从实体标本中获取原发性卵巢癌细胞的方法
2014年2月4日
本研究描述了一种从实体临床标本中分离和表征原发性卵巢癌细胞的详细方法。将卵巢癌临床标本进行酶消化处理，以获得可用于下游应用的、具有活性且无成纤维细胞污染的上皮性卵巢癌（EOC）细胞。
本实验的总体目标是从临床实体组织样本中分离并鉴定原发性卵巢癌细胞。首先收集卵巢肿瘤样本并将其置于培养皿中。第二步是将样本切割成小块，并将组织块转移至含有消化试剂的锥形管中进行孵育。
接下来，将细胞悬液通过滤膜，仅收集细胞。进行离心时，最后一步是弃去上清液，并将细胞重悬于培养基中，过夜培养。最终，卵巢上皮癌细胞可在培养条件下生长数周，从而可用于后续实验。该方法有助于回答卵巢癌研究领域中的一些关键问题，例如针对每位患者的最佳治疗方案是什么。
该技术的应用前景涉及卵巢癌的治疗，因为它使我们能够使用更接近真实情况的细胞培养模型，这些细胞易于进行基因操作，并且在药物筛选实验中更具实用性。首先，向500毫升的DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）中添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素溶液（ps）。将培养基储存在4°C条件下。
从手术室采集样本后，将样本置于运输容器内并加冰运输至实验室。将样本放入生物安全柜中。将样本从50毫升锥形管转移至含有10毫升新鲜冰冷PBS的60毫米×60毫米培养皿中。
接下来，使用无菌剃刀片将样本进一步切成两毫米或更小的组织块。然后在15毫升锥形管中，用含胶原酶的DMEM处理组织。将切碎的组织转移至含有DMEM和胶原酶的混合液管中。
然后将样品在5%二氧化碳和37°C条件下孵育30分钟。每5分钟手动振荡细胞悬液一次，以确保消化充分。孵育结束后，将细胞悬液通过置于50毫升锥形管上方的70微米孔径细胞筛过滤。
使用注射器活塞轻轻按压滤网，弃去残留在滤网上方的无关组织，并将获得的细胞悬液收集至50毫升无菌锥形管中。接下来，将锥形管在4°C条件下以320 × g离心7分钟。
弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 10 毫升含有 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM 培养基中。然后将细胞悬液转移至培养皿中，在 5% 二氧化碳和 37 摄氏度条件下孵育。初次接种后 24 小时更换培养基，以去除细胞碎片以及培养物中存在的大部分红细胞。
最后，在接下来的两周内每三天更换一次培养基，此后原代EOC细胞培养物即可用于后续实验操作。接种后立即观察，上皮性卵巢癌细胞（EOC细胞）呈单细胞悬浮状态，并伴有成团的红细胞及大量细胞碎片。
接种后三天的卵巢上皮癌（EOC）细胞培养显示，EOC细胞呈半贴壁状态，形成细胞簇，且红细胞污染较少。初次接种一周后，EOC细胞培养物在组织培养塑料表面扩展成漩涡状的细胞簇。培养14天后，EOC细胞在融合的单层中呈现出典型的上皮细胞铺路石样形态。
观看本视频后，您应能充分了解如何从实体临床标本中分离和鉴定原发性卵巢癌细胞。
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概述
本研究描述了一种从实体临床标本中分离和鉴定原发性卵巢癌细胞的详细方法。该方法可实现上皮性卵巢癌细胞在体外培养中的生长，便于后续应用。
关键研究组成部分
科学领域
- 肿瘤学
- 细胞生物学
- 临床研究
背景
- 卵巢癌是一种重要的健康问题，其治疗方案复杂多样。
- 分离出有活力的癌细胞对于实现个体化医疗至关重要。
- 现有方法可能无法获得纯净的上皮性卵巢癌细胞。
- 本研究旨在改进分离流程，以获得更优的科研结果。
研究目的
- 从临床样本中分离原发性卵巢癌细胞。
- 对分离的细胞进行表征，以用于后续应用。
- 加深对卵巢癌患者治疗方案的理解。
使用的方法
- 卵巢肿瘤标本的采集。
- 组织样本的酶消化处理。
- 过滤以分离活细胞。
- 离心并重悬于培养基中进行培养。
主要结果
- 成功分离出无成纤维细胞的卵巢上皮癌细胞。
- 细胞可培养数周，便于进行深入研究。
- 该方法为癌症研究提供了可靠的细胞来源。
- 有望为个体化治疗策略的制定提供依据。
结论
- 所述方法对分离卵巢癌细胞具有良好的效果。
- 该方法有助于进一步开展卵巢癌治疗的相关研究。
- 未来的研究可在此方法基础上进一步改善患者的治疗效果。
常见问题
行业重要性概述
从实体临床样本中建立原发性卵巢癌细胞，可获得与患者特征相关的模型，减少对经过多次传代且累积了遗传变异的细胞系的依赖。该方法通过保留原发或转移病灶的肿瘤异质性和部位特异性生物学特性，有助于在靶点验证过程中进行机制性风险评估。所获得的细胞培养物可作为可再生资源用于后续筛选，提高临床前决策的预测可靠性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：利用能够反映原始临床样本遗传和表型特征的细胞，验证治疗假设。
- 操作价值：避免长期传代细胞系相关的人为假象，降低机制研究的不确定性。
- 预测价值：在与疾病相关的系统中进行生物学风险更低的靶点验证，支持项目组合的优先筛选。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：获得具有维持致瘤特性的上皮性卵巢癌细胞，适用于药物筛选。
- 操作价值：经酶消化和过滤后，可获得标准化且可重复的细胞悬液。
- 可扩展性：可从多种不同样本制备多个原代培养物，用于平行检测分析。
转化与临床前研究
- 转化连续性：通过直接使用来自患者样本的细胞，连接发现研究与临床前工作。
- 生物标志物一致性：在反映患者肿瘤特征的背景下支持对靶点和生物标志物的评估。
- 风险调整的推进：基于原代细胞中的反应来指导“继续/终止”决策，从而更准确地预测临床结果。
流程与工作流整合
该方法适用于从早期生物学研究到先导化合物鉴定的整个发现流程，所提供的原代细胞可提高后续筛选与验证工作的相关性。
- 发现生物学：利用具有完整肿瘤特异性特征的细胞支持假设验证和通路阐明。
- 筛选：提供即用型原代上皮性卵巢癌细胞，具有可量化的生长特性和形态，适用于化合物评估。
- 分析：可在遗传稳定、低传代的系统中检测药物反应、增殖及表型变化。
- 转化研究：通过直接从临床标本中分离获得细胞，保持临床相关性，支持生物标志物和靶点的验证。
- 企业级复用：建立可重复使用的平台，用于从多种标本中生成原代培养细胞，减少对有限细胞系的依赖。
运营与企业影响
- 科学价值：通过使用能够反映原始肿瘤异质性和生物学特性的细胞，提高预测的可信度。
- 操作价值：通过标准化的酶解、过滤和培养起始步骤，确保实验的可重复性。
- 战略价值：通过更优的临床前靶点验证，降低后期研发失败风险，从而提高资本使用效率。
- 项目组合影响：基于候选药物在患者来源的原代细胞中的活性，实现风险调整后的候选分子优先排序。
实施注意事项
- 需要具备无菌组织处理、酶消化和原代细胞培养技术方面的专业知识。
- 依赖于在无菌条件下获取的新鲜或妥善保存的卵巢肿瘤样本。
- 需要离心、过滤和培养设备，包括生物安全柜和CO2培养箱。
- 涉及消化时间与机械解离的优化，以最大化上皮细胞得率并尽量减少成纤维细胞污染。
- 受限于样本的可获得性与活性，其质量可能因手术时机和运输条件而异。
