个人通讯）。因此，若转向基于RNAi的研究，必须通过实验确定该实验的最佳时间点。
<p class="j...

近一个世纪前，有效且广谱抗生素的发现与开发成为公共卫生领域的一个转折点，当时人们普遍认为传染病将成为历史的灾难。然而在短短几十年内，这种乐观情绪开始减弱，因为一种又一种病原体逐渐演化出耐药机制，使这些曾被视为奇迹的治疗方法效果受限。在一段时间内，药物研发与病原体之间的对抗似乎处于平衡状态。然而，由于抗菌药物的滥用，近年来已导致多种泛耐药菌株的出现，包括Klebsiella pneumoniae、Acinetobacter baumannii、Serratia marcescens和P. aeruginosa1,2,3,4。
P. aeruginosa 是一种机会性、革兰氏阴性、可感染多种宿主的病原体，对严重烧伤患者、免疫功能低下者以及囊性纤维化患者构成严重威胁。该病原体还 increasingly 被确认为重症医院内感染的致病因子，尤其是由于其持续获得抗菌药物耐药性所致。为初步应对这一威胁，我们采用了已有充分文献记录的 秀丽隐杆线虫-P. aeruginosa 感染系统5本实验室已利用该系统开发出一种基于液体的高通量、高内涵筛选平台，用于鉴定能够限制病原体杀伤宿主能力的新型化合物6有趣的是，这些化合物似乎至少属于三大类别，其中包括抗菌剂7 和毒力抑制剂8其他高内涵药物筛选检测方法 秀丽隐杆线虫 已有报道用于 结核分枝杆菌、沙眼衣原体、鼠疫耶尔森菌、单核细胞增生李斯特菌、土拉弗朗西斯菌、金黄色葡萄球菌、白假丝酵母菌和粪肠球菌以及其他9,10,11,12,13,14,15,16这类检测方法具有多个公认的优势，例如可减少对宿主和病原体均有毒性的假阳性结果，相较于化学筛选具有更高的生物利用度可能性，以及能够发现除单纯抑制微生物生长之外的作用分子，如抗毒力因子、免疫刺激分子，或以其他方式改变宿主-病原体相互作用平衡以利于宿主的化合物。此外，通过此类筛选发现的化合物通常在哺乳动物宿主体内也具有活性。
值得注意的是，已有至少另外两种检测方法17,18可用于在液体环境中对 C. elegans 进行高通量筛选。然而，这些检测方法均为对典型的肠道定植检测（即慢杀法）的改良，使其能够在液体中进行，从而提高通量并更便于化合物的筛选。细致的表征研究已确凿证明，这些检测方法与我们的基于液体的筛选方法在细菌毒力机制上存在差异7。由于这两类毒力机制在哺乳动物系统中均可观察到，因此在选择检测方法之前，实验人员需明确哪种毒力决定因素与其研究兴趣更为相关。
本文展示了一种优化的基于液体培养的 C. elegans-P. aeruginosa 感染实验方法。我们还报道了将该液体培养实验方法进行改进，以适用于革兰氏阳性病原菌 Enterococcus faecalis。与 P. aeruginosa 类似，E. faecalis 被越来越多地认定为一种严重的医院内感染威胁，其具备日益增多的抗菌耐药机制1。尽管已有适用于高通量筛选 E. faecalis 的先前方法14，但该方法需要预先感染病原体，这会使操作流程复杂化，并增加诸如 COPAS FlowSort 等设备被污染的风险。我们的实验方案无需预先感染步骤，从而提高了操作的安全性。最后，我们报道了一种将上述任一感染实验与喂食 RNAi 技术相结合的方法，使研究者能够筛选在感染建立过程或抗感染防御中发挥作用的宿主因子。

<table><tbody><tr><td>COPAS FP BioSorter</td><td>Union Biometrica</td><td></td><td>大型物体流式细胞仪/线虫分选仪</td></tr><tr><td>Cytation 5</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EL406 Washer Dispenser</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multitron Pro</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24孔深孔板</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CS15124</td><td></td></tr><tr><td>384孔板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>MPG-781091</td><td></td></tr><tr><td>线虫生长培养基（NGM）</td><td></td><td></td><td>每升用量：18克琼脂，3克NaCl，2.5克蛋白胨，1 mL CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;（1 M），1 mL MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;（1 M），25 mL磷酸盐缓冲液，以及973 mL milli-Q水</td></tr><tr><td>慢杀（SK）平板</td><td></td><td></td><td>每升用量：18克琼脂，3克NaCl，3.5克蛋白胨，1 mL CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;（1 M），1 mL MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;（1 M），25 mL磷酸盐缓冲液，以及973 mL milli-Q水</td></tr><tr><td>慢杀（SK）培养基</td><td></td><td></td><td>每升用量：&amp;nbsp;3克NaCl，3.5克蛋白胨，1 mL CaCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;（1 M），1 mL MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;（1 M），25 mL磷酸盐缓冲液，以及973 mL milli-Q水</td></tr><tr><td>LB培养基（Lysogeny Broth）</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>L1520</td><td></td></tr><tr><td>脑心浸液肉汤（BHI）</td><td>Research Products International Corp</td><td>50-488-526</td><td></td></tr><tr><td>线虫漂白液</td><td></td><td></td><td>每100 mL用量：10 mL 5 M NaOH溶液，20 mL 5%次氯酸钠溶液，以及70 mL无菌水</td></tr><tr><td>S基础培养基（S Basal）</td><td></td><td></td><td>每升用量：5.85克NaCl，6克KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，1克K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，以及1升milli-Q水</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>A0930</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>S5000</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>P3300</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>USBiological Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td></td><td></td><td>每升用量：132 mL K2HPO4（1 M）和868 mL KH2PO4（1 M）</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Acros Organics</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>P5100</td><td></td></tr><tr><td>5%次氯酸钠溶液</td><td>BICCA</td><td>7495.5-32</td><td></td></tr><tr><td>NaOH溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Breathe-easy</td><td>Diversified Biotech</td><td>BEM-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Orange核酸染料</td><td>Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细菌菌株&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;P. aeruginosa &lt;/em&gt;（PA14）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. faecalis&lt;/em&gt;（OG1RF）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;superfood（OP50）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;表达RNAi的细菌（HT115）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;线虫菌株&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;glp-4&lt;/em&gt;（&lt;em&gt;bn2&lt;/em&gt;）（Beanan和Strome，1992，PMID: 1289064）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PINK-1::GFP报告基因（Kang等，2018，PMID: 29532717）</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种高通量、高内涵、基于液体的 c. elegans 病理系统

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

通过传统的体外（in vitro）筛选方法发现的新药数量已逐渐减少，导致该方法在寻找应对多重耐药性的新武器方面成效降低。这促使研究者得出结论：不仅需要发现新的药物，更需要开发新的发现药物的方法。其中最具前景的候选方法之一是采用高通量、表型读数的全生物体体内（in vivo）检测，所用宿主范围从秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）到斑马鱼（Danio rerio）。这些宿主具有多种显著优势，包括可大幅减少假阳性结果；因为在初始筛选阶段，对宿主具有毒性或生物利用度差的化合物通常即被淘汰，从而避免后续昂贵的验证工作。
本文展示了我们的检测方法如何被用于研究已有充分记录的秀丽隐杆线虫（C. elegans）—铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）液体致死病理系统中宿主的变异。我们还演示了该成熟技术的若干拓展应用。例如，我们能够在24孔或96孔板体系中利用RNA干扰（RNAi）进行高通量遗传筛选，以探究该宿主-病原体相互作用中的宿主因子。通过该检测方法，全基因组范围的筛选仅需数月即可完成，这可显著简化药物靶点的鉴定工作，甚至无需繁琐的生化纯化手段。
我们还在此报告了本方法的一种改进版本，该版本使用革兰氏阳性菌Enterococcus faecalis替代革兰氏阴性病原菌P. aeruginosa。与P. aeruginosa类似，E. faecalis引起的杀伤作用也具有时间依赖性。与以往的C. elegans—E. faecalis检测方法不同，本方法检测E. faecalis时无需预先感染步骤，从而提高了安全性，并降低了液体处理设备被污染的风险。该检测方法具有高度稳健性，在感染后96小时可观察到约95%的死亡率。

影响检测性能的重要参数
正确理解该检测方法背后的生物学原理对于排除故障和优化实验至关重要。为此，我们首先参考了几篇阐明发病机制的关键论文 P. aeruginosa介导的液体中杀伤作用7,20. 只要遵循上述步骤（参见 图1 有关检测方案示意图，请参见）时间依赖性的杀伤作用 秀丽隐杆线虫 仅在病原体存在时才会被观察到（图2A）。相比之下，在缺乏关键营养补充剂的情况下（例如， 如果培养基中不添加蛋白胨，仅加入S基础盐溶液，则几乎观察不到杀灭作用（图2B）。有趣的是，两步孵育法 P. ...

本文介绍一种可灵活应用的全生物体高内涵筛选工具，可用于研究宿主与病原体之间的相互作用，并适用于药物发现。

一种高通量、高内涵、基于液体的 C. elegans 病理系统

通过传统体外筛选方法发现的新药数量已逐渐减少，降低了该方法在寻找新型治疗武器方面的成功率……

该方法可用于解答宿主与病原体相互作用及药物发现领域的问题，例如不同毒力因子的重要性，以及小分子化合物在抑制发病过程中的作用能力。该技术的主要优势在于其以液体形式进行，且所需体积较小。首先，在生物安全二级（BSL 2）生物安全柜内操作，将铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）从冻存菌种划线接种至LB琼脂平板上。将培养板在37摄氏度孵育16至24小时，然后将培养板在4摄氏度保存，最多可保存一周。在准备检测培养板前两天，从培养板上挑取单菌落，接种于3至5毫升无菌LB液体培养基中。在37摄氏度孵育培养物12至16小时。根据文本方案配制慢杀灭（SK）培养基后，取350毫升来自新鲜过夜LB培养物的铜绿假单胞菌（P. aeruginosa），接种至每个10厘米的SK平板。使用无菌涂布棒将细菌均匀涂布，并将平板置于生物安全柜中晾干。然后，将培养板在37摄氏度下孵育24小时。为了在24孔深孔板的单个孔中并行测试多种RNAi细菌菌株，从先前制备的含RNAi的细菌克隆中各挑取单个菌落，接种至4毫升添加了羧苄青霉素的LB培养基中。将培养板放入专为多孔板优化的摇床培养箱中，在37摄氏度、950 rpm条件下振荡培养16小时，随后在2,000 g离心5分钟收集细菌。通过将培养板倒置并用力振荡，弃去上清液。用 100 微升 S 基础培养基重悬 RNAi 细菌。将重悬的细菌用移液器加入含有 IPTG 和羧苄青霉素的多孔 NGM 培养板的适当孔中，并让培养板干燥。根据文本方案制备 L1 期线虫后，通过移液将约 5,000 条线虫接种到每个 10 厘米的培养板上，每个培养板预先接种 RNAi 细菌或 OP50 超级食物，以准备基础实验。进行RNAi筛选实验时，将约300条线虫移至接种了RNAi细菌的24孔板中，每孔加一条。若所用线虫品系在温度敏感条件下不育，则先在15摄氏度培养约16小时，随后转移至25摄氏度继续培养44小时，以完成发育并抑制胚胎形成。进行液体致死实验时，使用细胞刮从SK平板上刮下铜绿假单胞菌（P. aeruginosa），并将其重悬于约5毫升S. Basal溶液中。使用分光光度计测定细菌悬液在600 nm处的光密度（OD 600）。在S.Basal培养基中制备24毫升铜绿假单胞菌（P.Aeruginosa）稀释菌液，使其OD 600为0.9，然后加入21毫升液态SK培养基，使用多通道移液器将45微升菌液与培养基混合物转移至384孔板的每个孔中。将线虫从原培养体系中冲洗至50毫升锥形管中，并在重力作用下使其自然沉降。吸去上清液至5毫升，然后总共使用50毫升S.Basal重悬线虫，并重复洗涤两次。根据文本方案，使用线虫分选仪将约22条线虫分选至384孔板的每个孔中，然后用透气膜密封培养板，在25°C下孵育24至48小时。在预定时间，使用微孔板洗涤仪和S.Basal对384孔板总共洗涤5次。最容易犯的错误之一是在线虫完全沉降之前就吸取384孔板中的液体。准确判断线虫是否已完全沉降需要一定的经验。在最后一次洗涤后，将上清液吸除至剩余20 µL。然后，每孔加入 50 微升 98 微摩尔的核酸染料，使终浓度为 0.7 微摩尔。将培养板在室温下孵育 12 至 16 小时。在完成所需的孵育时间后，使用酶标洗板机至少洗涤培养板三次。使用分光光度计或自动化显微镜进行数据采集，以获取透射光和荧光图像。在含有300条线虫的24孔板的每个孔中加入1毫升S基础培养基。通过轻轻振荡培养板使线虫混匀，然后将线虫转移至一个空的、无菌的24深孔板中。让线虫在重力作用下自然沉降，约五分钟。吸除上清液，每孔保留约一毫升。然后向每孔加入7毫升S基础培养液。重复洗涤两次，最后一次洗涤后，吸除上清液，仅保留约400微升。为了避免细菌饥饿，将细菌移液至384孔板中，然后使用蠕虫分选仪的重取样功能，将22条蠕虫分选至每个384孔板的孔中。最后，在分选完成后，加入小分子或其他实验特异性材料。如本图所示，当按照本视频所述步骤操作时，仅在存在铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）的情况下，才会观察到秀丽隐杆线虫（C.elegans）的时间依赖性死亡现象。相比之下，若缺乏关键的细菌营养补充物，则几乎不会观察到杀灭作用。如图所示，铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）在37摄氏度孵育后转至25摄氏度孵育的两步法，对于传统的慢杀灭实验至关重要，最初在液体杀灭实验中被采用，但在本实验中并非必需。该方案可耐受较宽范围的初始细菌浓度，最低可至OD600等于0.025，仍能表现出时间和浓度依赖性的杀灭效果，尽管杀灭时间会有所偏移。此外，通常仅需四个孔即可获得具有统计学意义的数据。当信噪比较高时，处理方法的实用性如本例所示：分析过程简单，且区分阳性与阴性条件轻而易举。在这些情况下，即使微弱的信号也能被轻易识别。一旦掌握，该技术每块384孔板的操作时间约为60至75分钟（不包括分选时间）。在进行该操作时，必须注意将所有组分加入培养基中，否则毒力会受到影响。该检测方法简化了在宿主-病原体研究中将完整生物体表型筛选应用于药物发现的过程。观看本视频后，您应能充分掌握如何开展基于液体的秀丽隐杆线虫（C. elegans）病原性测定实验。该实验流程可通过替换其他病原体（例如用粪肠球菌 E. Faecalis 替代铜绿假单胞菌 P. Aeruginosa）进行调整，从而有助于探索其他细菌感染的治疗方法。请务必注意，操作铜绿假单胞菌（P. Aeruginosa）或粪肠球菌（E. Faecalis）等感染性细菌可能存在危险。进行此操作时，应始终采取适当的预防措施，例如接受正规培训、穿戴合适的个人防护装备以及采用正确的操作技术。

a-high-throughput-high-content-liquid-based-c-elegans-pathosystem

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科研

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Immunology and Infection

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自动化分析 秀丽隐杆线虫 使用 SegElegans 进行荧光成像

了解一种高通量、高含量的液态秀丽隐杆线虫病原体系统筛选方法，用于研究宿主与病原体相互作用及药物发现。该方法采用小体积液体格式，可高效评估毒力因子和小分子化合物的效果。

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