同时记录黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中已鉴定神经元的钙信号与摄食行为

本实验的总体目标是通过钙成像技术同步监测神经元活动与摄食行为。首先将一只果蝇置入果蝇实验装置中，随后解剖果蝇头部以暴露大脑。

将带有解剖后果蝇的装置置于显微镜载物台上。该操作步骤的最后一步是用糖芯刺激 pro Bois。最终，可通过钙成像观察到特定神经元的激活，并通过行为录像记录 proboscis 的伸展，从而获得相关结果。

我最初想到这种方法时，是受到了在水面上游动的水生啤酒虫复眼的启发。我们啤酒虫具有分裂的眼睛，能够同时看到水面之上和之下。我实验中的一个难点在于，大脑与SCUs彼此非常接近，但如果能像我们啤酒虫的眼睛那样巧妙地将它们分离开来，就可以在大脑暴露于卫星环境的同时，保持SCUs处于干燥状态。

在SCU上方制作一个非常简单的隔板，以将干燥面与宽处隔开。通过熔化35毫米Falcon培养皿盖子的侧壁，并将其雕刻成适当的角度和厚度，从而形成一个平台。在平台上钻一个孔，用于固定果蝇头部，使口器部分能自由暴露在腔室外。将移液器吸头末端剪裁至刚好能容纳果蝇身体的宽度，然后将吸头粘接到平台上。

在25摄氏度下将成年果蝇饥饿处理24小时后，用镊子将果蝇放入一个15毫升的塑料离心管中，并置于冰上使其麻醉。将一只果蝇插入果蝇实验腔室中，并轻轻推动果蝇直至其无法移动。

使用睫毛或类似工具，将少量光固化胶水涂抹在喙或吻部的侧面及上方，将其近端周围的部位密封至孔的内边缘。同时，将胶水从果蝇内部涂抹至头部背侧与孔内边缘之间的空隙。最后，用足以固化的最弱蓝光照射胶水，以避免损伤果蝇。

为了固定果蝇的头部并暴露腹侧的咽下神经节（SOG），用一根细线将吻部部分抬起并固定。将果蝇固定后，在平台表面加入不含蔗糖的生理盐水。使用钨丝刀和尖端锋利的镊子（我们称之为锋利镊子）切开头部外骨骼，以暴露咽下神经节（SOG）。

Scis zips。这是对Scis zips的演示，通过切割Kimwipe中的一根纤维进行对比。首先在视野中使用虹膜剪刀进行操作，然后在1毫米刻度尺前进行。

首先，使用钨丝刀片从后缘切开。然后用锋利的镊子剪开侧缘和前缘。用镊子夹起已切开的表皮碎片并将其移除。

使用镊子剪断触角和触角神经。然后选择性地移除位于咽上神经节（SOG）与表皮之间的气囊，以稳定脑组织并防止运动伪影。接着，在食管通向咽部的一端以及通向咽上神经节（SOG）的一端分别进行剪切，以切断咽部与脑之间的连接。

随后，在识别并分离出第16号肌肉后，去除连接脑部与体壁的任何气管。将果蝇置于旋转盘共聚焦显微镜的载物台上，切换至水浸物镜进行成像。然后使用491纳米激发激光，以122毫秒的曝光时间，以每秒四帧的速率对目标区域进行单层光学切片采集。

使用带有少量日本纸作为灯芯的注射器针头，将灯芯从针头末端伸出，用于向果蝇提供蔗糖。将一小滴蔗糖溶液滴加到灯芯上，然后通过连接针头与注射器的柔性管路，使用操纵杆控制的注射器将溶液吸入。

将浸湿的滤纸灯芯短暂接触探针尖端，仅需一瞬间，以避免饱和。在进行钙成像的同时，使用连接在解剖显微镜上的CCD相机监测PROBUS伸展反应或PER行为，并确保在解剖后一小时内完成数据采集。

图中显示的是使用含 100 毫摩尔蔗糖的 WIC 刺激后，喙部缩肌运动神经元中典型的 prob Bois 突起反应。采用 491 纳米激光对 G CAMP 荧光进行水溶液成像。此处所示的行为反应前后同步钙成像，可直观呈现蔗糖诱导的运动神经元中 GAMP 3.0 对喙部缩肌的反应。

在蔗糖诱导的GAMP 3.0反应的状态定量分析中，运动神经元对蔗糖刺激表现出荧光强度的急剧上升，随后在数秒内恢复至基线水平。该平台还可兼容其他方法，如电生理学、光遗传学或化学遗传学操作，或对神经元进行化学激活，以及对GFP标记的结构进行延时成像，从而回答更多科学问题，例如突触可塑性与记忆之间的关联。