Name: 一个协议，用于分析丙型肝炎病毒复制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: 学习丙型肝炎病毒复制周期的研究方法，通过体外转录生成HCV基因组RNA并进行细胞转染，建立感染性细胞培养系统。该方案结合逆转录PCR、蛋白质印迹和免疫荧光技术，为病毒学和肝病研究提供可靠工具。

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我们感谢 F. Chisari 提供 Huh-7.5.1 细胞系。我们感谢 Justine Ho 对手稿的编辑。本研究得到了 Cedars-Sinai 医学中心机构项目研究奖和美国国立卫生研究院转化科学促进中心（资助号 UL1TR000124）对 V.A. 的资助支持。

该实验方案的总体流程如图&#160;1所示。
1. 细胞
<ol>
	<li>配制完全培养基，其中包含10-15%胎牛血清（FBS）、10 mM非必需氨基酸、10 mM Hepes、青霉素（100单位/毫升）、链霉素（100毫克/毫升）和2 mM L-谷氨酰胺。</li>
	<li>维持 Huh-7.5.1 细胞13 在含有上述添加剂的完全生长培养基中 体外 丙型肝炎病毒复制周期的分析</li>
	<li>在37 °C、5% CO₂条件下，使用指定的添加补剂的生长培养基在Huh-7.5.1细胞中培养病毒株2.</li>
</ol>
2. 病毒与质粒构建
<ol>
	<li>将HCV RNA逆转录为互补DNA（cDNA）形式，并将其克隆至质粒载体中，以便于遗传操作。注：日本暴发性肝炎1型（JFH-1，基因型2a HCV）分离株的发现对HCV研究至关重要，目前主要用于研究HCV的复制周期11-13。基于JFH-1 HCV构建的种间和种内嵌合病毒在研究中被广泛使用14-18。此前已有报道合成种内基因型2a嵌合病毒FNX-HCV及单顺反子嵌合报告病毒株的构建方法19，其具体构建细节不在本实验方案的讨论范围内。</li>
	<li>使用pFNX-HCV种内基因型2a病毒，因其包含J6CF亲本株（NCBI登录号 AF177036）的5'非翻译区（5'NTR）、结构区和p7，以及NS2非结构区的一部分（核苷酸1至2878），同时也包含JFH-1病毒株（NCBI登录号 AB047639）的非结构区组分。注：FNX-HCV是基于此前报道的Jc1种内基因型2a嵌合HCV序列合成的15。</li>
	<li>以pFNX-HCV病毒株（如上步骤2.2所述）为基础，通过在5' NTR与核心基因之间（核苷酸388与389之间）插入Renilla荧光素酶基因，构建单顺反子嵌合报告病毒载体pFNX-Rluc。随后，使用口蹄疫病毒2A（F2A）肽序列连接该载体中的荧光素酶基因与核心基因，该序列可作为切割信号发挥作用。</li>
	<li>以pFNX-HCV或pFNX-Rluc病毒背景为基础，构建RNA聚合酶缺失（Pol-）的病毒载体。将上述任一病毒骨架中NS5B聚合酶的催化残基GDD（氨基酸2759-2761；核苷酸8615-8623）替换为AAG氨基酸残基。</li>
</ol>
3. 体外 HCV RNA 转录
<ol>
	<li>使用基因型2a的嵌合病毒FNX-HCV及FNX-HCV聚合酶缺陷型（Pol-）HCV评估病毒复制（图&#160;2A）。</li>
	<li>用XbaI限制性内切酶对病毒质粒进行线性化，随后用绿豆芽核酸酶处理以产生平末端。通过阴离子交换色谱法纯化消化后的质粒。通过琼脂糖凝胶电泳检测线性质粒的完整性（图&#160;2B）。</li>
	<li>使用T7 RNA聚合酶对线性质粒进行体外转录。</li>
	<li>使用RNA纯化试剂盒纯化新合成的经DNase处理的RNA。</li>
	<li>通过琼脂糖凝胶电泳验证RNA的生成（图&#160;2C）。</li>
	<li>通过分光光度法对RNA进行定量。</li>
	<li>将制备的RNA以10 μg的工作分装量保存于-80 °C。注意：为尽量减少实验设计中RNA质量的差异，应同时转录每种病毒样本及对照组的所有RNA。</li>
</ol>
4. HCV RNA 转染与样品采集
<ol>
	<li>使用胰蛋白酶消化收集 Huh-7.5.1 细胞。</li>
	<li>为洗涤细胞，将细胞悬液用冷的低血清培养基重悬后，离心，并重复洗涤两次。最后将细胞重悬于低血清培养基中，浓度为 1 × 107 个细胞/毫升。</li>
	<li>将总共 10 μg 体外转录的病毒 RNA 与 400 μl 重悬的细胞（4 × 106 个细胞）混合，加入 0.4 cm 电穿孔比色皿中。采用 270 V、100 Ω 和 950 μF 的参数进行电穿孔转染。</li>
	<li>将电穿孔后的细胞重悬于 10 ml 含 15% 胎牛血清（FBS）的完全生长培养基中。注意：当 Huh-7.5.1 细胞在含 15% 胎牛血清的培养基中培养时，电穿孔后细胞的存活率更高。</li>
	<li>在以下各时间点（4、48 和 96 小时），将细胞分别接种至 T-25 培养瓶（约每瓶 1.2 × 106 个细胞）和 48 孔板（每孔 1 × 104 个细胞）中。</li>
	<li>转染后 4–8 小时更换培养基，使用含 10% FBS 的新鲜补充培养基，以去除培养瓶和培养板中的死亡细胞碎片。</li>
	<li>在 48 和 96 小时时间点收集细胞培养上清液，并在 4 ºC 条件下以 1,500 rpm 离心 10 分钟，去除样品中的细胞碎片。</li>
	<li>将去除了细胞的上清液储存于 -80 ºC。在指定时间点裂解细胞，用于后续蛋白质和 RNA 的分析，包括 Western blot 和逆转录定量 PCR。</li>
</ol>
5. 用于评估HCV基因组拷贝数的逆转录定量PCR（RT-qPCR）
<ol>
	<li>采用两步法RT-qPCR检测HCV基因组RNA拷贝数。</li>
	<li>使用逆转录酶和特异性针对HCV正义链的引物（该引物结合于5'NTR区，序列：5’CCTATCAGGCAGTACCACA-3’）对1 μg总细胞RNA进行逆转录；同时使用针对看家基因肽基脯氨酰异构酶G（PPIG）的特异性引物（PPIG R：5’-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3’）进行逆转录。此外，使用HCV正义链引物对已知基因组拷贝数（101至109拷贝标准品）的FNX-HCV RNA（在步骤3中制备）进行逆转录。</li>
	<li>取50 ng逆转录所得cDNA，使用特异性HCV引物（JFH RTQ F：5’CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3’；JFH RTQ R：5’CCTATCAGGCAGTACCACA-3’）及含DNA结合绿色染料的qPCR超混合液进行qPCR扩增。同时对看家基因PPIG进行qPCR扩增（引物PPIG F：5’-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3’；PPIG R：5’-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3’）。注意：为准确计算各样本中细胞内HCV RNA水平，需以细胞看家基因PPIG的表达水平（Ct值）作为标准化依据，并以FNX-HCV基因组的拷贝数作为拷贝数测定的标准曲线。</li>
	<li>进行qPCR检测HCV RNA拷贝数时，采用以下反应条件：95 ºC预变性15秒，60&#160;ºC退火延伸30秒，共40个循环，使用实时荧光定量PCR系统。</li>
	<li>参见图3A和图3B中的基因组复制结果。</li>
</ol>
6. 检测HCV蛋白表达的蛋白质印迹分析（图3C）
<ol>
	<li>使用转染后96小时的病毒RNA转染细胞裂解液进行蛋白质免疫印迹分析。</li>
	<li>采用SDS-PAGE分离细胞裂解液，并将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。</li>
	<li>使用含5%脱脂奶粉、0.2% Tween 20的磷酸盐缓冲液（PBS）封闭膜。</li>
	<li>将膜与一抗小鼠单克隆抗体NS3（1:1,000稀释）和β-actin（1:5,000稀释）孵育。</li>
	<li>加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（1:5,000稀释），通过化学发光法检测信号。</li>
</ol>
7. 免疫荧光检测（IFA）
<ol>
	<li>使用甲醇在 -20 ºC 下固定 HCV 感染和转染的细胞 30 分钟，用于免疫荧光检测。</li>
	<li>用 PBS 洗涤细胞三次，并用 IFA 封闭缓冲液进行封闭。</li>
	<li>使用兔多克隆抗 NS5A 一抗（由加州大学洛杉矶分校 Dr. Dasgupta 惠赠）或小鼠单克隆抗 dsRNA 抗体 J2，按 1:200 稀释（1 μg/ml），在 4 ºC 下孵育 5 小时至过夜。</li>
	<li>一抗孵育后，用 PBS 洗涤细胞三次。</li>
	<li>加入 1:1,000 稀释（1 μg/ml）的 goat anti-rabbit IgG-488 多克隆二抗或 goat anti-mouse IgG-594 多克隆二抗，在室温下孵育 1 小时。</li>
	<li>用 PBS 洗涤细胞三次，使用 Hoechst 染料对细胞核染色，并用荧光显微镜观察（图&#160;3D）。</li>
</ol>
8. 测定病毒滴度
<ol>
	<li>使用96孔板，以每孔约3 × 103个细胞的密度接种未处理的Huh-7.5.1细胞。次日，用生长培养基对转染HCV RNA的细胞所收获的无细胞培养上清液进行10倍系列稀释，并将各稀释度以三复孔方式接种至Huh-7.5.1细胞。</li>
	<li>感染后72&#160;小时，用甲醇（-20 ºC下作用30分钟）固定细胞，并按照第7节所述方法对HCV NS5A蛋白进行免疫染色。</li>
	<li>选择最高稀释度计数NS5A阳性病灶，计算每毫升中平均焦点形成单位（FFU）数量。HCV滴度测定结果参见图&#160;4。</li>
</ol>
9. 用于病毒基因组复制与感染性的Renilla荧光素酶报告基因检测
<ol>
	<li>为评估病毒基因组复制，将转染HCV RNA的Huh-7.5.1细胞以每孔1 × 104个细胞的密度接种于48孔板中，每组设三个重复孔。</li>
	<li>在转染后6小时、48小时和96小时，用75 μl被动裂解缓冲液裂解细胞。</li>
	<li>室温下轻柔振荡孵育15分钟，随后将样品保存于-80 ºC。</li>
	<li>为检测Renilla荧光素酶的酶活性，将蛋白裂解液和Renilla荧光素酶检测试剂解冻至室温。</li>
	<li>每孔取20 μl蛋白裂解液加入96孔白色发光检测板中，并将该板放入化学发光仪中。</li>
	<li>每孔加入100 μl Renilla荧光素酶检测试剂（腔肠素底物 + 缓冲液），在预读2秒延迟后，积分采集发光信号10秒。</li>
	<li>根据生物学重复三次的荧光素酶检测值计算各样本的平均值和标准差，并对数据进行统计学分析（图&#160;5）。</li>
	<li>为评估感染性，将HCV RNA转染细胞在指定时间点（48小时和96小时）收集的无细胞上清液各500 μl，分别以三个重复孔接种至48孔板中的 naïve Huh-7.5.1 细胞。</li>
	<li>感染后6&#160;小时，每孔更换为500 μl新鲜培养基。</li>
	<li>在感染后48小时裂解细胞，并按照步骤8.2至8.7所述方法进行Renilla荧光素酶检测（图&#160;5）。</li>
</ol>
10. 统计分析
<ol>
	<li>图中的误差线表示标准差（SD）。P 值通过非配对 t 检验计算得出。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本图示描述了一种分析丙型肝炎病毒（HCV）复制周期的方法。HCV 是一种人类病原体，必须严格遵守规定的生物安全操作规程。此前已有文献报道过具有感染性的 HCV 细胞培养系统11-13,16,17。在执行本图示所示方案时，我们实施了几个关键步骤。首先，获得高质量、完整全长的病毒基因组 RNA 对后续研究至关重要。携带病毒 cDNA 的输入质粒必须经过仔细的线性化和末端钝化处理。XbaI 酶切后产生的突出末端使用绿豆芽苗核酸酶进行钝化，该酶为非特异性核酸酶，若孵育时间过长，将导致病毒基因组 3’ 端受损或降解。在指定的 30 分钟孵育结束后，必须立即通过苯酚-氯仿抽提或阴离子交换柱纯化去除该核酸酶。不建议对经核酸酶处理的 DNA 进行凝胶回收，因为在凝胶电泳过程中该酶仍具有活性。
对于后续 体外 RNA转录步骤通常还需采取广谱预防措施以尽量减少核糖核酸酶（RNase）污染。所有使用的试剂和材料均应无RNase。为获得高质量、RNA链断裂最少的基因组RNA，在纯化及后续操作过程中应尽量减少物理应力，避免剧烈涡旋和反复移液。RNA转...

丙型肝炎病毒（HCV）可导致肝硬化和肝癌。全球约有1.7亿人感染该病毒，每年约有35万人因此死亡1-3。HCV是一种正义单链RNA病毒，基因组大小为9.6 kb。HCV基因组被翻译成一个约含3,000个氨基酸残基的单一大分子多聚蛋白，随后由多种宿主细胞和病毒自身的蛋白酶进行蛋白水解切割，生成10种多肽。HCV是丙型肝炎病毒属（Hepacivirus）的代表病毒，属于黄病毒科（Flaviviridae）4。感染后，HCV在80%的个体中会建立慢性感染。该感染大多无明显症状，及时诊断有助于采取治疗措施以防止肝脏功能恶化。目前的治疗方法尚不理想，且尚无可用疫苗5,6。
丙型肝炎的病因最早于1989年被描述7。研究丙型肝炎病毒（HCV）的复制对于丙型肝炎疫苗和治疗研究具有重要意义，但长期以来由于缺乏高效的病毒培养系统而受到阻碍。已有研究表明，HCV的分子克隆在经肝内接种后可在黑猩猩中引发感染8。随后，研究人员构建了HCV亚基因组复制子，使得在细胞培养系统中解析病毒基因组复制阶段成为可能9,10。能够感染细胞培养物的基因型2a HCV分离株JFH-1（Japanese Fulminant hepatitis-1）的发现，为HCV复制研究开辟了新的途径11-13。目前已有基于基因型2a JFH-1株的基因间和基因内嵌合病毒，以及基于基因型1 HCV的感染性培养系统14-18。
我们已成功利用 JFH-1 毒株及HCV 2a基因型内嵌合病毒，获得了病毒蛋白结构域及cis-作用RNA元件的高分辨率功能图谱19,20。基于此，本文介绍了一种常规使用的高效培养系统，可用于研究HCV复制周期的各个阶段以及宿主与病原体之间的相互作用。我们展示了用于评估HCV 2a基因型内病毒基因组复制能力及de novo感染性的病毒学检测方法，以及基于Renilla荧光素酶报告系统的HCV检测方法。

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle&amp;rsquo;s 培养基（DMEM）</td><td>费舍尔科技公司</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>费舍尔科技公司</td><td>MT25025CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>生命技术公司</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>生命技术公司</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM 低血清培养基，无酚红</td><td>生命技术公司</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>Huh-7.5.1</td><td>斯克里普斯研究所</td><td></td><td>该细胞系由 Francis Chisari 博士在斯克里普斯研究所与中国塞达斯西奈医学中心签署的 MTA 协议下，慷慨提供给 Arumugaswami 博士</td></tr><tr><td>质粒（pFNX-HCV、pFNX-HCV Pol null、pFNX-Rluc 和 pFNX-Rluc Pol null）&amp;nbsp;</td><td>塞达斯西奈医学中心</td><td></td><td>HCV 质粒由 Arumugaswami 博士使用重叠寡核苷酸合成。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>新英格兰生物实验室公司</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>绿豆芽核酸酶</td><td>新英格兰生物实验室公司</td><td>M0250S</td><td></td></tr><tr><td>T7 RiboMAX Express 大规模 RNA 合成系统</td><td>普洛麦格公司</td><td>P1320</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini 试剂盒</td><td>凯杰公司</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>电穿孔比色皿（4 mm）</td><td>Bioexpress 公司</td><td>E-5010-4</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell 全系统</td><td>伯乐公司</td><td>165-2660</td><td></td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗双链 RNA 抗体 J2&amp;nbsp;</td><td>English &amp; Scientific Consulting Kft. 公司</td><td>10010200</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔 IgG Alexa Fluor 488</td><td>生命技术公司</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔 IgG Alexa Fluor 594</td><td>生命技术公司</td><td>A11020</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 膜包</td><td>伯乐公司</td><td>162-0263</td><td></td></tr><tr><td>印迹级封闭剂，脱脂奶粉</td><td>伯乐公司</td><td>170-6404XTU</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>伯乐公司</td><td>170-6531XTU</td><td></td></tr><tr><td>抗丙型肝炎病毒 NS3 抗体 [8 G-2]</td><td>Abcam 公司</td><td>ab65407</td><td></td></tr><tr><td>抗丙型肝炎病毒 NS3 抗体 [H23]</td><td>Abcam 公司</td><td>ab13830</td><td></td></tr><tr><td>与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的山羊抗小鼠 IgG&amp;nbsp;</td><td>杰克逊免疫研究实验室公司</td><td>115-035-003</td><td></td></tr><tr><td>Amersham ECL Prime 西部印迹检测试剂&amp;nbsp;</td><td>GE 医疗生命科学公司</td><td>RPN2236</td><td></td></tr><tr><td>SUPERSCRIPT III RT&amp;nbsp;</td><td>生命技术公司</td><td>18080085</td><td></td></tr><tr><td>SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX</td><td>生命技术公司</td><td>11744500</td><td></td></tr><tr><td>ViiA 7 实时 PCR 系统</td><td>生命技术公司</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>海肾荧光素酶检测试剂盒</td><td>普洛麦格公司</td><td>E2810</td><td></td></tr><tr><td>无 RNase 的 DNase</td><td>普洛麦格公司</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>GloMax-Multi 检测系统（发光仪）</td><td>普洛麦格公司</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

丙型肝炎病毒复制分析方案

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

丙型肝炎病毒（HCV）影响全球3%的人口，可导致严重的肝脏疾病，包括&#160;慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌。HCV 是一种有包膜的 RNA 病毒，属于黄病毒科 黄病毒科目前的治疗方法尚未完全有效，且会引起不良副作用。尚无可用的丙型肝炎病毒（HCV）疫苗。因此，仍需持续努力以开发疫苗和更有效的治疗手段。HCV细胞培养系统对于研究HCV生命周期的各个阶段至关重要，包括病毒进入、基因组复制、包装及释放。在本实验方案中，我们使用了一种野生型同基因型2a嵌合病毒FNX-HCV，以及一种携带报告基因的重组病毒FNX-Rluc 海肾 荧光素酶报告基因以研究病毒复制。采用一种人肝癌细胞系（基于Huh-7）进行转染 体外 转录的HCV基因组RNA。在转染后的不同时间点收集无细胞培养上清液、蛋白裂解物和总RNA，以评估HCV的生长情况。通过定量RT-PCR和检测HCV双链RNA的存在来评价HCV基因组的复制状态。使用针对HCV NS3和NS5A蛋白的特异性抗体，通过Western印迹和免疫荧光实验验证HCV蛋白的表达。转染HCV RNA的细胞可向培养上清液中释放具有感染性的病毒颗粒，并测定病毒滴度。利用荧光素酶报告实验评估报告HCV的复制水平和感染性。总之，我们介绍了多种病毒学检测方法，用于表征HCV复制周期的不同阶段。

丙型肝炎病毒是一种RNA病毒。因此，为了进行遗传操作，已将HCV基因组cDNA克隆至细菌质粒载体中。在HCV基因组5’端的前方插入了T7 RNA聚合酶启动子序列。HCV分析工作流程的总体示意图见图1。为了生成具有精确3’末端的HCV基因组RNA，使用XbaI限制性内切酶对含有HCV基因组的质粒进行酶切，并通过绿豆芽核酸酶消化将产生的单链突出末端钝化。通过琼脂糖凝胶电泳评估线性化HCV质粒的质量（图2B）。随后，HCV DNA经T7 RNA聚合酶介导的体外转录反应生成RNA，所得RNA产物大小为9.6 kb（图2C）。
我们检测了基因型2a HCV的种内生长动力学图 3）。Huh-7.5.1 细胞通过电穿孔转染 体外 野生型（WT）和聚合酶缺陷型病毒的转录RNA。我们通过RT-qPCR检测了病毒正义基因组的复制情况。结果显示，WT病毒能够高效复制其基因组（图 3A...

丙型肝炎病毒（HCV）是一种导致肝脏疾病（包括肝硬化和肝癌）的重要人类病原体。HCV感染性细胞培养系统对于理解HCV复制的分子机制以及开发新的治疗方法至关重要。本文中，我们描述了一种用于研究HCV复制周期各个阶段的实验方案。

丙型肝炎病毒（HCV）影响全球3%的人口，可导致严重的肝脏疾病，包括慢性肝炎、肝硬化以及……

本实验的总体目标是研究丙型肝炎病毒复制周期的各个阶段。首先，通过线性化的丙型肝炎病毒质粒构建体生成HCV基因组RNA转录本；第二步是将细胞转染H-C-V-R-N-A；接着，将细胞接种并在不同时间点进行多种检测；最后一步是收集细胞培养上清液以测定病毒滴度，并收获转染的细胞用于蛋白和RNA提取。最终通过逆转录-PCR、Western印迹、免疫荧光检测以及HCV滴度测定，证明该体系是一种稳定的丙型肝炎病毒感染性细胞培养系统。与HCV复制子系统相比，这种感染性丙型肝炎病毒细胞培养系统的主要优势在于可以研究病毒的进入、病毒颗粒的组装和释放过程。该方案有助于回答丙型肝炎病毒学领域的关键问题，例如病毒颗粒的形态发生以及宿主与病原体之间的相互作用。该技术的应用前景还包括疫苗开发，因为它能够对减毒病毒株进行表征，从而评估其作为潜在疫苗候选物的可能性。尽管该方法可为丙型肝炎病毒的研究提供见解，但也可应用于黄病毒科的其他RNA病毒。通常，初次接触该方法的研究人员将面临获得高质量丙型肝炎病毒基因组RNA的技术挑战。在发现一株日本爆发性肝炎的基因型2A丙型肝炎病毒分离株后，体外细胞培养中研究丙型肝炎病毒完整复制周期才成为可能。病毒学检测实验的可视化演示至关重要，因为该实验需要研究人员同时具备分子生物学与细胞生物学技术方面的专业知识。 使用一种基因型2A的嵌合病毒F-N-X-H-C-V及F-N-X-H-C-V多聚酶缺陷型HCV来评估病毒复制，将先前构建的病毒质粒在2毫升离心管中用XBA-one限制性内切酶消化，进行线性化处理。随后用绿豆芽素核酸酶处理质粒，以产生平末端。通过阴离子交换色谱法纯化消化后的质粒。将DNA进行琼脂糖凝胶电泳，以验证线性化质粒的完整性。随后，将线性化质粒DNA模板加入含有T7 RNA聚合酶反应组分的0.2毫升离心管中，以合成HCV基因组RNA转录本。使用RNA纯化试剂盒纯化新合成的DNase处理过的RNA。然后通过琼脂糖凝胶电泳验证RNA的生成。随后，采用分光光度法对RNA进行定量。使用胰蛋白酶处理消化基于 Huh-7 的贴壁细胞，并将细胞收集至 50 毫升锥形管中。经过两次离心后，用冷的低血清培养基重悬细胞沉淀。再次重复离心后，将细胞重悬于低血清培养基中，浓度为每毫升 1 × 10⁷ 个细胞。接下来，将总共10微克的转录病毒RNA与400微升重悬的细胞混合，加入预冷的0.4厘米电穿孔比色皿中。使用270伏、100欧姆和950微法的电穿孔条件将病毒RNA导入细胞。电穿孔完成后，将细胞重悬于10毫升含15%胎牛血清（FBS）的完全培养基中。此时，将细胞分别接种至T25培养瓶（每瓶约1.2 × 10⁶个细胞）和48孔板（每孔1 × 10⁴个细胞），用于4、48和96小时时间点的实验。转染后4至8小时，更换为含10% FBS的新鲜补充培养基，以去除培养瓶和培养板中的死亡细胞碎片。使用血清学移液管在48小时和96小时时间点将细胞培养上清液收集至15毫升锥形管中。随后，在4摄氏度条件下，以15,000 rpm离心10分钟，去除收集样品中的细胞碎片。离心后，将无细胞的上清液于-80摄氏度保存。在指定时间点裂解细胞，用于通过蛋白质印迹法和逆转录定量 PCR（RT-qPCR）进行蛋白质和 RNA 分析。在 0.2 毫升离心管中，使用逆转录酶和特异性结合 HCV 正链 5' 非翻译区的引物，对一微克总细胞 RNA 进行逆转录。同时，使用 HCV 正链引物对已知基因组拷贝数的 F-N-X-H-C-V-R-N-A 进行逆转录。使用实时 PCR 系统进行 qPCR，取 50 纳克上述逆转录得到的 cDNA，加入特异性 HCV 引物以及含有 DNA 结合绿色染料的 qPCR 超级混合液。运行 qPCR 时采用以下条件以确定 H-C-V-R-N-A 拷贝数。qPCR 完成后，对转染病毒 RNA 后 96 小时的细胞裂解液进行 SDS-PAGE 分离。然后通过转印印迹 Turbo 法将凝胶中分离的蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜上。将膜置于容器中，用含 5% 脱脂奶粉和 0.2% Tween-20 的 PBS 封闭液进行封闭。将膜与一抗小鼠单克隆抗体 NS3（1:1000 稀释）和 beta-actin（1:5,000 稀释）在 4 °C 冷室中孵育。孵育后，加入辣根过氧化物酶标记的 goat anti-mouse 免疫球蛋白 G（1:5,000 稀释），通过化学发光法进行检测。此时，将转染了H-C-V-R-N-A的细胞在负20摄氏度条件下用甲醇固定30分钟，用于免疫荧光检测。固定完成后，用PBS洗涤细胞三次。随后使用免疫荧光检测封闭缓冲液进行封闭，加入兔多克隆抗NS5A一抗和小鼠单克隆抗dsRNA抗体J2（按1:200稀释），于4摄氏度冰箱孵育5小时至过夜。一抗孵育结束后，用PBS洗涤细胞三次。然后加入1:1000稀释的山羊抗兔IgG-488多克隆二抗和山羊抗小鼠IgG-594多克隆二抗，在室温下于摇床上孵育1小时。再次用PBS洗涤细胞三次后，使用Hoechst染料对细胞核进行染色，并用荧光显微镜观察。 接下来，使用96孔板，将 naive Huh7.5.1 细胞以每孔约3 × 10³ 个细胞的密度接种。次日，用生长培养基对从H-C-V-R-N-A转染细胞中收获的无细胞培养上清液进行10倍系列稀释，并以每组三个复孔接种至Huh7.5.1细胞上。感染后72小时，使用甲醇在-20°C条件下固定细胞30分钟。将细胞从冰箱中取出后，按照先前描述的条件，对H-C-V NS5A蛋白进行氨基染色。使用荧光显微镜，计数病毒稀释度最高孔中NS5A阳性细胞病灶的数量，并计算每毫升中平均焦点形成单位数。通过凝胶电泳评估了线性化HCV质粒的质量。H-C-V-D-N-A经T7 RNA聚合酶介导的体外转录，产生了一条长度为9.6 kb的单一RNA产物。RT-qPCR结果表明，野生型病毒能够高效复制其基因组。与pol-null病毒相比，野生型病毒的基因组复制水平高出1至3个数量级。野生型病毒可产生参与病毒蛋白切割和基因组复制的NS3蛋白。野生型病毒还表达NS5A蛋白，且NS5A蛋白与双链RNA在转染野生型病毒的细胞胞质中发生共定位，提示存在活跃的病毒复制。病毒滴度测定结果显示，野生型病毒具有感染性，每毫升可产生超过10,000个感染性病毒灶形成单位。转染后6小时，野生型病毒与pol-null病毒的荧光素酶活性相似，表明两者转染的RNA输入量及翻译水平相当。然而，在转染后48小时和96小时，野生型病毒的基因组复制水平显著高于pol-null病毒。同时，野生型病毒可产生病毒NS3蛋白。pol-null病毒仅维持基础水平的荧光素酶活性，而野生型病毒的复制水平较pol-null报告病毒高出2至3个数量级。一旦掌握丙型肝炎病毒的病毒学检测技术，若操作得当，可在两周内完成实验。在进行该实验时，使用状态良好的细胞和高质量的HCV基因组RNA转录本至关重要。完成该实验后，可将已鉴定的HCV毒株用于动物模型系统，以研究其在体内的适应性及宿主与病原体之间的相互作用。丙型肝炎病毒（HCV）细胞培养系统的建立为研究人员探索病毒颗粒的形态发生及病毒释放等复制周期环节铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何开展多种病毒学检测，以表征丙型肝炎病毒复制周期的不同阶段。请务必注意，操作丙型肝炎病毒具有极高的危险性，在进行相关实验时，必须采取适当的安全防护措施，例如穿戴合适的个人防护装备。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

一个协议，用于分析丙型肝炎病毒复制

我们描述了两种基于异核体形成的条件性反式互补丙型肝炎病毒（HCV）组装并完成完整病毒生命周期的方法。这些技术适用于筛选表达显性限制因子的细胞系，这些因子可阻止感染性HCV子代病毒的产生。...

发现丙型肝炎病毒限制因子的两种异核体形成方法

来源：Allaire, A., et al．利用免疫荧光监测人乳铁蛋白的细胞摄取及其对丙型肝炎病毒的抗病毒活性．J. Vis.

准备细胞以分析抗病毒药物的细胞内摄取与活性

来源：Ren, S., 等．丙型肝炎病毒复制分析方案．J. Vis. Exp. （2014）本视频演示了使用定量反转录 PCR 对感染细胞培养物中的丙型肝炎病毒 RNA...

使用定量逆转录聚合酶链式反应检测丙型肝炎病毒载量

来源：Ren, S., et al. 丙型肝炎病毒复制分析方案. J. Vis. Exp.

检测感染细胞中丙型肝炎病毒复制复合体的免疫荧光实验

本视频演示了一种用于筛选抗病毒化合物的病毒吸附实验。通过使用基因修饰的丙型肝炎病毒和荧光素酶，检测化合物对病毒吸附的抑制作用，表现为共处理孔中的发光强度低于仅用病毒处理的对照孔。...

一种用于抗病毒化合物筛选的病毒吸附实验

本视频展示了一种用于评估靶向病毒进入宿主细胞及与内体融合特定步骤的抗病毒药物的检测方法。将细胞在低温下孵育，随后用丙型肝炎病毒（HCV）感染。低温条件允许病毒与宿主细胞结合，但通过内吞作用抑制其内化。via...

一种用于评估受试化合物对宿主细胞中病毒进入和融合影响的检测方法

在此，我们介绍一种新开发的乙型肝炎病毒（HBV）报告系统，用于监测HBV生命周期的早期阶段。该系统经过简化 体外...

开发乙型肝炎病毒报告系统以监测复制周期的早期阶段

脂滴是多种病原体复制的重要细胞器，包括丙型肝炎病毒（HCV）。本文描述了一种用于分离脂滴并对其相关蛋白进行定量质谱分析的方法；该方法可用于多种实验条件，如病毒感染、环境应激或药物处理。...

脂滴分离用于定量质谱分析

低拷贝数整合病毒DNA的检测方法 体外 乙型肝炎感染

本实验方案的目的是提供一份逐步操作指南，用于进行乙型肝炎病毒感染的3-D"肝脏芯片"实验。...

用于乙型肝炎病毒感染的原代肝细胞与库普弗细胞“肝脏芯片”培养

本方案描述了一种通过结合使用易错PCR合成全长突变RNA和反向遗传学技术，在丙型肝炎病毒基因组中引入可控遗传多样性的方法。该方法提供了一个表型筛选模型，可用于长达10...

利用反向遗传学构建正链RNA病毒变异体

学习丙型肝炎病毒复制周期的研究方法，通过体外转录生成HCV基因组RNA并进行细胞转染，建立感染性细胞培养系统。该方案结合逆转录PCR、蛋白质印迹和免疫荧光技术，为病毒学和肝病研究提供可靠工具。

丙型肝炎病毒复制分析方案

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