Демонстрация с множественной лекарственной устойчивостью Микобактерии туберкулеза Усиление микрочипов

Общая цель данного эксперимента заключается в генотипировании микробактерий туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью с использованием амплификационного микрочипа. Это достигается за счет проведения мультиплексной асимметричной ПЦР поверх микрочипа в одной микрофлюидной реакционной камере. Там образец одновременно амплифицируется, выбирается помеченный размер, делается одноцепочечным и гибридизуется с микрочипом.

Затем, после промывки микрочипа, считыватель показывает, присутствует ли микробактерия туберкулеза и содержит ли она мутацию ДНК, которая, как известно, придает устойчивость к рифампицину изо, ниязи этамбутолу или стрептомицину. Преимущество этого метода по сравнению с существующими методами линейного зонда на микрочипе или гибридизации нуклеиновых кислот заключается в том, что амплификационный микрочип значительно упрощает взаимодействие пользователя с испытуемым. Тем не менее, обеспечивая аналитическую чувствительность ПЦР и способность мультиплексирования микрочипа, для этой процедуры необходимо обеспечить чистое рабочее место, протертое дезинфицирующим раствором, и нуклеиновые кислоты, достаточно чистые для мультиплексной ПЦР.

После размораживания и смешивания всех исходных растворов соберите мастер-смесь для ПЦР. При приготовлении этой смеси приготовьте хотя бы один дополнительный объем смеси для показанного здесь теста на туберкулез. Также добавьте в мастер-смесь дополнительную Т-полимеразу.

В дополнение к количеству липких веществ, прилагаемых к исходным реактивам, смешайте один микролитр аликвот образца ДНК на 49 микролитров мастер-смеси. Осторожно добавьте по 48 микролитров каждой реакционной смеси в центр соответствующего микрочипа. Не прикасайтесь к самому микрочипу.

Затем тщательно накройте и запечатайте микрочип неправильно. Применение защитного стекла может привести к образованию пузырьков, которые могут привести к артефактам, испарению, плохой амплификации или неравномерной гибридизации. Любое из этих условий может привести к ошибочному результату.

Далее загрузите микроставку в термоамплификатор. Когда подложка прижата к нагревательному блоку, опция с подогревом крышки должна быть отключена. Для лабораторий, которые следуют универсальным мерам предосторожности ПЦР, более эффективно использовать несколько амплификационных микрочипов на предметное стекло и обрабатывать несколько тестов одновременно.

Теперь запустите соответствующую программу термоциклирования. Эта программа имеет 50 циклов амплификации, что может показаться высоким, но необходимым из-за преимущественно одноцепочечной популяции ампликонов, создаваемой реакцией. Когда реакция завершится, извлеките микрочипы и выключите термоамплификатор.

Осторожно откройте камеру микрочипа с помощью плоских щипцов и щипцов. Снимите крышку, крышку и прокладку. Микрочип может быть поврежден на этом этапе, поэтому будьте осторожны неправильно.

Снятие узла прокладки может привести к физическому повреждению микрочипа. Будьте осторожны, чтобы не согнуть и не сгибнуть защитное стекло, и будьте очень осторожны, чтобы не поцарапать поверхность микрочипа щипцами. Купайте субстраты в промывном буфере в течение 10 минут при комнатной температуре с легким помешиванием, после ванны с промывочным раствором сделайте еще два или три промывки, все в деионизированной воде.

Высушите микрочипы, прежде чем приступать к визуализации. Для этой цели в данной демонстрации можно использовать слабый поток сжатого воздуха, параметры которого специфичны для теста MDR TB и портативного тепловизора Econ DX 2100. Синий индикатор на тепловизоре указывает на то, что он готов.

Включите компьютер. Откройте системное программное обеспечение, предоставленное устройством, и подождите, пока программное обеспечение объявит о том, что оно установило соединение с камерой. Далее вставьте высушенный микрочип в тепловизор.

С микрочипом по направлению к линзе и от пользователя. Теперь программное обеспечение будет предоставлять изображение предварительного просмотра из выпадающего меню. Выберите сценарий анализа MDR TB.

Введите время воздействия от 100 до 500 миллисекунд. Будут считаться переэкспонированные пиксели. Отрегулируйте экспозицию, чтобы свести их к минимуму.

Если насыщенность настроена на минимизацию передержки, начните анализ. Программное обеспечение размещает сетку MDRT TB на изображениях, образцах и интенсивности фона, а затем сообщает о лекарственной устойчивости и результатах генотипирования. После завершения анализа и сохранения извлеките микросхему из имидж-сканера и начните новый сеанс анализа для анализа следующего массива.

Продолжите анализ для каждого из обработанных микрочипов. Сохранение данных каждый раз. Качественный анализ изображений может дать представление об источниках экспериментального шума или изменчивости, которые сложно выявить в таблицах данных, созданных программным обеспечением для автоматизированного анализа изображений.

Здесь виден высококачественный массив без артефактов. Несколько артефактов могут привести к появлению пузырей, которые создают ореолы. Несмотря на артефакты массива, программное обеспечение все равно будет извлекать значения из сканирования.

Алгоритм диагностических отчетов, несмотря на полученные значения, признал бы этот массив недействительным. На ПЦР-матрице микрочипа использовали серию разведения геномной ДНК дикого типа H 37 RA с массой 6,25 пикограмма, что эквивалентно 1 250 клеткам. Все щупы были обнаружены.

Значение SNR выше трех является положительным результатом, а зарегистрированные значения были намного выше. Затем были генотипированы референтные изоляты Всемирной организации здравоохранения. Однонуклеотидные полиморфизмы, присутствующие на матрице, были обнаружены в виде соответствующей мутации в геноме МЛУ ТБ.

Также было очевидно несколько примеров обнаружения мутаций у ближайших соседей. Обсуждение предусмотрено в текстовом протоколе. После освоения этот метод может быть выполнен примерно за три с половиной или шесть с половиной часов, в зависимости от концентрации ДНК, конкретного анализа, эффективности и однородности термоамплификатора, а также желаемой аналитической или клинической чувствительности и специфичности.

Кроме того, количество циклов амплификации и время гибридизации после амплификации могут быть легко сокращены или удлинены для получения желаемых эксплуатационных характеристик.