一个协议，用于分析丙型肝炎病毒复制
2014年6月26日
丙型肝炎病毒 （HCV） 是一种主要的人类病原体，可导致肝硬化和癌症等肝脏疾病。HCV 感染性细胞培养系统对于了解 HCV 复制的分子机制和开发新的治疗方法至关重要。在这里，我们描述了一种研究 HCV 复制周期各个阶段的协议。
该程序的总体目标是研究丙型肝炎病毒复制周期的各个阶段。这是通过首先生成 HCV 基因组 RNA（线性化 HCV 质粒构建体的转录本）来实现的。第二步是用 H-C-V-R-N-A 转染细胞。
接下来，将细胞接种用于各种时间点和测定。最后一步是收集细胞培养上清液以测量病毒滴度并收获转染细胞的蛋白质和 RNA。最终进行逆转录、PCR Western blotting 免疫荧光测定和 HCV 滴度检测，并证明强大的 HCV 感染细胞培养系统。
与 HCV 复制系统相比，这种传染性丙型肝炎病毒细胞培养系统的主要优势在于可以研究病毒进入、病毒组装和出口步骤。该协议可以帮助回答丙型肝炎病毒学领域的关键问题，例如 Vion、形态发生和宿主病原体相互作用。这项技术的影响延伸到疫苗开发，因为它允许对可以作为潜在候选疫苗进行评估的减毒病毒株进行表征。
虽然这种方法可以提供对丙型肝炎病毒的见解，但它也可以应用于 lab verde 家族中的其他 RNA 病毒。通常，刚接触这种方法的人将面临生成高质量 HCV 基因组 RNA 研究的挑战。在发现基因型 2 A HCV 日本暴发性一型肝炎分离株后，HCV 的完整复制周期在细胞培养中变得可行。
病毒学检测的视觉演示至关重要，因为该检测需要分子和细胞技术方面的专业知识 使用基因内两种 A 嵌合病毒 F-N-X-H-C-V 和 F-N-X-H-C-V 轮询无效 HCV 来评估病毒复制。通过在 2 毫升试管中用 XBA 一种限制性内切酶消化来线性化先前生成的病毒质粒。然后用绿豆核酸酶处理质粒以产生平末端。
通过阴离子交换层析纯化消化的质粒。通过对 DNA 进行 AROS 凝胶电泳来验证线性化质粒的完整性。接下来，将线性化质粒 DNA 模板添加到含有 T 7 RNA 聚合酶反应组分的 0.2 毫升试管中，以合成 HCV 基因组 RNA 转录物。
使用 RNA 纯化试剂盒纯化新合成的 DNA 处理的 RNA。然后通过 Agros 凝胶电泳验证 RNA 的产生。在此之后，通过光谱光度法定量 RNA。
使用胰蛋白酶处理分离基于 胡 7 的贴壁细胞，并将细胞收集到 50 毫升锥形瓶中。2 次离心复苏。用低温低血清培养基悬浮细胞沉淀重复离心后，将细胞以 10 倍/mL 的速度重悬于低血清培养基中，至每毫升 7 个细胞。
接下来，将总共 10 微克转录的病毒 RNA 与 400 微升重悬的细胞混合到预冷的 0.4 厘米电穿孔兽医中，使用 270 伏特、100 欧姆和 950 微费雷斯的电穿孔将病毒 RNA 递送到细胞中。完成后，此时将电穿孔细胞重悬于含 15% FBS 的 10 毫升完全生长培养基中，将细胞以约 1.2 倍的倍数接种在两个 T 25 培养瓶中，每个培养瓶的 6 个细胞接种 10 个细胞，将 48 孔板接种在每孔 4、48 和 96 个细胞的温度下。转染后 4 至 8 小时，用新鲜添加的 10% FBS 生长培养基更换培养基，以去除培养瓶和培养板中的死细胞碎片。
使用血清移液管，在 48 N 96 小时时间点收获细胞培养上清液，放入 15 mL 锥形管中。然后离心后，在 4 摄氏度下以 15， 000 RPM 离心 10 分钟，从收集的样品中去除细胞碎片。将无细胞上清液储存在负 80 摄氏度。
在指定的时间点通过蛋白质印迹和逆转录定量 PCR 或 R-T-Q-P-C-R 裂解细胞以进行蛋白质和 RNA 分析。使用逆转录酶和 HCV 正义链的特异性引物逆转录 1 微克总细胞 RNA，该引物与 0.2 毫升试管中的五个主要非翻译区结合。此外，使用实时 PCR 系统的 HCV 正义链引物逆转录已知基因组拷贝的 F-N-X-H-C-V-R-N-A。
通过使用 50 ng得到的转录 CD NA 进行 QPCR，使用特异性 HCV 引物和含有 QPCR 超级混合物的 DNA 结合绿色染料。运行 QPCR 时，使用以下条件确定 QPCR 之后的 H-C-V-R-N-A 拷贝数。从 96 小时转染的病毒 RNA 中分离细胞裂解物。
使用 SDS 页面进行转染后。然后通过 trans plot turbo 方法将凝胶中分离的蛋白质转移到多藤二氟化物膜上。使用含有 5% 脱脂牛奶和 0.2%吐温 20 的 PBS 溶液封闭膜，并置于容器中。
在 4 摄氏度的冷藏室中，将膜与小鼠一抗单克隆抗体和 S3 以 1：1000 的稀释度和 1：5， 000 稀释的 β 肌动蛋白孵育。孵育后，加入与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠免疫球蛋白 G，以 5： 000 的比例稀释，并通过化学发光检测。此时，使用甲醇在负 20 摄氏度下固定 H-C-V-R-N-A 转染的细胞 30 分钟，用于免疫荧光测定。
完成后，用 PB S3 洗涤细胞，用免疫荧光测定封闭缓冲液封闭后，使用兔多克隆抗 NS 五一抗和小鼠单克隆抗 DS RNA 抗体 J 二，稀释度为 1 至 200，并在 4 摄氏度的冷藏室中孵育 5 小时至过夜。孵育后，在一抗后用 PB S3 洗涤细胞 6 次。然后以 1：1000 的稀释度加入山羊抗兔免疫球蛋白 G 4 8 8 多克隆二抗和山羊抗缪斯免疫球蛋白 5 9 4 多克隆二抗，并在室温下在台式摇床上孵育 1 小时。
用 PB S3 洗涤细胞后，使用 herx die 对细胞核进行染色，并使用荧光显微镜观察。接下来板幼稚色调，7.5 个 0.1 细胞以大约 3 倍 10 到第三个细胞/孔。第二天使用 96 孔板，使用生长培养基对从 H-C-V-R-N-A 转染细胞中收获的无细胞培养上清液进行 10 倍连续稀释，并一式三份接种到 Hue 上。
7.5 0.1 个细胞 感染后 72 小时，使用甲醇在零下 20 摄氏度下固定细胞 30 分钟，然后从冰箱中取出细胞 H-C-V-N-S 五 A 蛋白氨基染色剂，使用荧光显微镜进行染色。在病毒稀释度最高的孔中计数 NS 5，A 阳性细胞病灶，并计算每毫升病灶形成单位的平均数量。通过凝胶电泳评估线性化 HCV 质粒质量。
H-C-V-D-N-A 经受 T 7 RNA 聚合酶介导的体外转录，产生 9.6 Kilobase 的单个 RNA 产物。R-T-Q-P-C-R 结果表明，野生型病毒有效地复制了基因组。与轮询无效病毒相比，野生型表现出 1 到 3 个对数级的基因组复制水平。
野生型病毒产生参与病毒蛋白切割和基因组复制的 NS 3 蛋白。野生型病毒还表达 NS 5 a 蛋白和 NS 5 a 蛋白，双链 RNA 共定位于野生型转染细胞的细胞质中，表明活跃的病毒复制病毒滴度测量表明野生型病毒具有传染性，并在转染后 6 小时内每毫升感染性颗粒产生超过 10， 000 个病灶形成单位。野生型和 pole null 病毒具有相似的荧光素酶活性，表明转染的输入水平相似。
然而，RNA 在转染后 48 小时和 96 小时被翻译。与轮询无效病毒相比，野生型病毒表现出更高的基因组复制水平。野生型病毒还产生病毒 NS 3 蛋白。
poll null 病毒具有碱基水平的荧光素酶活性，而野生型病毒的复制水平比 poll null reporter 病毒高 2 到 3 个对数级。一旦掌握 乙型肝炎病毒学检测，如果执行得当，可以在两周内完成 在尝试此程序时，拥有强大的细胞和高质量的 HCV 基因组 RNA 转录本非常重要。按照此程序，可以在动物模型系统中测试表征 HCV 菌株，以研究体内适应性和宿主病原体的相互作用。
传染性 HCV 细胞培养系统的开发为研究人员探索 HCV 复制周期的病毒粒子、形态发生和病毒出口步骤铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何进行各种病毒学检测以表征丙型肝炎病毒复制周期的不同阶段有很好的了解。不要忘记，与丙型肝炎病毒一起工作可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取安全预防措施，例如佩戴适当的个人防护设备。
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概述
本文介绍了一种用于研究丙型肝炎病毒（HCV）复制周期各个阶段的协议。该研究概述了HCV基因组RNA的生成以及随后的细胞转染，以建立一个具有感染性的细胞培养系统。
关键研究组成部分
科学领域
- 病毒学
- 细胞生物学
- 传染病学
背景
- HCV是一种主要的人类病原体，会引起肝脏疾病。
- 了解HCV复制对开发新的治疗方法至关重要。
- 具有感染性的细胞培养系统对研究HCV至关重要。
- 该协议旨在阐明HCV复制的分子机制。
研究目的
- 从质粒构建中生成HCV基因组RNA。
- 用HCV RNA转染细胞以进行复制研究。
- 测量病毒滴度并分析转染细胞中的蛋白质和RNA。
使用的方法
- 从线性化质粒中生成HCV基因组RNA。
- 用HCV RNA转染细胞。
- 为时间点测定平板细胞。
- 收集上清液以测量病毒滴度，并收集细胞以进行进一步分析。
主要结果
- 成功建立了HCV具有感染性的细胞培养系统。
- 通过各种测定展示了强大的病毒复制。
- 应用逆转录、PCR和Western blotting技术。
- 免疫荧光测定确认转染细胞中HCV的存在。
结论
- 该协议提供了一种研究HCV复制的可靠方法。
- 它促进了开发针对HCV的治疗策略。
- 未来的研究可以在这个基础工作的基础上探索HCV生物学。
常见问题
Executive Industry Relevance
Robust analysis of Hepatitis C virus (HCV) replication in cell culture enables mechanistic de-risking and target validation for antiviral discovery. This protocol supports predictive confidence in early-stage screening by quantifying viral genome replication, protein expression, and infectious particle production. The approach is foundational for portfolio decisions in HCV therapeutic and vaccine R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of HCV replication mechanisms and host-pathogen interactions.
- Supports functional validation of viral targets such as NS3 and NS5A proteins.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing replication-competent from defective viral constructs.
- Provides quantitative benchmarks for triaging candidate molecules or viral strains.
Screening & Assay Development
- Establishes a validated HCV cell culture system for downstream compound screening.
- Delivers reproducible, quantitative outputs via RT-qPCR, luciferase assays, and viral titer measurements.
- Enables standardization of assay conditions for cross-study comparability.
- Supports scalable workflows for evaluating antiviral efficacy and viral fitness.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro replication data with in vivo model selection for translational continuity.
- Enables characterization of attenuated viral strains for vaccine candidate evaluation.
- Supports risk-adjusted advancement of leads based on infectious particle production and protein expression profiles.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol bridges early discovery, assay development, and translational research by providing a unified system for HCV replication analysis.
- Discovery Biology: Quantitative RT-PCR and immunofluorescence clarify viral replication dynamics and target engagement.
- Screening: Luciferase and titer assays enable reproducible, high-throughput evaluation of antiviral candidates.
- Analytics: Multiplexed readouts (RNA, protein, infectivity) support robust statistical comparisons across conditions.
- Translational Research: Infectious particle quantification informs preclinical model selection and vaccine feasibility.
- Enterprise Reuse: The cell culture system and associated assays are adaptable for other Flaviviridae RNA viruses.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in HCV target validation.
- Operational Value: Standardizes workflows for reproducibility and scalability across R&D teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation in antiviral and vaccine pipelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of HCV candidates based on quantitative replication and infectivity data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular virology, cell culture, and quantitative assay execution.
- Demands access to specialized instrumentation for RT-qPCR, Western blotting, and fluorescence microscopy.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of assay protocols and data analysis.
- Adaptable to other RNA viruses with protocol modifications supported by the system.
- Dependent on high-quality viral RNA and robust cell lines for reproducible results.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:06
In Vitro HCV RNA Transcription
5:42
RT-qPCR for Assessing HCV Genome Copies and Western Blot Analysis for Detecting HCV Protein Expression
7:31
Immunofluorescence Assay
9:56
Results: Analysis of Hepatitis C Virus Replication
11:50
Conclusion
3:24
HCV RNA Transfection and Sample Collection
8:52
Measuring Virus Titer
