Name: 为获取原发性卵巢癌细胞固体样品的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: 了解从实体临床标本中分离和表征原发性卵巢癌细胞的方法。该方案通过酶解消化、过滤和离心步骤，获得无纤维母细胞的上皮性卵巢癌细胞，支持数周培养及下游药物筛选应用。

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我们感谢明尼苏达大学组织采集中心工作人员在患者组织样本收集方面的协助。本研究由美国国防部卵巢癌研究项目（OCRP）OC093424（资助MB）、Randy Shaver癌症研究与社区基金（资助MB）、明尼苏达卵巢癌联盟（资助MB）以及妇科肿瘤学部门基金（资助MB）提供支持。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

伦理声明&#160; 
在获得机构审查委员会（人体受试者委员会，IRB）批准后，从明尼苏达大学组织获取设施（TPF）获得卵巢癌的实体标本。
1. 试剂配制
<ol>
	<li>通过在DMEM中添加10% FBS和100单位青霉素-链霉素配制完全DMEM培养基。将培养基储存于4 °C，并在使用前预热至37 °C。</li>
	<li>将dispase II分装为5–10 ml的独立体积，以避免反复冻融，并于-20 °C非无霜冰箱中保存。</li>
</ol>
2. 组织采集
<ol>
	<li>手术时，从病理医生肉眼鉴定为癌症的区域采集卵巢癌固体标本（约5 g大小）。临床标本根据机构规程进行去标识化处理并登记注册。</li>
	<li>将标本置于装有30 ml冰冻PBS的无菌螺旋盖聚丙烯标本容器中。在30分钟内，将标本置于冰上，从外科病理科实验室转运至研究实验室进行处理。&#160;从样本采集&#160;(图1).</li>
</ol>
3. 组织处理
<ol>
	<li>在无菌条件下，将样品转移至含有 10 ml 新鲜冰冻 PBS 的培养皿（60 mm x&#160;60 mm）中，并使用无菌剃刀片进一步切成尽可能小的组织块（2 mm 或更小）&#160;（图 2A 和 2B）。</li>
	<li>将切碎的组织转移至含有 10 ml 预热（37 °C，30 分钟）的 DMEM 培养基中的 15 ml 锥形管，其中含 dispase II（2.4 U/ml），于 5% CO2、37 °C 条件下孵育 30 分钟。为确保组织充分消化，每隔 5 分钟手动振荡细胞悬液一次。</li>
	<li>孵育 30 分钟后&#160;，使用 10 ml 血清移液管将细胞悬液转移至置于 50 ml 锥形管上方的细胞筛网&#160;（70 μm 孔径）上，并用注射器活塞轻轻按压筛网表面。弃去未消化的组织（残留在筛网上方），收集通过筛网的细胞悬液至 50 ml 无菌锥形管中。在 4 °C 条件下以 320 × g 离心 7 分钟&#160;&#160;（图 3）。</li>
	<li>弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 10 ml 含 10% FBS 的 DMEM 培养基中。</li>
	<li>将细胞悬液置于培养皿中，在 5% CO2、37 °C 条件下孵育&#160;（图 4）。</li>
	<li>初次接种后 24 小时&#160;更换培养基，以去除细胞碎片及培养物中大部分红细胞。</li>
	<li>随后两周内每三天更换一次培养基，此后原代 EOC 培养物即可用于后续实验应用。</li>
</ol>

<ol><li>Kurman, R. J., Visvanathan, K., Roden, R., Wu, T. C., Ie M, S. hih <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+detection+and+treatment+of+ovarian+cancer%3A+shifting+from+early+stage+to+minimal+volume+of+disease+based+on+a+new+model+of+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Obstet.+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Early detection and treatment of ovarian cancer: shifting from early stage to minimal volume of disease based on a new model of carcinogenesis.</a> Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (4), 351-356 (2008).</li>
<li>Kuhn, E., Kurman, R. J., Shih, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+Cancer+Is+an+Imported+Disease%3A+Fact+or+Fiction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Obstet.+Gynecol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Ovarian Cancer Is an Imported Disease: Fact or Fiction.</a> Curr. Obstet. Gynecol. Rep. 1 (1), 1-9 (2012).</li>
<li>Sarojini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+detection+biomarkers+for+ovarian%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Early detection biomarkers for ovarian.</a> J. Oncol. , (2012).</li>
<li>Shepherd, T. G., Theriault, B. L., Campbell, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nachtigal+M.W.+Primary+culture+of+ovarian+surface+epithelial+cells+and+ascites-derived+ovarian+cancer+cells+from+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nachtigal M.W. Primary culture of ovarian surface epithelial cells and ascites-derived ovarian cancer cells from patients.</a> Nat. Protoc. 1 (6), 2643-2649 (2006).</li>
<li>Tsao, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+ovarian+surface+epithelial+cells+immortalized+by+human+papilloma+viral+oncogenes+%28HPV-E6E7+ORFs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of human ovarian surface epithelial cells immortalized by human papilloma viral oncogenes (HPV-E6E7 ORFs).</a> Exp. Cell. Res. 218 (2), 499-507 (1995).</li>
<li>Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cultured+human+ovarian+surface+epithelial+cells%3A+phenotypic+plasticity+and+premalignant+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes.</a> Lab. Invest. 71 (4), 510-518 (1994).</li>
<li>Brewer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+model+of+normal%2C+immortalized+ovarian+surface+epithelial+and+ovarian+cancer+cells+for+chemoprevention+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">In vitro model of normal, immortalized ovarian surface epithelial and ovarian cancer cells for chemoprevention of ovarian cancer.</a> Gynecol. Oncol. 98 (2), 182-192 (2005).</li>
<li>Sueblinvong, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment%2C+characterization+and+downstream+application+of+primary+ovarian+cancer+cells+derived+from+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Establishment, characterization and downstream application of primary ovarian cancer cells derived from solid tumors.</a> PLoS One. 7 (11), (2012).</li>
<li>Rockwell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo-in+vitro+tumour+cell+lines%3A+characteristics+and+limitations+as+models+for+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer+Suppl%22%5BJournal%5D)">In vivo-in vitro tumour cell lines: characteristics and limitations as models for human cancer.</a> Br. J. Cancer Suppl. 41 (4), 118-122 (1980).</li>
<li>Wong, C., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development%2C+application+and+limitations+of+breast+cancer+cell+lines+to+study+tamoxifen+and+aromatase+inhibitor+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Steroid.+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The development, application and limitations of breast cancer cell lines to study tamoxifen and aromatase inhibitor resistance.</a> J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 131 (3-5), 83-92 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

更深入地了解卵巢癌的病因和发展机制，对于改善罹患这种毁灭性疾病女性的预后至关重要。在这一背景下，使用已建立且&#34;商业化提供&#34;的卵巢癌细胞系无疑发挥了巨大作用。然而，目前我们已知，癌细胞系在诸多方面并不能代表其来源的人类肿瘤，包括缺乏异质性9,10。
本文报道了一种快速、可靠的方法，可在30分钟内直接从卵巢癌临床样本中分离并培养原代卵巢癌细胞&#160;外科标本分离
由于原代细胞是从实体组织标本而非腹水液中分离获得，因此该方法的优势在于能够在腹水形成之前，从疾病早期阶段的组织中分离细胞。该技术的另一优势是能够从特定部位分离原代卵巢癌细胞。采用本方案成功获取有活力的原代卵巢癌细胞，在很大程度上取决于手术后样本处理的速度。为获得最佳结果，样本应在手术后30分钟内送达实验室&#160;。若无法实现，应将样本在4 °C（置于PBS中）保存过夜，并于次日进行处理。根据我们的经验，过夜储存后处理样本会降低细胞得率。&#160;使用dispase II消化时间超过30分钟&#160;也会降低细胞活力，应避免...

尽管卵巢癌的发病率相对较低，但它是最致命的妇科疾病，也是女性癌症死亡的第五大原因1,2这主要是由于缺乏能够真实模拟该疾病发生与进展的可靠工具和模型3目前，我们对卵巢癌的大部分认识都是通过使用永生化卵巢上皮细胞（IOSEs）、卵巢癌细胞系以及从腹水液中分离的原代卵巢癌细胞获得的。4-7然而，它们的使用存在若干局限性，包括与永生化过程相关的多种基因和表型改变 体外 传代次数及由腹水制备导致的细胞群体异质性。
因此，来源于可识别且特异的卵巢癌实体标本的原代卵巢癌细胞，是研究卵巢癌进展的独特工具。
获取这些恶性细胞的主要困难在于间质细胞或成纤维细胞的过度生长，同时这些卵巢上皮癌（EOC）细胞在培养过程中容易出现活力下降以及增殖能力过早丧失。目前已有多种通过机械法或酶解法将实体瘤制备成单细胞悬液的方法，但某些技术能获得更理想的产出效果8。本文表明，使用中性蛋白酶II进行酶消化可有效回收具有活力且不含成纤维细胞的EOC细胞。由此获得的EOC细胞培养物对遗传操作高度敏感，也适用于药物筛选实验，表明这些EOC细胞培养物适合多种后续应用。

<table><tbody><tr><td>1x PBS，无菌&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>螺旋盖聚丙烯样本容器，无菌</td><td>Thermo Scientific</td><td>02 1090</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 培养基，无菌&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清，无菌</td><td>Thermo Scientific Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>100x 青霉素-链霉素溶液，液体</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II，无菌</td><td>Roche</td><td>04942 078 001</td><td></td></tr><tr><td>小型精细镊子和手术刀片，无菌</td><td>Fisher Scientific</td><td>镊子：08-953E，刀片：08-927-5D</td><td></td></tr><tr><td>小型解剖剪刀，无菌</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-945</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 锥形带盖离心管，无菌</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 锥形带盖离心管，无菌</td><td>BD Falcon</td><td>352027</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 血清移液管，无菌&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>6 ml 注射器活塞，无菌&amp;nbsp;</td><td>Tyco Healthcare</td><td>8881516911</td><td></td></tr><tr><td>尼龙滤网（70 &amp;mu;m）细胞筛，无菌</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>5 cm 培养皿，无菌&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 培养皿，无菌&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr></tbody></table>

从实体标本中获取原发性卵巢癌细胞的方法

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

迫切需要可靠的工具来研究卵巢癌的起始与进展。尽管卵巢癌细胞系的使用对于理解卵巢癌仍具有重要价值，但其应用存在诸多局限性，包括缺乏异质性以及伴随长期培养而产生的大量遗传改变 体外 传代培养&#160;在此，我们描述一种可从手术时采集的实体临床标本中快速建立原发性卵巢癌细胞的方法。该方法包括将临床标本进行30分钟的酶消化处理，所得细胞悬液可进行培养，并用于后续应用，包括药物筛选。相较于已建立的卵巢癌细胞系，原发性卵巢癌细胞系的优势在于其能够代表来源临床标本的特异性，并可从原发或转移性卵巢癌的不同病灶部位获取。

卵巢癌的新鲜临床标本在手术后收集（图1），并切成小块（图2A 和 图2B），形成细胞悬液。这有助于标本充分接触酶处理。将细胞悬液进行酶消化，并在37 °C下孵育30分钟。在孵育过程中，悬液逐渐变得浑浊（尤其每次振荡后更为明显），这是组织解离的标志。孵育结束后，将悬液转移至细胞筛中，以分离上皮性卵巢癌（EOC）细胞与未完全解离的组织（图3）。收集的细胞悬液置于含5% CO2、37 °C的培养环境中（图4）。此时细胞培养的形态学特征显示，EOC细胞以单细胞悬液和小细胞团的形式存在。此阶段的培养物中还可观察到红细胞及少量细胞碎片，如 图5 所示。重要的是，EOC细胞会缓慢地（在1–3天内）贴附于塑料培养表面，而红细胞和细胞碎片则不会贴壁，并会随着时间推移逐渐从培养体系中“消失”。接种后第3天，EOC培养物中可见贴壁的EOC细胞簇逐渐增多，红细胞和碎片则逐渐减少，如 图6 所示。第6–7天...

本研究描述了一种从实体临床标本中分离和表征原发性卵巢癌细胞的详细方法。将卵巢癌临床标本进行酶消化处理，以获得可用于下游应用的、具有活性且无成纤维细胞污染的上皮性卵巢癌（EOC）细胞。

迫切需要可靠的工具来研究卵巢癌的起始与进展。尽管卵巢癌细胞系的使用仍然是……

本实验的总体目标是从临床实体标本中分离并鉴定原发性卵巢癌细胞。首先收集卵巢肿瘤标本并将其置于培养皿中，以实现这一目标。第二步是将样本切割成小块，并将这些组织块转移至含有消化试剂的锥形管中进行孵育。接下来，将细胞悬液通过滤膜，仅收集细胞。进行离心时，最后一步是弃去上清液，并将细胞重悬于培养基中，过夜培养。最终，上皮性卵巢癌细胞可在培养条件下生长数周，从而可用于后续实验。该方法有助于回答卵巢癌研究领域中的一些关键问题，例如针对每位个体患者的最佳治疗方案是什么。该技术的应用前景可拓展至卵巢癌的治疗，因为它使我们能够使用更接近真实情况的细胞培养模型，这些细胞易于进行基因操作，并且在药物筛选实验中更具实用性。首先，向500毫升DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）中添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素溶液（ps）。将培养基储存在4°C条件下。从手术室采集样本后，将样本置于运输容器内并加冰运输至实验室。将样本放入生物安全柜中。将样本从50毫升锥形管转移至含有10毫升新鲜冰冷PBS的60毫米×60毫米培养皿中。接下来，使用无菌剃刀片将样本进一步切成两毫米或更小的组织块。然后在15毫升锥形管中，用含胶原酶的DMEM处理组织。将切碎的组织转移至含有DMEM与胶原酶的混合液管中。然后将样品在5%二氧化碳和37°C条件下孵育30分钟。每5分钟手动振荡细胞悬液一次，以确保消化充分。孵育结束后，将细胞悬液通过置于50毫升锥形管上方的70微米孔径细胞筛过滤。使用注射器活塞轻轻按压滤网，弃去残留在滤网上方的无关组织，将获得的细胞悬液收集至50毫升无菌锥形管中。接下来，以320 × g离心7分钟，温度设置为4°C。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 10 毫升含有 10% FBS 和 1% ps 的 DMEM 培养基中。然后将细胞悬液转移至培养皿中，在 5% 二氧化碳和 37 摄氏度条件下培养。初次接种后 24 小时更换培养基，以去除细胞碎片以及培养物中大部分的红细胞。最后，在接下来的两周内每三天更换一次培养基，此后原代EOC细胞培养物即可用于后续实验。接种后立即观察，上皮性卵巢癌细胞（EOC细胞）呈单细胞悬浮状态，并伴有成团的红细胞及大量细胞碎片。接种后三天的卵巢上皮癌（EOC）细胞培养显示，EOC细胞呈半贴壁状态，形成细胞簇，且红细胞污染较少。初次接种一周后，EOC细胞培养物在组织培养塑料表面扩展成漩涡状的细胞簇。培养14天后，EOC细胞在融合的单层中呈现出典型的上皮细胞铺路石样形态。观看本视频后，您应能够充分了解如何从实体临床样本中分离和鉴定原发性卵巢癌细胞。

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医学

为获取原发性卵巢癌细胞固体样品的方法

异质性三维 体外 卵巢癌起始与进展过程中间质-上皮相互作用的建模

本方案描述了一种通过将卵巢组织外植体与输卵管癌细胞共培养来进行样品制备的技术。利用成像质谱技术（IMS）对这些样品进行观察，以检测细胞与组织之间的小分子交换，从而揭示肿瘤发生的相关机制。...

建立用于成像质谱分析的卵巢癌通讯模型：一种鉴定转移性卵巢肿瘤发展中小分子化学信使的方法

在本视频中，我们介绍一种从实体卵巢肿瘤组织样本中分离和鉴定原发性卵巢癌细胞的方法。采用本方案获得的上皮癌细胞适用于研究可能导致卵巢癌发生与发展的相关过程。...

从实体标本中获取原发性卵巢癌细胞：一种培养卵巢肿瘤标本中上皮性卵巢癌细胞的方法

卵巢癌细胞侵袭腹膜间皮衬层是一个随时间动态变化的过程。利用实时分析仪，可在延长的时间段内定量评估卵巢癌细胞在球状体-间皮细胞共培养模型中的侵袭能力，从而深入了解调控转移过程的相关因素。...

实时评估卵巢癌球体对间皮细胞的黏附与侵袭

肿瘤起始细胞（TICs）可能是治疗卵巢癌这一高复发性且致命性疾病的一个有效治疗靶点。本文介绍了一种培养条件的实验方案，可富集此类高致瘤性的细胞群体。...

体外 富集卵巢癌肿瘤起始细胞

在此，我们介绍一种构建三维的方案 体外 由原代人腹膜间皮细胞和成纤维细胞与细胞外基质分层构建的腹膜腔内衬模型，用于研究卵巢癌细胞的黏附、侵袭和增殖。...

模拟人类腹膜腔类器官培养中卵巢癌扩散的早期步骤

为了阐明卵巢癌腹膜播散的多步骤过程，本研究通过将这些肿瘤细胞进行原位接种，建立了一种小鼠实验模型，用于原发肿瘤的形成及腹膜转移的研究。<br...

小鼠原位接种卵巢癌细胞构建原发肿瘤及腹膜转移的实验模型 via 正位接种卵巢癌细胞

患者来源的类器官（PDO）是一种三维（3D）培养体系，可在体外模拟肿瘤微环境。in vitro。在高级别浆液性卵巢癌中，PDO...

高级别浆液性卵巢癌患者来源类器官的建立与培养

我们介绍了一种可用于利用患者来源的卵巢癌类器官进行药物疗效测试的实验方案。...

用于临床前药物测试的卵巢癌患者来源类器官模型

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一个 离体 利用人网膜建立卵巢癌腹膜转移模型

本方案为从不同疾病阶段建立卵巢癌类器官提供了一个系统性框架，并针对患者个体差异带来的挑战，提高了类器官的得率，实现了稳定且长期的扩增，以满足后续应用需求。方案涵盖了组织处理、接种、培养基条件优化以及免疫荧光染色等详细操作步骤。...

卵巢癌类器官生物样本库构建策略：应对不同组织学亚型及疾病阶段间的患者间异质性

了解从实体临床标本中分离和表征原发性卵巢癌细胞的方法。该方案通过酶解消化、过滤和离心步骤，获得无纤维母细胞的上皮性卵巢癌细胞，支持数周培养及下游药物筛选应用。

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