Name: 小鼠胰岛隔离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 20 s
Description: 学习小鼠胰岛分离技术，通过胶原酶注射、胰腺消化和Ficoll梯度纯化，从C3H供体小鼠获取活性胰岛，用于移植至糖尿病NOD小鼠模型。该方法为糖尿病研究和胰岛移植治疗提供可靠实验基础。

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胶原酶的制备
<ol>
<li>称取胶原酶放入50 ml锥形管中，加入分离缓冲液，配制成下表所示的终浓度。通过涡旋振荡溶解胶原酶。 （12只小鼠 + 2只备用小鼠 = 14只小鼠 × 5 ml/只 = 总共70 ml胶原酶溶液） （70 ml × 0.5 mg/ml 或 0.3 mg/ml = 总共35 mg 或 21 mg胶原酶P） 
<table style="BORDER-RIGHT: #ddd 1px solid; BORDER-TOP: #ddd 1px solid; BORDER-LEFT: #ddd 1px solid; BORDER-BOTTOM: #ddd 1px solid; TEXT-ALIGN: left" border="0" width="80%">
<tbody>
<tr>
<th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left">品系</th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left">年龄</th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left">胶原酶P (mg/ml)</th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left">时间 (min)</th>
</tr>
<tr>
<td style="font-size: 12px">C3H, Balb/C, B6</td>
<td style="font-size: 12px">&gt; 12周</td>
<td style="font-size: 12px">0.8</td>
<td style="font-size: 12px">17</td>
</tr>
<tr>
<td style="font-size: 12px">C3H, Balb/C, B6</td>
<td style="font-size: 12px">&lt;= 12周</td>
<td style="font-size: 12px">0.5</td>
<td style="font-size: 12px">13</td>
</tr>
<tr>
<td style="font-size: 12px">NOD, NOR, NON</td>
<td style="font-size: 12px">&gt; 12周</td>
<td style="font-size: 12px">0.8</td>
<td style="font-size: 12px">17</td>
</tr>
<tr>
<td style="font-size: 12px">NOD, NOR, NON</td>
<td style="font-size: 12px">&lt;= 12周</td>
<td style="font-size: 12px">0.5</td>
<td style="font-size: 12px">17</td>
</tr>
</tbody>
</table>
 </li>
<li>将2 ml胶原酶溶液分装至每个玻璃小瓶中，并置于冰上。每支5 ml注射器中加入3 ml胶原酶溶液，安装30g针头后置于冰上（在生物安全柜中准备）。</li>
</ol>
扩张
<ol>
<li>解剖前立即通过颈椎脱位处死动物。用70%乙醇喷洒整个动物体表，使其完全湿润。从生殖区域开始做V形切口。旋转小鼠，使其尾部背向操作者。</li>
<li>将肠管移至打开的小鼠体腔左侧，以暴露胰腺和胆总管。</li>
<li>在胆管汇入处两侧的小肠部位各放置一个止血钳，留出一个小囊袋，以便胶原酶溶液进入肠腔。</li>
<li>使用装有3 ml冷胶原酶溶液的5 ml注射器和30g针头，从胆囊开始，经胆管向胰腺内注射以使其膨胀。</li>
<li>将胰腺从体内取出，并置于含有2 ml胶原酶溶液的硅化玻璃瓶中。此步骤应迅速且尽可能干净地完成，尽量减少脂肪和结缔组织的混入。</li>
<li>将玻璃瓶置于冰上，并对下一只小鼠重复步骤3。</li>
</ol>
消化
<ol>
<li>密封每个小瓶，并将其放入 37°C 水浴。孵育13-17分钟（时间因菌株和动物年龄而异）。</li>
<li>孵育时间结束后，剧烈振荡离心管。胰腺组织应自行解离。</li>
<li>将每份消化液倒入经灭菌的大号水槽滤网中，滤入无菌的1000 ml烧杯，并用洗涤缓冲液强力吹打滤网表面进行冲洗。将消化液分装至50 ml锥形管中（每管含3个胰腺组织；若n=12，加入足量洗涤缓冲液使终体积达200 ml，并分装至4个50 ml管中）。稀释操作应在此时进行 迅速并在冰上进行 以避免胰岛过度消化.</li>
<li>离心：启动离心机，当转速达到1300 rpm时，关闭离心机。</li>
<li>吸除上清液，保留约 5 mL。注意切勿吸出沉淀。</li>
<li>轻轻敲击管壁使沉淀重悬，然后加入50 ml洗涤缓冲液。</li>
<li>离心：启动离心机，当转速达到1300 rpm时，关闭离心机。</li>
<li>重悬沉淀，并用5 ml洗涤缓冲液洗涤。</li>
<li>将5 ml转移至15 ml离心管中，同上离心沉淀。</li>
<li>吸尽上清液，尽可能彻底。（残留的缓冲液可能导致Ficoll密度发生变化。）</li>
</ol>
Ficoll
操作需迅速。长期接触Ficoll对胰岛具有毒性。
<ol>
<li>在加入Ficoll之前，确保沉淀物已完全分散（未充分破碎的组织在Ficoll中难以重悬）。</li>
<li>用7 ml密度为1.108的Ficoll通过剧烈涡旋重悬沉淀。</li>
<li>按以下顺序，在每管Ficoll密度层上方依次叠加2 ml其余密度的Ficoll：1.096、1.069，然后是1.037。</li>
<li>在4°C条件下以1800 rpm离心15分钟，离心时必须关闭刹车！</li>
<li>使用无菌塑料滴管（spoid）从第二层中挑取胰岛。将所有收集物转移至含有约25 mL冷缓冲液的50 mL锥形管中。</li>
<li>如上所述，用洗涤缓冲液洗涤3次（重复步骤12–15）。</li>
<li>将胰岛重悬于20 ml RPMI-1640培养基中（含10% FCS、青霉素和链霉素、HEPES、MEM-NEAA），轻轻混匀。取100 µl样品用于计数。</li>
<li>将100 µl样品转移至含有1 ml培养基和1 ml二氮杂菲（dithizone）的35 mm网格培养皿中。</li>
<li>将剩余胰岛置于RPMI 1640培养基中，在37°C、7% CO2的培养箱中孵育，使用160 mm培养皿，每皿共加入30 ml培养基。 <img src="/files/ftp_upload/old/255_2008_8_24_3/255_Figure-01.png" alt="密度梯度离心示意图，胰岛层分离过程，标注1.037–1.108。" width="220" height="194" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"></li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>二苯硫腙</td><td>试剂</td><td></td><td></td><td>将5 mg二苯硫腙溶解于5 ml DMSO中，置于50 ml锥形管内。加入45 ml生理盐水，轻轻混匀。使用60 cc注射器和0.22 &quot;m注射器滤器过滤至新的50 ml离心管中。4 °C保存备用。使用时，每35 mm计数网格板中加入1 ml。</td></tr><tr><td>PBS</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>分离液</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td>含10 mM HEPES、1 mM MgCl₂、5 mM葡萄糖、pH 7.4的HBSS</td></tr><tr><td>洗涤液</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td>含1 mM CaCl₂的分离缓冲液</td></tr><tr><td>胶原酶P</td><td></td><td>Boehringer Ingeheim</td><td>1213873</td><td></td></tr><tr><td>解剖工具</td><td></td><td></td><td></td><td>止血钳（n=2）、镊子（n=2）、剪刀（用于皮肤切口及分离胰腺周围组织）</td></tr><tr><td>注射器</td><td></td><td></td><td></td><td>无菌，5 ml，每只小鼠1支</td></tr><tr><td>30 G针头</td><td></td><td></td><td></td><td>无菌，每支注射器1个</td></tr><tr><td>带聚四氟乙烯盖的硅化玻璃小瓶</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>213-018-54</td><td>无菌，每只小鼠1个</td></tr><tr><td>大号水槽滤网</td><td></td><td></td><td></td><td>无菌</td></tr><tr><td>1000 ml烧杯</td><td></td><td></td><td></td><td>无菌</td></tr><tr><td>纱布垫</td><td></td><td></td><td></td><td>4×4，每只小鼠2块</td></tr><tr><td>塑料滴管</td><td></td><td></td><td></td><td>无菌</td></tr><tr><td>小鼠</td><td>动物</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠胰岛分离

Murine Pancreatic Islet Isolation

您好，我是 Greg Zott，来自加州大学旧金山分校（UCSF）糖尿病中心的 Bluestone 实验室。今天我将向您展示小鼠胰岛分离的操作流程。该实验包括向 C3H 品系供体小鼠的胰腺内注射胶原酶溶液，随后取出胰腺组织，进行消化处理，利用密度梯度离心法纯化胰岛，并通过手工挑选获得高纯度胰岛，最终将其移植至糖尿病 NOD 小鼠的肾包膜下，后者将作为受体动物。在开始此操作之前，我们将ATE溶液用改良的Hanks缓冲液稀释，并根据我们所使用的C3H小鼠品系调整了其浓度。我们发现使用每毫升含0.8 mg胶原酶的溶液进行消化效果更佳，因此将采用该溶液注入胆总管以扩张胰腺。今天执行该操作的是糖尿病中心的Pavo Codre。他将进行注射操作，打开小鼠体腔，暴露肠道，然后向胆总管内注射溶液。我们将用乙醇喷洒小鼠以压平毛发，然后通过脚趾夹捏来确认小鼠已正确处死。Pavo 现在将沿腹中线切开小鼠，暴露肠道和胰腺。同时将剪开膈肌，以确认小鼠已被处死。在开始之前，我想指出一些重要的结构。胃位于此处，胰腺附着于其下方并延伸至十二指肠及上方区域。这是肝脏，我们将在此找到胆囊和胆总管，您可以在该位置清楚看到。接下来，Pavo 将分离小肠，找到胆总管进入小肠的位置。暴露肠管后，我们使用蚊式钳在胆总管两侧进行夹闭。我们发现这种方法有利于更多的胶原酶进入胰腺，而其他研究团队则尝试将夹子直接夹在胆总管上方。我们发现，这种方法更有利于酶进入胰腺。该操作较为轻柔，切勿撕裂肠道。应让止血钳轻轻置于胆总管两侧。现在我们将找到胆囊，一旦胆囊暴露出来，便以其作为引导，将胶原酶注射至胆总管中。Powell 使用的是一支30号针头，连接含有3毫升胶原酶溶液的5毫升注射器。当他进入胆总管时，会用胶原酶溶液扩张该导管，然后沿胆总管向下推进，直至接近肠道。在向下推进的过程中，酶溶液被持续泵入并注入胰腺。现在胰腺已充满胶原酶溶液，Powell 将移除止血钳，然后小心地将胰腺从肠壁上撕离，从该小鼠体内取出胰腺。他将其从胃部取出。好的，然后以脾脏作为抓手，提起胰腺，再沿着胆总管缓慢剪下，就这样。胰腺被分离出来后，接着移除脾脏，然后他去除肠系膜组织，随后将胰腺放入含有两毫升胶原酶溶液的无菌玻璃小瓶中，并重新置于冰上。我们将分离出的胰腺放入玻璃小瓶后，现需将其置于37度水浴中约17分钟。我们将胰腺置于50毫升锥形离心管架中，以防止其上浮。水浴开始时即启动计时器，消化过程随之开始。消化时间结束后，取出离心管，轻轻振荡并轻柔吹打。一旦组织开始解离，立即将离心管置于冰上。在含有洗涤缓冲液的400 mL烧杯上方放置一个无菌滤网。然后将胰腺消化液小心地倒入筛网上，使其流入洗涤缓冲液中。为了演示方便，此时已关闭通风橱，并将通风橱的玻璃门升起，以便观察操作过程。一旦胰腺消化液完全倒入烧杯后，需用相同的洗涤缓冲液冲洗样品管，并将洗涤缓冲液再次倒在筛网上。我们有一个装有洗涤缓冲液的注射器。将用它用力冲洗滤网上的组织。目的是冲走所有未与基质结合的游离小孔结构，同时将膜结构和未消化的组织保留在滤网上。当完成组织清洗后，通常会在操作结束时看到如下情况。将位于管底的胰腺组织转移至两个50 mL离心管中，对组织进行清洗，充分混匀后均匀分配，使每管中的组织沉淀体积相等。随后用更多清洗缓冲液冲洗烧杯。冲洗管壁，以确保所有进入烧杯的组织都被回收。然后将样品等量分装到两个 50 mL 离心管中，每管 50 mL，再用洗涤缓冲液补至满管。将组织反复倒置数次，然后放入离心机中。进行短暂离心。待离心机转速达到1000 RPM后，关闭离心机。此时组织非常脆弱，眼状结构非常敏感，切勿过度挤压。移除试管后，此洗涤步骤还需重复三次。至此，第三次洗涤结束。将50毫升锥形管中的组分转移至15毫升锥形管中，以1000 rpm离心后停止。吸除上清液，开始FI Call的第一部分。此时我们已进行到获得胰腺消化沉淀物的步骤。我们将重悬该组织，使其充分分散，避免形成团块。加入第一层密度梯度液，即1108，每管加入5 mL。然后将沉淀物充分混匀于各梯度溶液中。确保在最浓的梯度中获得良好的组织分布非常重要。接下来，我们将加入两毫升密度为1.096的溶液。然后在上层加入两密耳厚度、密度为1 0 6 9的溶液，再在其上方加入密度为1 0 3 7的溶液。在叠加不同密度溶液时，注意不要混合各层。至此，所有液层均已添加至离心管中。你可以看到这是 1 1 0 8 的顶部，9 1 0 9 6 的顶部，1 0 6 9 的顶部以及 1 0 3 7 的顶部。可以看出，即使尚未进行离心，组织已开始向其对应密度位置移动。将菲亚尔梯度液在 1800 RPM 条件下离心 15 分钟，当从离心机中取出离心管后，请记得保持刹车关闭状态。在0 0 9 6层与0 0 7层之间，可以看到一层清晰的眼状组织带，即Pablo's。现在去除0 3 7层，以清除在处理过程中可能释放的组织碎片和DNA。使用无菌的塑料巴氏德吸管，他将移取胰岛层，并将其转移至含有25 mL洗涤缓冲液的50 mL锥形管中。此步骤需快速完成，因为fol对眼点具有毒性。我们实际上已移除整个0 6 9和0 9 6层。Pavo剪去塑料移液管顶部，并用洗涤缓冲液冲洗。然后将小孔板进行离心，离心条件与之前相同。将离心机升速至1000 RPM后停止，随后吸除上清液。小孔板将用洗涤液清洗三次。我们刚刚完成了眼睑分离过程，从消化物开始，经过fol梯度分离，最终获得纯化的眼睑组织。在使用洗涤缓冲液进行第三次洗涤后，我们将眼睑组织重悬于RPMI培养基中，并将其接种到组织培养板中。这些眼睑组织现在已准备好用于体外实验或体内制备，例如眼睑移植。

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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