小鼠胰岛的朗格汉斯的分离纯化的胶原酶和中性蛋白酶结合使用
2012年9月7日
小鼠胰岛分离的详细描述描述原位胰腺导管插管和灌注纯化的胶原酶和中性蛋白酶的组合中使用的技术。
该程序的总体目标是成功地从小鼠胰腺中分离出孔眼。这是通过首先将胰腺与周围组织分离来实现的。接下来，对胆管进行插管，以便可以用胶原酶蛋白酶混合物给胰腺充气。
充气后，取出胰腺并小心解离孔眼。最后，过滤和电镀分离的孔眼以备将来使用。最终，这种使用纯化的胶原酶和中性蛋白酶分离孔眼的方法用于获得最大的孔眼产量和最佳的孔眼形态。
与现有的孔眼分离方法相比，该技术的主要优点是，我们通过使用纯化的酶消除了批次间的差异。此外，我们还更改或改进了一些方案，以改善孔眼形态。安乐死后，用 70% 乙醇覆盖躯干，然后从肛门到横膈膜完全打开腹腔。
接下来，将鼠标放在解剖显微镜的平台上。拉出盲肠和升结肠，将它们放在体外的体外，向左移动肝脏的叶靠着横膈膜。如果它们没有自行留在那里，请增加体腔的开口。
用弯曲的镊子夹住十二指肠，找到通往肝脏的肝动脉门静脉和胆管束。用另一对弯曲的镊子。在动脉静脉和导管束下插入缝合线，并尽可能靠近肝脏收紧。
使用两对弯曲的镊子，小心地抓住十二指肠，发现连接在处，用一个镊子钳子戳穿胆管下方和附近工作的胰腺和结缔组织。快速将镊子穿过孔并插入缝合线。松散。将缝合线系在胆管周围，用 90 度镊子形成一个小圆圈。
拉动小肠，直到胆管变成 tau。用超细剪刀在上做一个水平切口，不要在握住肠道的同时将胆管从上移开。将套管插入胆管，然后轻轻地将缝合线拉紧套管周围。
接下来，用 2.0 毫升胶原酶蛋白酶混合物填充 3 毫升注射器。以缓慢、恒定的速度将这种混合物注射到套管中。胰腺充气完成后，从胆管中取出套管。
从降结肠开始，剪断结缔组织，同时向上拉肠，直到到达胆管。接下来，将胰腺与脾脏和周围组织分开。最后，切掉缝合线并切除胰腺。
取出后，将胰腺放入含有 5 毫升冰上 HBSS 的 50 毫升试管中。收集所有样品后，将任何含有胰腺组织的 50 毫升试管放入 37 摄氏度的水浴中。轻轻摇动试管 15 分钟，检查组织是否解离。
确保组织轻松分开，握住管子的盖子。旋转 12 次以进一步解离组织。加入不超过 30 毫升的 HBSS 并离心。
小心吸出上清液，并在底部留下少量上清液，以免破坏细胞调色板。使用连接到 14 号针头的 30 毫升注射器，加入不超过 10 毫升的 HBSS，并上下吸出悬浮液两次。通过塑料 T 过滤器将细胞混合物过滤到 50 毫升管中。
再用 10 毫升 HBSS 冲洗并离心。倒出上清液，倒置试管，在吸水纸巾上沥干 1 分钟。将每根试管重悬 10 mL。
寒冷 1100。他的不透明覆盖层，他的不透明 10 毫升，HBSS 和离心机。使用大口径 25 毫升移液管去除整个 20 毫升上清液，并将上清液通过倒置的 70 微米过滤器。
将孔眼直接过滤到培养皿中，并通过通过过滤培养物吸取 10 毫升孔眼培养基进行冲洗。将孔眼放在组织培养箱中，直到准备好进行实验。孔眼产量、形态和质量是用于判断孔眼分离成功的一般参数。
典型的孔眼形态如图所示。孔眼呈圆形至长方形，大小相对均匀。这里。分析分离的孔眼是否具有葡萄糖刺激的胰岛素分泌。
Sigma 11 型制备的孔眼与 ci zyme TM、MABP 制备的孔眼之间的胰岛素刺激相似，表明孔眼制备质量高。看完这个视频，你应该对如何插管小鼠胆管有了很好的了解。使用酶胶原酶和中性蛋白酶分离您的眼睑以进行任何检测。
概述
本文描述了使用体内胰腺导管插管和胶原酶-蛋白酶混合物从小鼠胰腺中分离胰岛的详细步骤。该方法旨在提高胰岛的产量和形态，同时最大限度地减少变异。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 内分泌学
背景
- 胰岛细胞对于胰岛素的产生至关重要。
- 传统的分离方法可能导致结果的变异。
- 使用纯化的酶可以提高分离胰岛的质量。
- 改进的协议可以导致更好的胰岛形态。
研究目的
- 有效地从小鼠胰腺中分离胰岛。
- 减少酶制剂之间的批次变异。
- 为研究应用优化胰岛形态。
使用的方法
- 从周围组织中分离小鼠胰腺。
- 对胆管进行插管以便酶注入。
- 用胶原酶-蛋白酶混合物充气胰腺。
- 过滤和分装分离的胰岛以备实验使用。
主要结果
- 成功分离和分离胰岛。
- 观察到分离后胰岛形态改善。
- 通过胰岛素分泌测试显示高质量的胰岛制剂。
- 该方法显示比传统技术变异性降低。
结论
- 所描述的方法对于分离高质量胰岛是有效的。
- 使用纯化的酶提高了结果的可靠性。
- 这种技术对于涉及胰岛的各种分析可能有益。
常见问题
Executive Industry Relevance
Isolation of primary pancreatic islets enables physiologically relevant assessment of beta cell function, which is critical for diabetes target validation and mechanistic de-risking. Variability in enzyme lot performance compromises reproducibility across discovery campaigns, impacting lead identification and predictive confidence. This protocol addresses lot-to-lot inconsistency through purified collagenase and neutral protease, supporting scalable, standardized islet preparation for preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of intracellular signaling pathways and secretory responses in primary islets, improving target hypothesis validation.
- Operational Value: Reduces biological noise from enzymatic variability, increasing confidence in target engagement readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides consistent islet yield and morphology for reliable glucose-stimulated insulin secretion assays.
- Operational Value: Standardized enzyme composition supports assay reproducibility across laboratories and screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease-relevant beta cell biology for preclinical efficacy and toxicity studies.
- Operational Value: Facilitates cross-strain comparability when enzyme ratios are adjusted for species-specific tissue characteristics.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, where primary islet function informs go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional target validation using physiologically relevant human-like islet responses.
- Screening: Enables standardized, quantitative assessment of compound effects on insulin secretion.
- Analytics: Generates measurable dependent variables such as insulin secretion levels and islet yield for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery-phase target modulation to preclinical outcomes through preserved islet morphology and function.
- Enterprise Reuse: Purified enzyme lots allow protocol reuse across projects, reducing re-optimization burden.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduced mechanistic ambiguity in beta cell responses.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of islet isolation across sites and studies.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in diabetes programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on reliable islet-derived functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine dissection and pancreatic duct cannulation.
- Dependent on access to purified collagenase (CIzyme MA) and neutral protease (CIzyme BP) with characterized activity.
- Necessitates standardization of enzyme ratios (e.g., 35:10 collagenase:protease) for consistent performance.
- Adaptation may be needed for non-C57BL/6 strains or rat models based on tissue density and enzyme accessibility.
- Practical limitation: Manual dissection and inflation steps constrain throughput without automation.
