检测选择性剪接的过程中上皮 - 间质转化

以下实验的总体目标是检测 EMT 期间选择性剪接的变化。这是通过利用诱导型 EMT 模型实现的，其中融合蛋白的表达 twist er。在人乳腺上皮细胞中，作为第二步，在他莫昔芬处理后触发细胞进行 EMT。

使用亚型特异性引物组通过定量 R-T-P-C-R 分析剪接亚型的表达，从而揭示 RNA 水平的可变剪接变化。接下来，通过免疫印迹确定对应于每种亚型的蛋白质丰度，以确认剪接亚型在蛋白质水平上的表达，获得的结果显示 EMT 期间目标基因选择性剪接的变化，基于定量 R-T-P-C-R 和免疫印迹分析，该方法可以帮助回答 RN 选择性剪接和 EMT 领域的关键问题， 例如 EMT 期间如何调节选择性剪接，以及这种调节如何影响 EMT 和 EMT 相关的病理过程。这项技术对癌症治疗的影响是 stand，因为 EMT 在促进肿瘤侵袭和转移方面起着重要作用。

虽然这种方法可以提供对 EMT 期间选择性剪接的见解。亚型特异性 MRA 检测方法也可应用于其他系统，例如研究神经元分化和程序细胞死亡中的选择性剪接。第一步是将表达扭转 ER 融合蛋白的细胞接种，将细胞接种到 10 厘米的组织培养皿中，一式两份，准备并光保护他莫昔芬溶液以诱导上皮间充质转化或用 20 纳摩尔含他莫昔芬的培养基处理细胞对于非他莫昔芬处理的对照组，在孵育两天后向另一组细胞中加入 0.01% 乙醇。

在光学显微镜下以 10 倍放大倍率拍摄照片，以记录任何形态变化。接下来，用冷 PBS 洗涤细胞。将细胞从板的一半刮入 RNA 裂解缓冲液中用于 RNA 分离，另一半在 100 微升冰冷的 ripa 缓冲液中用于蛋白质分析，如前所述从两组中传代细胞，并用 20 纳摩尔他莫昔芬或载体连续处理。

每隔一天重复这些步骤，直到第 14 天，此时他莫昔芬处理的扭曲 ER 细胞应显示纺锤形间充质形态。而载体处理的对照应保持鹅卵石样上皮形态。这里使用四个外显子前缘 NNA 作为检测外显子包涵的实例。

在可变外显子 3 内设计一个正向引物，在附近的组成型外显子 4 内设计一个反向引物。允许可变外显子包含的亚型的特异性扩增，以特异性扩增外显子跳跃事件。设计跨越组成型外显子 2 和外显子 4 连接处的引物，否则当包含可变外显子 3 时，引物将被破坏。

在组成型外显子 4 内设计另一个引物以检测基因的总转录本，并在准备好时避免从基因组 DNA 扩增的 PCR 产物或两个组成型外显子内的 prem NA.Design 引物。遵循标准 RNA 提取程序，从之前收集的细胞样品中分离 RNA。通过紫外吸收测定 RNA 的浓度和质量，以合成最终体积为 20 微升的第一链 CD NA 设置逆转录酶反应。

42 摄氏度下进行 RT 反应 1 小时，然后在 70 摄氏度下孵育 5 分钟。实时灭活 RT 酶。PCR 构建 20 μL 反应体系，包括 10 μL Cyber Green 预混液、0.1 至 1.0 μL CD NA 模板以及 5 皮摩尔正向和反向引物。

运行 real-time PCR，40 个循环，一式三份。检查解离曲线，并确保每个引物组都观察到一个峰。通过计算扩增曲线的二阶导数值来获得定量循环值。

使用此公式所示，使用 delta delta CQ 方法计算诱导样品中靶 mRNA 与未诱导样品相比的相对数量。将收集的细胞放在冰上进行蛋白质分析约 10 分钟，然后离心并收集上清液。确定蛋白质浓度后，在 SDS 上样、缓冲中稀释样品，并将 20 至 40 μg 蛋白质上样到 10% SDS 页面凝胶中。

以 20 毫安的浓度运行 SDS 页面凝胶 1.5 小时。在此之后，在 4 摄氏度的湿式转印系统中，在 85 伏电压下将蛋白质转印到 PVDF 膜上 3 小时。根据目标蛋白质的分子量调整转移时间。

接下来，在 5% 脱脂牛奶中封闭膜 30 分钟至 1 小时。在室温下，将膜与一抗在 4 摄氏度下孵育过夜。一抗可识别组成型外显子包被区域的表位，并根据其不同的蛋白质大小同时检测 slic 亚型。

同时，通过免疫印迹监测 EMT。用于 EMT 标记。使用 eec、ahern、γ catenin 和 occludin 作为上皮标志物，使用纤连蛋白 n 钙粘蛋白和 menton 作为间充质标志物。

第二天，用 TBST 洗涤膜 3 次，间隔 5 分钟。接下来，将膜与 HRP 偶联的二抗以 1 至 10， 000 稀释度在室温下孵育 1 小时。在此之后，用 TBST 清洗膜 3 次，间隔 5 分钟。

最后，用化学发光检测系统观察蛋白质，并将膜暴露在自动射线照相胶片下。扭曲诱导的 EMT 的特征是从鹅卵石样上皮表型转变为细长的成纤维细胞表型，显示上皮标志物、 e 钙粘蛋白、γ 连环蛋白和封闭素的缺失，以及间充质标志物、纤连蛋白 n 钙粘蛋白和波形蛋白的上调。此外，通过所描述的细胞连接处 EC 钙粘蛋白定位的缺失来评估 EMT。

以下是用于检测 CD 44 剪接亚型的引物设计。引物位置由不同颜色的箭头表示。Q-R-T-P-C-R 分析结果表明，TAM 处理 14 天后 CD 44 V mRNA 显着降低，CD 44 s mRNA 增加。

相比之下，在 EMT 期间 CD 44 的总转录物保持不变，与 Q-R-T-P-C-R 的结果一致，CD 44 V 的蛋白水平显着下降，而 CD 44 s 蛋白的表达在参加该程序时大大上调。重要的是要记住，成功诱导耳鼻喉科非常关键。因此，必须通过各种方法仔细确认 ENT，例如检测 ENT 标志物的细胞形态表达变化和 RIN 在细胞表面的定位。

按照该程序，可以执行其他方法，如剪接报告基因管理测定，以回答其他问题，例如，这些作用元件和交易因素如何影响选择性剪接调控 在其开发后？这项技术为 RNA 生物学、发育生物学和癌症生物学领域的研究人员探索正常发育和癌症转移期间 EMT 过程中的选择性剪接调节铺平了道路。