小鼠胰岛隔离

大家好，我是 Greg Zott。我在 UCSF 糖尿病中心的 Bluestone 实验室工作，今天我将向您展示分离小鼠孔眼的过程。该程序涉及将胶原酶溶液注射到 C3 H 供体小鼠的胰腺中，然后我们将取出该胰腺，将其消化掉，以 fial 梯度纯化孔眼，然后手工挑选它们最终移植到糖尿病 NOD 小鼠的肾包膜中，这将是我们的接受者。

在开始此程序之前，我们在改良的 Hanks 缓冲液中稀释了 ATE 溶液，并调整了针对我们使用的小鼠菌株的特异性浓度 C3 H.我们发现每密耳 0.8 毫克胶原酶溶液的消化效果更好，我们将使用它来注射到胆总管中以扩张胰腺。执行。今天的程序将是糖尿病中心的 Pavo codre。他会注射，打开老鼠，露出肠道，然后注射到胆总管。

我们将用乙醇喷洒鼠标以保持头发垂下，然后我们还将验证鼠标是否已通过捏脚趾正确牺牲。Pavo 现在将打开鼠标，并通过中线切口露出肠道和胰腺。隔膜也将被切割以验证鼠标是否会被牺牲。

在我们开始之前，我想指出一些重要的结构。胃就躺在这里，胰腺连接到十二指肠下方和上方。这是肝脏，我们可以在这里找到胆囊和胆总管，你可以在这里看到。

所以 Pavo 接下来要做的是隔离小肠，找到胆总管进入小肠的位置。一旦肠道暴露出来，我们就用蚊夹夹住胆总管的两侧。我们发现这允许更多的胶原进入胰腺，而其他组则试图将夹子引导到胆总管的顶部。

我们发现这是允许酶进入胰腺的更好技术。这是一个温和的过程。你不想撕裂肠道。

您希望让夹子轻轻地放在胆总管的两侧。现在我们将找到一个胆囊，一旦胆囊暴露出来，我们将使用它作为将胶原酶注射到胆总管的指南。Powell's 使用 30 号针头和装有三研磨胶原酶溶液的 5 cc 注射器。

当他进入胆总管时，他用胶原酶溶液扩张该胆管，然后他沿着胆总管向下移动，直到到达肠道附近。当他下降时，酶溶液被泵入注射到胰腺中。现在胰腺已经用胶原酶溶液充气了，Powell 将去除止血剂，然后从小鼠身上取出胰腺，小心翼翼地将其从肠道中撕下。

他从胃里把它拿出来。好了，然后用脾脏作为手柄，他抬起胰腺，然后在胆总管中慢慢地剪掉它，就是这样。胰腺布局，然后去除脾脏，然后取出中胚层肠组织，然后将胰腺放入两磨胶原酶溶液和消毒玻璃瓶中，然后放回冰上。

我们放入玻璃瓶中的分离胰腺现在将放入 37 度的水浴中约 17 分钟。我们将它们放入一个 50 mil 的锥形机架中，这样它们就不会浮起来。在沐浴期间，计时器开始启动，消化开始。

消解时间完成后，取出样品瓶，然后轻轻摇晃和破碎。一旦组织开始散开，就将小瓶放在冰上。将无菌筛选置于含有洗涤缓冲液的 400 mil 烧杯上。

然后将胰腺消化物小心地倒入筛网上的洗涤缓冲液中。出于演示目的，引擎盖已关闭，引擎盖的玻璃已升起，以便我们可以看到我们在做什么。将胰腺消化物倒入烧杯后，使用相同的洗涤缓冲液冲洗样品瓶，并将洗涤缓冲液置于筛网上。

我们有一个装满洗涤缓冲液的注射器。我们将使用它来通过筛网强行清洗组织。这个想法是释放任何未附着在基质上的松散孔眼，但将膜和未消化的组织留在屏幕上。

当您清洗完纸巾后，这就是您通常在手术结束时看到的。现在，位于试管底部的胰腺组织将被转移到两个 50 mil 的锥形管中，组织将被清洗，组织混合均匀，然后均匀分布，以便每个试管中的颗粒体积相等。现在用更多的洗涤缓冲液冲洗烧杯。

冲洗侧面，以便您再次获得所有进入烧杯的组织。然后它在每两个之间平均分配，均为 50 mil。然后用洗涤缓冲液加满锥形。

将组织倒置数次，然后放入离心机中。这是一个快速旋转。离心机允许达到 1000 RPM，然后关闭。

此时的组织非常 S 孔眼非常敏感，你不想过度压实它们。取出试管，我们将再进行三次洗涤步骤。这是第三次洗涤的结束。

将 50 mil 锥形管的组分转移到 15 锥形管中，离心 1000 RP M，然后停止。supernat 将被删除，FI Call 的第一部分将被启动。我们正处于拥有颗粒状胰腺消化物的步骤。

我们将重悬该组织，使其良好且松散地粘附在颗粒上。我们将添加第一个密度梯度，即 1 1 0 8。我们将为每个管子添加 5 mils。

然后将沉淀在每个梯度中充分混合。在最重的梯度中获得良好的组织分布非常重要。现在我们将对 1 0 9 6 密度的 2 mil 进行分层。

然后，我们将在此之上，在 1 0 6 9 密度的 2 mil 层，然后在 1 0 3 7 密度的顶部。在对不混合的密度进行分层时，这一点很重要。然后所有层都已添加到管中。

你可以看到这是 1 1 0 8 的顶部，9 1 0 9 6 的顶部，1 0 6 9 的顶部和 1 0 3 7 的顶部。你可以看到，即使没有中心融合，组织也已经开始移动到适当的密度。将梯度以 1800 RPM 的速度加速 15 分钟，请记住在从离心机中取出试管后保持制动器关闭。

你可以看到在 0 0 9 6 和 0 0 7 层之间，有一条漂亮的孔眼组织带 Pablo's。现在去除 0 3 7 层以去除处理过程中可能释放的任何组织碎片和 DNA。现在，他将使用无菌塑料牧场移液器去除胰岛层，并将其转移到含有 25 mil 洗涤缓冲液的 50 mil 锥形中。

您想快速执行此步骤，因为 fol 对孔眼有毒。我们实际上删除了整个 0 6 9 和 0 9 6 图层。Pavo 切下塑料牧场移液器的顶部并用洗涤缓冲液冲洗。

然后像我们以前的离心机一样对孔眼进行离心。离心机被加热到 1000 RPM，然后我们停止它并抽吸。上清液孔用洗涤介质洗涤 3 次。

因此，我们刚刚完成了从消化到叶梯度再到纯化孔眼的眼睑分离过程，在用洗涤缓冲液进行第三次洗涤后，我们将孔眼重悬于 RPMI 培养基中，并在组织培养板中播放。这些孔眼现在可用于体外检测或体内制备，如孔眼移植。