从小鼠胰腺RNA提取：核糖核酸酶丰富的组织
August 2nd, 2014
我们报道了一种从富含核糖核酸酶的小鼠胰腺中分离高完整性 RNA 的程序。
该程序的总体目标是从核糖核酸酶脊小鼠胰腺中分离出高度完整的 RNA。这是通过从安乐死小鼠的尸体中快速取出胰腺来实现的。接下来，胰腺浸没在裂解试剂中，组织匀浆。
离心后，使用标准方案从上清液中分离 RNA，并将 RNA 抑制剂溶液添加到最终的 RNA 溶液中。最后一步是仔细清洁均质器刀片，去除刀片中卡住的任何组织块，然后进行一系列乙醇和水洗。最终，该程序允许分离 RNA 完整性值大于 7 的小鼠胰腺 RNA，用于常规基因表达分析。
我叫 Tom Schmid，我从事 RNA 研究已有 20 多年了，在这段时间里，我从未经历过像为小鼠胰腺分离具有高完整性的 RNA 这样困难的事情。我们将向您展示的技术是为小鼠胰腺开发的，但实际上没有理由它不能用于各种其他组织，包括来自人类细胞的组织、细胞系或来自小鼠的其他组织，包括富含肋核酶的组织，如脾脏。使用该实验步骤中的建议，您可以从小鼠胰腺中分离出高完整性的 RNA。
这可用于许多下游应用，例如 QPCR、基因表达芯片或 RNA-Seq。奥拉·埃尔加马尔。我实验室的一名高级研究生将在按照文本协议中的描述对小鼠实施安乐死后演示这项技术。
使用无菌手术器械，使用 25 号皮下注射针将每只动物的四只爪子刺入平坦的表面，从而固定尸体。切开鼠标的中段，然后快速从鼠标中取出胰腺。用镊子固定胰腺，用弹簧剪刀将其从脾脏和小肠上切开。
从鼠标中取出时要小心不要拉伸胰腺。组织破坏可能会释放核糖核酸酶。将整个胰腺放入装有 8 毫升冰冷裂解试剂的 50 立方厘米的试管中。
盖上试管并短暂摇晃，使组织浸入试剂中，然后立即进行下一步，不得拖延。接下来，将胰腺匀浆 5 秒钟。重要的是将均质器叶片压到离心管的底部，以便将组织拉入叶片中以实现高效均质化。
为了去除未消化的组织，将 2 mL 含有裂解胰腺的裂解试剂转移到 2 mL 微量离心管中。每个分离离心机在 4 摄氏度、12， 000 倍 G 下收集两管微量离心管匀浆 5 分钟，以沉淀未消化的组织。这是一个关键步骤，因为未消化的组织残留到后续的 RNA 溶液中可能会使样品受到核糖核酸酶的污染。
将均质器叶片放入 10 毫升 70% 乙醇中清洁它们。激活均质器约 20 秒，以去除可能卡在刀片中的任何组织块。然后使用 200 微升移液器吸头去除残留在均质器刀片中的任何碎片。
用水、一般 RNA syn 激活剂和 70% 乙醇再次清洁均质器刀片。最后，用干净的 Kim 抹布擦干均质器轴。将 1 毫升 SNA 转移到 2 毫升微量离心管中。
将所有含有匀浆的试管放在湿冰上，同时进行下一步。立即进行 RNA 分离，并将复制管储存在零下 80 摄氏度以备将来使用。将剩余的裂解试剂丢弃到适当的化学废液容器中。
以下部分使用 RNA 纯化试剂盒。纯化试剂盒的优点是它可以分离总 RNA，包括小 RNA。通过向匀浆溶液中加入 200 μL 氯仿开始分离。
盖上试管，用手剧烈摇晃 15 秒。然后让试管在室温下静置 2 到 3 分钟，然后在 12， 000 倍 G 和 4 摄氏度下离心 15 分钟。将上层水层转移到微量离心管中。
加入 1.5 体积的异丙醇，上下吹打数次充分混合。将多达 700 μL 的样品转移到离心柱中，离心柱放置在 2 mL 收集管中。盖上盖子，在室温下以 8， 000 倍 G 离心 15 秒，然后丢弃流出物。
接下来，向离心柱中加入 700 微升缓冲液 RWT 并离心。和以前一样，丢弃通过移液管的液流，将 500 微升缓冲液 RPE 放入离心柱中，然后再次离心以清洗色谱柱。弃去流出物后，向离心柱离心机中再加入 500 微升缓冲液 RPE 2 分钟，分 8， 000 次 G.To 干燥色谱柱，将离心柱转移到 1.5 毫升微量离心管中，将 100 微升无肋核水直接移液到离心柱膜离心机上，在 8 点离心 1 分钟， 000 倍 G 洗脱，得到 RNA。
然后向 RNA 溶液中加入 1 微升 RNA 抑制剂，并继续使用毛细管电泳分析确定 RNA 完整性，如文本方案中所述，从小鼠胰腺中分离的 RNA 的 RNA 完整性数或 RIN 的比较揭示了均质化中使用的裂解试剂体积与 RNA 完整性之间的直接相关性。结果表明，应使用 8 毫升裂解试剂 在该方案中，将核糖核酸酶抑制剂添加到 RNA 水溶液中，并在冻融时比较 RNA 完整性。含抑制剂的 RNA 溶液的 RIN 为 7.3 加或减 0.15，而不含抑制剂的溶液为 2.9 加或减 0.65，以检查反复冻融会使核糖核酸酶抑制剂变性使其无效的可能性。
测试含有核糖核酸酶抑制剂的 RNA 溶液。冷冻和解冻多达 5 次的 RNA 溶液仍然产生 7 或更高的 RIN。虽然那些被冻融六次或更高的溶液产生的 RIN 低于 7 个随机引物，但 CDNA 是从 RNA 合成的，并且通过 QPCR 测量三个看家基因的表达。
使用标准技术，数据验证了小鼠胰腺 RNA 在标准分子生物学技术中的成功使用。经过适当培训后，研究生和博士后应该能够在大约 30 分钟内完成这项技术。我只想告诉大家我们是如何使用它的。
我们正在研究胰腺癌的转基因小鼠模型，我们正在使用这项技术来分离 RNA。然后当我们得到 RNA 时，我们将研究这些动物中 micro RNA 的基因表达。
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概述
本文介绍了一种从含有大量核糖核酸酶的小鼠胰腺中分离出高完整性RNA的方法。该方法确保获得的RNA适用于常规基因表达分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
背景
- RNA完整性对于准确的基因表达分析至关重要。
- 胰腺中含有大量能够降解RNA的核糖核酸酶。
- 从该组织中分离RNA需要快速处理以保持完整性。
研究目的
- 开发一种从小鼠胰腺中分离高质量RNA的可靠方法。
- 为胰腺组织的基因表达研究提供便利。
- 提供一种在分离过程中最大程度减少RNA降解的协议。
使用的方法
- 从处死的小鼠身上立即取出胰腺。
- 将胰腺浸入裂解试剂中进行均质化。
- 通过离心分离RNA和组织碎片。
- 向最终的RNA制备中加入RNase抑制剂溶液。
主要结果
- 实现了大于七的RNA完整性数值。
- 该方法能够有效分离出适合分析的RNA。
- 标准协议成功应用于分离出的RNA。
结论
- 所描述的程序有效用于从小鼠胰腺中分离高质量RNA。
- 该方法可以用于各种基因表达研究。
- 维持RNA完整性对于可靠的实验结果至关重要。
