Чувствительности к антимикробным препаратам комплексного туберкулеза Mycobacterium для первого и второго ряда путем разведения в бульоне Формат планшет

Существует относительно небольшое количество препаратов для лечения микобактерий туберкулеза, поэтому устойчивость к любому препарату вызывает беспокойство. В этой видеостатье описана процедура тестирования устойчивости M. tuberculosis к антибиотикам одновременно к 12 различным микробным препаратам. Таким образом, способность быстро выявлять устойчивость к противомикробным препаратам M. tuberculosis очень важна в усилиях по контролю роста устойчивости штаммов Here для проверки чувствительности к антибиотикам.

М туберкулез сначала выращивают на твердых или в отварных средах, бактериальной суспензии. Посевной материал готовят и добавляют в микротитровую пластину, содержащую различные концентрации 12 препаратов, включая препараты первой линии и второй линии после инкубации. Степень роста в каждой скважине определяется либо вручную с помощью зеркальной коробки, либо с помощью полуавтоматического считывателя пластин.

Полученные данные указывают на минимальную ингибиторную концентрацию для каждого тестируемого препарата и показывают, к каким антибиотикам устойчив тестируемый штамм туберкулеза. Эти результаты помогают в выборе подходящего препарата для лечения туберкулеза. Здравствуйте, меня зовут Нэнси Эк, и я директор бактериологической лаборатории Myco в клинике Майо в Рочестере, штат Миннесота.

Сегодня мы опишем метод тестирования на чувствительность к антибиотикам микобактерий туберкулеза. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как разведение макробульона, заключается в том, что для каждого препарата определяется МПК и одновременно тестируются 12 антибиотиков. Демонстрировать процедуру будет Курт Джуд, специалист по качеству в моей лаборатории, работающий на лабораторном столе.

Подготовьтесь к этой процедуре, наклеив на агаровую пластину для крови, три пластины Миддлбрукса семь пластин H 10, трубку для стеклянных шариков с солевым раствором и микротитровую пластину с именем пациента и идентификационным номером образца. Кроме того, пометьте кровяной агар и семь пластин Н 10 как чистые. Отметьте одну из этих семи табличек H 10 как количество колоний один к одному, а другую как количество колоний от одного до 50.

Затем поместите лоток в проход. Затем подготовьтесь к работе на объекте биобезопасности третьего уровня BSL, надев прочный халат, перчатки-головные уборы, бахилы и респиратор. Здесь используется респиратор паппа.

Затем достаньте лоток из прохода. Далее на объекте BSL three продезинфицируйте поверхность шкафа биологической безопасности. Затем поместите бумажное полотенце, смоченное дезинфицирующим средством, внутрь капюшона, примерно в шести дюймах от вентиляционной панели рядом с бумажным полотенцем.

Поместите инокуляционные петли, пипетки и наконечники, подходящий контейнер для утилизации отходов, нефи, TER и вихрь. Как только капюшон будет подготовлен, поместите организм на бумажное полотенце вместе со стойкой с бульоном McFarland стандарта 0,5 A seven H Nine с OADC и трубкой с солевыми шариками. Такая установка делается из твердой, средней.

Приготовьте посевной материал из твердой среды культуры из образца пациента. С помощью стерильной петли соскребите колонии и перенесите их в трубку из стеклянных шариков с солевым раствором. Закрутите суспензию на 30 – 60 секунд.

Визуально осмотрите образец, сравнив его со стандартом McFarland. Перечисляемая сумма должна быть равна или больше стандартной. Если нет, добавьте больше бактериального образца и вортекса. Снова.

Как только стандарт Макфарланда будет совпадать, дайте инокулюму отстояться в течение 15 минут, чтобы дать возможность осесть более крупным скоплениям бактерий. Затем с помощью nefi TER измерьте плотность взвешенных бактерий до нуля. Нефитер.

Сначала поместите в нефоттер пустой шарик с солевым раствором. Нажмите кнопку калибровки, чтобы обнулить прибор, затем поместите стандарт McFarland 0,5 в нефитер и снова нажмите кнопку калибровки. После калибровки прибора извлеките стандарт McFarland и вставьте инокулянд.

Показания инокулята должны быть равны стандартным показаниям Макфарланда. Если показания слишком низкие, удалите трубку и перенесите больше бактерий с пластины. Затем вортекс и снова считайте образец.

Если показания слишком высокие, добавьте в трубку вихрь солевой раствор. Затем прочитайте образец еще раз. Продолжайте корректировать инокулюм по мере необходимости, пока концентрация бактерий не достигнет стандарта Макфарланда.

Затем с помощью пипетки объемом 200 микролитров и длинного наконечника пипетки, устойчивого к аэрозолям, удалите 100 микролитров инокулята из верхней трети пробирки. Чтобы избежать каких-либо комков, которые оседают на дно инокуляции, бульон Middlebrook seven H Nine медленно перебрасывает инокулированный бульон в течение 20 секунд, чтобы наложить инокулюм. Начните с извлечения микротитровальной пластины из упаковки производителя. Если влагопоглотитель синего цвета или упаковка из фольги повреждена, не используйте ее.

Планшет уже содержит 12 противомикробных препаратов, которые должны быть протестированы в каждой лунке, включая наиболее эффективные препараты первой линии и препараты второй линии. Осторожно влейте семь Н девять бульона инокулюма в трл, стараясь не образовывать аэрозоли. Затем поместите микротиттерную пластину этикеткой наружу, как показано здесь, и с помощью 12-канального пипеттера добавьте 100 микролитров инокулюма в каждую лунку.

Далее подготовьте тарелки для выполнения подсчета колоний. Во-первых, приготовьте неразбавленный планшет, перенеся петлю на один микролитр образца из положительной контрольной лунки на семь планшетов H 10, помеченных один к одному. Затем используйте петлю, чтобы протянуть пластину, как показано здесь.

Далее, чтобы приготовить разведение один к 50, перенесите петлю объемом в один микролитр из положительной контрольной лунки и закрутите ее в пробирку с 50 микролитрами водяной полосы. Один микролитр этого разбавления на тарелке с маркировкой один к 50. Инокулируйте планшеты чистоты пипетированием 50 микролитров инокулюма из trth на соответствующим образом маркированный кровяной агар и семь пластин H 10 и прорежьте для выделения.

Затем уложите еще один трт поверх привитых трт и аккуратно поместите их в контейнер для выброса. Поместите клейкую пломбу на пластину с микротитрованием. Затем, используя белую подложку, сильно надавите на каждую лунку, чтобы обеспечить достаточный потолок, гарантируя, что на нем нет складок.

Продезинфицируйте пластину микротитера, протерев ее бумажным полотенцем, смоченным в туберкулезном дезинфицирующем средстве. Затем поместите микротитровую пластину в полиэтиленовый пакет и закройте его термосваривателем. Наконец, продезинфицируйте все материалы, включая нефий, вихрь, пластины и трубки, протерев их туберкулезным дезинфицирующим средством.

Здесь профессиональный спрей используется по прошествии достаточного времени для обеспечения дезинфекции. 15 минут для профессионального спрея. Пластины обклеиваются скотчем, помещаются в полиэтиленовые пакеты, а запечатанные припасы вынимаются из шкафа биобезопасности и помещаются в проходной проход.

Выброшенный красный пакет закрывается и запечатывается завязкой, в этот момент снимается халат, пинетки и перчатки. После того, как вы пройдете в прихожую и помоете руки, снимите респиратор и продезинфицируйте его, а после повторного мытья рук уберите на хранение, наденьте свежий халат и покиньте трехкомнатный люкс BSL. Далее контейнер для сбора отходов подвергается автоклавированию.

После этого инкубируйте микротитровую пластину и семь пластин H 10 и кровавого шнека правой стороной вверх в инкубаторе при температуре от 35 до 37 градусов Цельсия с 5-10% CO2 в двух лабораториях BSL. Это приемлемо, потому что планшет хорошо запечатан и находится в пластиковом пакете, время генерации микобактерий туберкулеза составляет примерно от 12 до 24 часов, поэтому пройдет не менее недели, прежде чем рост можно будет увидеть как образование клеточной гранулы в нижней части контроля. Что ж, на 10-й день выполните ручное считывание зеркала, поместив герметичное лезвие микротиттера ST на платформу зеркальной коробки.

Используйте настольную лампу, чтобы визуализировать рост, регулируйте рост по мере необходимости, чтобы получить наилучший контраст. Проверьте лунки для контроля роста в данном случае Н 11 и Н 12, посмотрев в зеркало. Если есть рост, колодец будет казаться мутным или иметь осадок, как показано здесь.

Если роста нет, как показано в этом примере, скважина будет казаться чистой. В этом случае поместите планшет обратно в инкубатор и продолжайте инкубацию до 21 дня. Для каждого условия сравните рост с контролем.

Ну и тогда, по каждому препарату рекорд, первое разведение, которое не имеет роста. Это минимальная ингибиторная концентрация или MIC для исследования результатов препарата с использованием автоматического считывателя планшетов, такого как vision, начинается с открытия программного обеспечения Myco TB a ST plate и регистрации на месте запечатанной пластины штрих-кодом наружу. Как показано на рисунке, рост проявляется в виде помутнения или отложения клеток на дне лунки на экране компьютера.

Во-первых, изучите средства контроля роста. По-прежнему. Если это отрицательно для роста, поместите пластину обратно в инкубатор на срок до 21 дня.

Если он положительный, запишите результаты, прикоснувшись к первой лунке, которая не показывает роста на экране для каждого препарата. В некоторых случаях на дно колодца выпадают бактерии, осадок или лекарства. Это явление, известное как трейлинг, проявляется в нескольких скважинах с окатышами одинакового размера и на самом деле не считается положительным приростом.

Затем исследуются семь пластин H 10 и кровяной агар для определения концентрации бактерий и оценки чистоты. Кровяная агаровая пластинка не должна иметь роста через 48 часов. Нарост на кровяной агаровой пластине свидетельствует о загрязнении быстро растущими бактериями.

Если есть рост, тест на микротитр необходимо повторить. На семи пластинах чистоты H 10 должен расти один организм. Туберкулез типа ЭМ должен выглядеть охристым, окрашенным, морщинистым и шероховатым В случае загрязнения тест на микротитр необходимо повторить из чистой культуры.

Чтобы оценить концентрацию бактерий, подсчитайте колонии на семи планшетах H10. Затем с помощью таблицы в сопроводительном письменном документе подсчитайте количество колоний. Mycobacterium tuberculosis была выращена из образца пациента и устойчивость к антибиотикам была оценена, как описано в этом видео на приведенной здесь пластине, 12 различных препаратов присутствуют в возрастающих концентрациях с самыми высокими концентрациями вверху и самыми низкими концентрациями внизу.

Минимальная ингибиторная концентрация, или MIC препарата, указывалась самой низкой концентрацией препарата, которая не показала никакого роста и обведена на изображении, показанном здесь, с использованием стандартизированных точек разрыва, установленных Институтом клинических и лабораторных стандартов. Приведенные здесь данные свидетельствуют о том, что этот штамм туберкулеза будет устойчив к Isid и Rifampin. In vitro высокие микрофоны, наблюдаемые в нескольких других препаратах, включая оин, моксифлоксацин, стрептомицин и рифабутин, свидетельствуют об устойчивости штамма туберкулеза ЭМ к этим агентам.

Результаты MIC должны быть использованы специалистом по инфекционным заболеваниям, имеющим опыт лечения туберкулеза, для разработки индивидуального плана лечения. Пытаясь провести эту процедуру, важно помнить, что это респираторный патоген, и как только вы начнете генерировать аэрозоли, после просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как настроить микобактерию туберкулеза, тестирование на чувствительность к противомикробным препаратам с использованием метода микроразведения бульона. Не забывайте, что работа с микобактериями туберкулеза может быть чрезвычайно опасной, и меры предосторожности, такие как защита органов дыхания, всегда должны приниматься там, где это необходимо.