Name: 检测选择性剪接的过程中上皮 - 间质转化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: 了解利用可诱导EMT模型检测人乳腺上皮细胞中选择性剪接变化的方法。通过定量RT-PCR和免疫印迹技术分析剪接异构体表达，揭示EMT过程中的RNA调控机制，为癌症治疗研究提供重要依据。

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作者谨此感谢 Wensheng Liu 在细胞成像方面提供的宝贵帮助。本研究得到了以下基金项目的资助：&#160;美国国立卫生研究院（R01 CA182467）、美国癌症协会（RSG-09-252-01-RMC）、林恩·塞奇基金会、姐妹的希望基金会

1. 上皮-间质转化诱导的细胞培养
注意：上皮-间质转化（EMT）可通过TGFβ处理或在上皮细胞中异位表达转录因子Twist、Snail或Zeb1/2来诱导。本方案描述了一种通过在永生化人乳腺上皮细胞（HMLE/Twist-ER，由加州大学圣地亚哥分校J. Yang博士惠赠）中表达Twist-ER融合蛋白实现的可诱导EMT系统9,11,29。经4-羟基他莫昔芬（TAM）处理后，融合蛋白Twist-ER转入细胞核，驱动基因转录，并在12–14天内完成完整的EMT转化过程9,11,29。其他可诱导EMT系统，如HMLE/Snail-ER、HMLE/TGFβ和MCF10A/TGFβ，可参见我们之前的发表文献11,30。
<ol>
	<li>在含有5% CO2的37 °C培养箱中，将HMLE/Twist-ER细胞培养于无血清的乳腺上皮细胞生长培养基（MEGM）中。当细胞融合度达到80%时，每2-3天传代一次。用0.15%胰蛋白酶在37 °C孵育5-10分钟消化细胞，随后加入5%小牛血清/DMEM终止胰酶反应。离心收集细胞并重悬于MEGM中，按1:4的比例将细胞接种至新的细胞培养皿中。</li>
	<li>将TAM溶于乙醇中配制成200 μM的储存液。避光保存于-20 °C。使用前，将TAM以1:10,000的比例新鲜加入MEGM培养基中，使其终浓度为20 nM。</li>
	<li>为诱导EMT，将1.6 × 106个HMLE/Twist-ER细胞接种至10 cm细胞培养皿中，设两个重复。使用含20 nM TAM的MEGM培养基进行培养。</li>
	<li>将1.6 × 106个HMLE/Twist-ER细胞接种至10 cm培养皿中，设两个重复，并以0.01%乙醇处理作为未加TAM的对照组。</li>
	<li>培养两天后，在10倍物镜下用光学显微镜拍照，记录细胞形态学变化。</li>
	<li>吸除对照组或TAM处理组其中一个培养皿中的培养基，用预冷的PBS洗涤细胞，然后用细胞刮分别将培养皿的一半刮入RNA裂解液中用于RNA提取，另一半刮入RIPA裂解液中用于蛋白质分析。</li>
	<li>将对照组或TAM处理组的细胞进行传代，按1.6 × 106个细胞/皿的比例重新接种至10 cm培养皿中，设两个重复，并持续用20 nM TAM或溶剂对照处理。</li>
	<li>从第2天开始，每隔一天重复步骤5至7，直至第14天。此时，经TAM处理的Twist-ER细胞呈现纺锤形的间充质样形态，而溶剂对照处理的细胞则维持鹅卵石样的上皮形态。</li>
</ol>
2. EMT 的表征
注意：EMT 的完成由以下几点指示：（1）细胞形态从鹅卵石样的上皮形态转变为纺锤形的成纤维细胞样外观；（2）E-钙黏蛋白在细胞间连接处的定位消失；（3）EMT 标志物的表达发生转换，表现为上皮标志物的丢失和间充质标志物的获得。
在第1节所述的EMT诱导过程中，通过10倍放大倍数的光学显微镜捕捉细胞形态学变化。本节描述了在细胞连接处通过免疫荧光检测E-钙黏蛋白的方法。EMT标志物的表达通过免疫印迹法进行检测。常见的上皮标志物包括E-钙黏蛋白、γ-连环蛋白和闭合蛋白，而间充质标志物则包括纤维连接蛋白、N-钙黏蛋白和波形蛋白。免疫印迹法的一般操作步骤详见第4节。
<ol>
	<li>在 TAM 处理的第 12 天，将 1 × 105 个细胞接种到置于 24 孔板孔中的 12 mm 圆形玻璃盖玻片上。</li>
	<li>接种后 48 小时，吸除培养基，并用预热的 PBS 洗涤细胞。</li>
	<li>用预热的 4% 多聚甲醛固定细胞 15 分钟。</li>
	<li>用 PBS 洗涤细胞三次。</li>
	<li>在室温下用含 0.2% Triton X-100 的 PBS 孵育细胞 15 分钟。</li>
	<li>用 PBS 洗涤细胞三次。</li>
	<li>在室温下用 5% BSA/PBS 封闭 1 小时，以阻断非特异性结合。</li>
	<li>在湿盒中，于 4 °C 过夜孵育细胞，加入用 1% BSA/PBS 按 1:50 稀释的一抗 E-cadherin。注意：一抗稀释倍数通常在 1:50 至 1:200 之间，每种抗体的最佳稀释度应通过实验确定。</li>
	<li>弃去一抗溶液，并用 PBS 洗涤细胞三次。</li>
	<li>在室温下用 1:500 稀释的荧光标记二抗孵育细胞 1 小时。从本步骤开始，需避免光照。</li>
	<li>弃去二抗溶液，并用 PBS 洗涤三次。</li>
	<li>用 0.1–1 g/ml 的 DAPI 或 Hoechst 染色 10 分钟。</li>
	<li>用 PBS 冲洗细胞三次。</li>
	<li>滴加封片剂将盖玻片封固，并用指甲油密封。</li>
	<li>在 63X 荧光显微镜下观察细胞并采集图像。</li>
</ol>
可使用其他抗体进行染色以确认EMT表型。例如，可通过染色N-钙黏蛋白和α-平滑肌肌动蛋白来鉴定间充质表型29,31,32。通过用鬼笔环肽对F-肌动蛋白进行染色，可监测细胞骨架结构的重组11。此外，还可进行细胞迁移和细胞死亡抗性检测，以评估EMT的特性11。
3. 使用qRT-PCR检测剪接异构体
<ol>
	<li>引物设计 
	注意：引物对应仔细设计，以扩增不同的剪接异构体。外显子跳跃是最常见的可变剪接事件，此处以此为例说明引物设计策略。图1A展示了一个包含四个外显子的前体mRNA，其中第三个外显子为可变外显子。包含外显子3会生成较长的剪接异构体，而跳过外显子3则产生较短的剪接异构体。需要设计引物以区分包含外显子3和跳过外显子3的异构体，并检测该mRNA的总转录本。
	<ol>
		<li>为检测外显子的包含情况，应在可变外显子3内部设计一条正向引物，在邻近的组成型外显子4内部设计一条反向引物，从而特异性扩增包含可变外显子的异构体。注意不要将正向和反向引物均设计在同一个可变外显子内，以避免从基因组DNA或前体mRNA中扩增出PCR产物。</li>
		<li>为特异性扩增外显子跳跃事件，应设计其中一条引物跨越组成型外显子2与外显子4的连接处，该连接处在外显子3被包含时会被破坏；另一条引物则设计在组成型外显子4内部。这样，只有当可变外显子3被排除，且组成型外显子2与外显子4连接在一起时，才能生成PCR产物。</li>
		<li>为检测该基因的总转录本，应将引物设计在两个组成型外显子1和2内部，从而从所有异构体中扩增出PCR产物。</li>
		<li>确保所有引物的熔解温度（Tm）约为55 °C，每条引物长度约为18–22个核苷酸，PCR产物大小在80至150个碱基对之间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RNA提取：使用总RNA提取试剂盒（见材料表）提取RNA。
	<ol>
		<li>将细胞收集于350 μl RNA裂解缓冲液中。</li>
		<li>向裂解液中加入350 μl 70%乙醇，并充分混匀。</li>
		<li>将样品转移至RNA纯化柱中。</li>
		<li>在10,000 × g离心1分钟，弃去穿流液。</li>
		<li>用500 μl RNA洗涤缓冲液I洗涤一次，再用RNA洗涤缓冲液II洗涤两次。</li>
		<li>以最大转速离心2分钟，彻底去除残留的RNA洗涤缓冲液II。</li>
		<li>将纯化柱转移至新的1.5 ml离心管中，在柱基质中心加入50 μl无核酸酶水，通过最大转速离心洗脱RNA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第一链cDNA合成
	<ol>
		<li>通过紫外吸收测定法确定RNA的浓度和质量。注意：高质量RNA的260 nm / 280 nm吸光度比值应约为2.0。</li>
		<li>设置逆转录（RT）反应体系，总体积为20 μl，包含250 ng总RNA、0.05 μg随机六聚体引物、50 pmol MgCl2、10 pmol dNTP、2 μl 5× GoScript缓冲液和1 μl逆转录酶。</li>
		<li>在42 °C反应1小时，随后在70 °C孵育5分钟以灭活逆转录酶。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实时PCR
	<ol>
		<li>设置20 μl反应体系，包含10 μl SYBR Green主混合液、0.1–1.0 μl cDNA模板以及各5 pmol的正向和反向引物。</li>
		<li>进行实时PCR扩增，共40个循环，每个循环包括：95 °C变性10秒，58 °C退火10秒，60 °C延伸30秒。每个样本设三个技术重复。</li>
		<li>检查溶解曲线，确保每对引物仅出现单一峰。</li>
		<li>通过计算扩增曲线的二阶导数确定定量循环（Cq）值。</li>
		<li>采用“ΔΔCq法”计算诱导样本中目标mRNA相对于未诱导样本的相对表达量（RQ），公式如下所示。使用GAPDH或TBP等看家基因作为内参。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="定量PCR方程；ΔCq、ΔΔCq、RQ公式；基因表达分析方法。" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51845/51845eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 1"> 
为了更准确地计算剪接异构体的相对值，应考虑使用多个参考基因。结果可采用Pfaffl等人描述的改进型绝对定量方法进行分析et al33,34。
4. 蛋白质水平上剪接异构体的检测
<ol>
	<li>用 100 μl 冰冷的 RIPA 裂解缓冲液收集细胞。</li>
	<li>将裂解物置于冰上孵育约 10 分钟。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 14,000 × g 离心 10 分钟，收集上清液。</li>
	<li>采用 Bradford 法测定蛋白浓度。</li>
	<li>将蛋白样品用 SDS 上样缓冲液稀释后，每孔上样 20–40 μg 蛋白至 10% SDS-PAGE 凝胶中。</li>
	<li>以 20 mA 恒流电泳 1.5 小时。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，使用湿转系统以 85 V 恒压转膜 3 小时。根据目标蛋白的分子量调整转膜时间。</li>
	<li>用 5% 脱脂奶粉在室温下封闭膜 30 分钟至 1 小时。</li>
	<li>加入一抗，在 4 °C 过夜孵育。一抗的稀释比例通常在 1:200 至 1:5,000 范围内，需通过实验确定每种抗体的最佳稀释比例。本实验方案所用抗体的稀释比例详见“特定试剂与仪器表”。
	<ol>
		<li>若需检测剪接异构体，可使用特异性识别某一特定异构体的抗体；或者使用识别组成型外显子编码区表位的抗体，根据蛋白分子量的差异同时检测多种剪接异构体。</li>
		<li>同时，通过免疫印迹检测 EMT 标志物以监测上皮-间质转化过程。使用 E-钙黏蛋白、γ-连环蛋白和闭合蛋白作为上皮标志物，纤维连接蛋白、N-钙黏蛋白和波形蛋白作为间质标志物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 TBS-T（50 mM Tris，150 mM NaCl，0.05% Tween 20，pH 7.4）洗涤膜三次，每次间隔 5 分钟。</li>
	<li>加入 HRP 标记的二抗（1:10,000 稀释），室温孵育 1 小时。</li>
	<li>用 TBS-T 洗涤膜三次，每次间隔 5 分钟。</li>
	<li>使用化学发光检测系统显色，并将膜曝光于放射自显影胶片上。</li>
</ol>

<ol><li>Thiery, J. P., Sleeman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+networks+orchestrate+epithelial-mesenchymal+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 131-142 (2006).</li>
<li>Yang, J., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transition+at+the+crossroads+of+development+and+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transition at the crossroads of development and tumor metastasis.</a> Dev Cell. 14, 818-829 (2008).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+master+regulator+of+morphogenesis%2C+plays+an+essential+role+in+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">a master regulator of morphogenesis, plays an essential role in tumor metastasis.</a> Cell. 117, 927-939 (2004).</li>
<li>Batlle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+snail+is+a+repressor+of+E-cadherin+gene+expression+in+epithelial+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells.</a> Nat Cell Biol. 2, 84-89 (2000).</li>
<li>Cano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+snail+controls+epithelial-mesenchymal+transitions+by+repressing+E-cadherin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression.</a> Nat Cell Biol. 2, 76-83 (2000).</li>
<li>Comijn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two-handed+E+box+binding+zinc+finger+protein+SIP1+downregulates+E-cadherin+and+induces+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The two-handed E box binding zinc finger protein SIP1 downregulates E-cadherin and induces invasion.</a> Mol Cell. 7, 1267-1278 (2001).</li>
<li>Bolos, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Slug+represses+E-cadherin+expression+and+induces+epithelial+to+mesenchymal+transitions%3A+a+comparison+with+Snail+and+E47+repressors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Slug represses E-cadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions: a comparison with Snail and E47 repressors.</a> J Cell Sci. 116, 499-511 (2003).</li>
<li>Eger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DeltaEF1+is+a+transcriptional+repressor+of+E-cadherin+and+regulates+epithelial+plasticity+in+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">DeltaEF1 is a transcriptional repressor of E-cadherin and regulates epithelial plasticity in breast cancer cells.</a> Oncogene. 24, 2375-2385 (2005).</li>
<li>Shapiro, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+EMT-driven+alternative+splicing+program+occurs+in+human+breast+cancer+and+modulates+cellular+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">An EMT-driven alternative splicing program occurs in human breast cancer and modulates cellular phenotype.</a> PLoS Genet. 7, e1002218(2011).</li>
<li>Warzecha, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ESRP-regulated+splicing+programme+is+abrogated+during+the+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">An ESRP-regulated splicing programme is abrogated during the epithelial-mesenchymal transition.</a> EMBO J. 29, 3286-3300 (2010).</li>
<li>Brown, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+splice+isoform+switching+in+human+and+mouse+epithelium+is+essential+for+epithelial-mesenchymal+transition+and+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD44 splice isoform switching in human and mouse epithelium is essential for epithelial-mesenchymal transition and breast cancer progression.</a> J Clin Invest. 121, 1064-1074 (2011).</li>
<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li>
<li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).</li>
<li>Liu, S., Cheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+RNA+splicing+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+RNA%22%5BJournal%5D)">Alternative RNA splicing and cancer.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 4, 547-566 (2013).</li>
<li>Shtivelman, E., Lifshitz, B., Gale, R. P., Roe, B. A., Canaani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+RNAs+transcribed+from+the+human+abl+gene+and+from+the+bcr-abl+fused+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of RNAs transcribed from the human abl gene and from the bcr-abl fused gene.</a> Cell. 47, 277-284 (1986).</li>
<li>Krangel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+of+HLA-A+and+-B+antigens+via+an+alternative+RNA+splicing+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Secretion of HLA-A and -B antigens via an alternative RNA splicing pathway.</a> J Exp Med. 163, 1173-1190 (1986).</li>
<li>Brickell, P. M., Latchman, D. S., Murphy, D., Willison, K., Rigby, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+a+Qa%2FTla+class+I+major+histocompatibility+antigen+gene+is+a+general+feature+of+oncogenesis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of a Qa/Tla class I major histocompatibility antigen gene is a general feature of oncogenesis in the mouse.</a> Nature. 306, 756-760 (1983).</li>
<li>Barbaux, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+splice-site+mutations+in+WT1+are+responsible+for+Frasier+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Donor splice-site mutations in WT1 are responsible for Frasier syndrome.</a> Nat Genet. 17, 467-470 (1997).</li>
<li>Charlet, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+muscle-specific+chloride+channel+in+type+1+myotonic+dystrophy+due+to+misregulated+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Loss of the muscle-specific chloride channel in type 1 myotonic dystrophy due to misregulated alternative splicing.</a> Mol Cell. 10, 45-53 (2002).</li>
<li>Hutton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+missense+and+5%27-splice-site+mutations+in+tau+with+the+inherited+dementia+FTDP-17%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Association of missense and 5'-splice-site mutations in tau with the inherited dementia FTDP-17.</a> Nature. 393, 702-705 (1998).</li>
<li>Kohsaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+9+mutations+in+the+WT1+gene%2C+without+influencing+KTS+splice+isoforms%2C+are+also+responsible+for+Frasier+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">Exon 9 mutations in the WT1 gene, without influencing KTS splice isoforms, are also responsible for Frasier syndrome.</a> Hum Mutat. 14, 466-470 (1999).</li>
<li>Philips, A. V., Timchenko, L. T., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+splicing+regulated+by+a+CUG-binding+protein+in+myotonic+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Disruption of splicing regulated by a CUG-binding protein in myotonic dystrophy.</a> Science. 280, 737-741 (1998).</li>
<li>Savkur, R. S., Philips, A. V., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+regulation+of+insulin+receptor+alternative+splicing+is+associated+with+insulin+resistance+in+myotonic+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Aberrant regulation of insulin receptor alternative splicing is associated with insulin resistance in myotonic dystrophy.</a> Nat Genet. 29, 40-47 (2001).</li>
<li>Spillantini, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+in+the+tau+gene+in+familial+multiple+system+tauopathy+with+presenile+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Mutation in the tau gene in familial multiple system tauopathy with presenile dementia.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 95, 7737-7741 (1998).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myotonic+dystrophy+evidence+for+a+possible+dominant-negative+RNA+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Myotonic dystrophy evidence for a possible dominant-negative RNA mutation.</a> Hum Mol Genet. 4, 599-606 (1995).</li>
<li>Graubert, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+mutations+in+the+U2AF1+splicing+factor+in+myelodysplastic+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Recurrent mutations in the U2AF1 splicing factor in myelodysplastic syndromes.</a> Nat Genet. 44, 53-57 (2012).</li>
<li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+SF3B1+mutation+in+myelodysplasia+with+ring+sideroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Somatic SF3B1 mutation in myelodysplasia with ring sideroblasts.</a> N Engl J Med. 365, 1384-1395 (2011).</li>
<li>Yoshida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+pathway+mutations+of+splicing+machinery+in+myelodysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Frequent pathway mutations of splicing machinery in myelodysplasia.</a> Nature. 478, 64-69 (2011).</li>
<li>Mani, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epithelial-mesenchymal+transition+generates+cells+with+properties+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells.</a> Cell. 133, 704-715 (2008).</li>
<li>Reinke, L. M., Xu, Y., Cheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snail+represses+the+splicing+regulator+epithelial+splicing+regulatory+protein+1+to+promote+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Snail represses the splicing regulator epithelial splicing regulatory protein 1 to promote epithelial-mesenchymal transition.</a> J Biol Chem. 287, 36435-36442 (2012).</li>
<li>Serini, G., Gabbiani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+myofibroblast+activity+and+phenotypic+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation.</a> Exp Cell Res. 250, 273-283 (1999).</li>
<li>Zavadil, J., Bottinger, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+and+epithelial-to-mesenchymal+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">TGF-beta and epithelial-to-mesenchymal transitions.</a> Oncogene. 24, 5764-5774 (2005).</li>
<li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29, e45(2001).</li>
<li>Hellemans, J., Mortier, G., De Paepe, A., Speleman, F., Vandesompele, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((qBase+relative+quantification+framework+and+software+for+management+and+automated+analysis+of+real-time+quantitative+PCR+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data.</a> Genome Biol. 8, R19(2007).</li>
<li>Boutz, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+post-transcriptional+regulatory+switch+in+polypyrimidine+tract-binding+proteins+reprograms+alternative+splicing+in+developing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A post-transcriptional regulatory switch in polypyrimidine tract-binding proteins reprograms alternative splicing in developing neurons.</a> Genes Dev. 21, 1636-1652 (2007).</li>
<li>Salomonis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+regulates+mouse+embryonic+stem+cell+pluripotency+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing regulates mouse embryonic stem cell pluripotency and differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107, 10514-10519 (2010).</li>
<li>Calarco, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+vertebrate+nervous+system+alternative+splicing+and+development+by+an+SR-related+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of vertebrate nervous system alternative splicing and development by an SR-related protein.</a> Cell. 138, 898-910 (2009).</li>
<li>Grabowski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+takes+shape+during+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing takes shape during neuronal development.</a> Curr Opin Genet Dev. 21, 388-394 (2011).</li>
<li>Seol, D. W., Billiar, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+caspase-9+variant+missing+the+catalytic+site+is+an+endogenous+inhibitor+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A caspase-9 variant missing the catalytic site is an endogenous inhibitor of apoptosis.</a> J Biol Chem. 274, 2072-2076 (1999).</li>
<li>Srinivasula, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+endogenous+dominant-negative+short+isoform+of+caspase-9+that+can+regulate+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of an endogenous dominant-negative short isoform of caspase-9 that can regulate apoptosis.</a> Cancer Res. 59, 999-1002 (1999).</li>
<li>Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+Bcl-2-related+genes+functional+consequences+and+potential+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of Bcl-2-related genes functional consequences and potential therapeutic applications.</a> Cell Mol Life Sci. 61, 2189-2199 (2004).</li>
<li>Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+minigene+systems+to+dissect+alternative+splicing+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements.</a> Methods. 37, 331-340 (2005).</li>
<li>Cheng, C., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CD44+alternative+splicing+by+SRm160+and+its+potential+role+in+tumor+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of CD44 alternative splicing by SRm160 and its potential role in tumor cell invasion.</a> Mol Cell Biol. 26, 362-370 (2006).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文所述方法能够在可诱导的 EMT 模型中检测选择性剪接。因此，可在 EMT 的整个时间过程中捕捉剪接异构体表达的动态变化。该方法相较于使用不同代表上皮或间充质表型的细胞系进行选择性剪接比较具有优势，因为无关细胞系间不同的遗传背景可能对选择性剪接产生非特异性影响。然而，在得出有关选择性剪接变化的结论之前，必须使用多种 EMT 标志物谨慎确认 EMT 是否成功诱导。此外，除本文所述的 Twist-ER 可诱导 EMT 系统外，还建议采用其他 EMT 系统（如 Snail-ER 或 TGFβ 诱导的系统）对实验结果进行验证11,30。
EMT 过程中剪接异构体的转换可在 RNA 和蛋白质水平上检测到。对于蛋白质分析，优先使用剪接异构体特异性抗体。当缺乏异构体特异性抗体时，可通过免疫印迹结合 SDS-PAGE 上的分子量来确定剪接异构体的蛋白质水平。每个异构体的 RNA 水平可通过异构体特异性引物进行定量。利用 qRT-PCR 检测，可灵敏且精确地测定每个异构体的表达倍数变化。特别是当实验材料有限时，例如分析临床样本中特定剪接异构体的表达，qRT-PCR 分析可提供...

上皮-间充质转化（EMT）是一种发育程序，在胚胎发生过程中驱动器官形态发生和组织重塑。当异常激活时，EMT会促进肿瘤转移和器官纤维化1,2。大量研究描述了转录调控在EMT过程中的重要性，该过程由多个转录因子（如Twist、Snail和ZEB）定义，这些因子抑制黏附连接蛋白E-钙黏蛋白（E-cadherin）的表达，导致失去类似铺路石样的上皮形态，并获得纺锤形的间充质表型3-8。近期通过全基因组RNA分析的研究揭示，存在一组基因，其剪接模式与上皮或间充质表型相关9,10。我们实验室的工作在功能上将可变剪接与EMT联系起来。通过对细胞表面黏附分子CD44的研究，我们证明CD44的可变剪接在EMT过程中受到严密调控，更重要的是，CD44剪接异构体的转换在因果关系上促进了EMT的发生11。
选择性剪接是一种广泛存在且保守的基因调控模式，多达95%的人类多外显子基因会发生选择性剪接12-14。通过从单个基因产生多种蛋白质产物，选择性剪接构成了蛋白质多样性的关键机制，为人类基因组增添了另一层复杂性。因此，选择性剪接的失调可能引发显著的生物学效应，导致人类疾病的发生。事实上，异常选择性剪接在疾病中的作用已有十余年文献记载15-25，包括最近发现编码剪接体装置的基因突变在骨髓增生异常综合征中普遍存在26-28。因此，开发可靠的方法来检测选择性剪接的异构体，对于研究包括上皮-间质转化（EMT）在内的多种生物学过程具有重要意义。
本文提供了一种利用可诱导的上皮-间质转化（EMT）模型检测选择性剪接变化的实验方案。PCR引物设计及剪接异构体检测方法不仅适用于EMT过程中选择性剪接的研究，也适用于其他生物学过程中选择性剪接的分析。深入研究EMT过程中的选择性剪接对于更好地理解EMT机制及肿瘤转移过程至关重要，有助于推动针对癌症转移的有效治疗策略的开发。

<table><tbody><tr><td>4-羟基他莫昔芬</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td>将4-羟基他莫昔芬溶于乙醇中配制成200 &amp;#956;M的储存液。溶液于-20 &amp;#176;C避光保存。</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. 总RNA提取试剂盒</td><td>Omega Bio-Tek</td><td>R6731</td><td>总RNA提取试剂盒</td></tr><tr><td>GoScript反转录系统</td><td>Promega</td><td>A5001</td><td>qRT-PCR实验试剂</td></tr><tr><td>GoTaq qPCR预混液</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td>qRT-PCR实验试剂</td></tr><tr><td>LightCycler 480实时荧光定量PCR系统</td><td>Roche</td><td></td><td>qRT-PCR实验设备</td></tr><tr><td>CD44抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>BBA10</td><td>1:1,000稀释</td></tr><tr><td>E-钙黏蛋白抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4065</td><td>免疫印迹实验中1:2,500稀释；免疫荧光实验中1:50稀释</td></tr><tr><td>&amp;gamma;-连环蛋白抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2309</td><td>1:1,000稀释</td></tr><tr><td>闭合蛋白抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-5562</td><td>1:500稀释</td></tr><tr><td>纤维连接蛋白抗体</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610077</td><td>1:5,000稀释</td></tr><tr><td>N-钙黏蛋白抗体</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610920</td><td>1:2,000稀释</td></tr><tr><td>波形蛋白抗体</td><td>NeoMarkers</td><td>MS-129-p1</td><td>1:500稀释</td></tr><tr><td>GAPDH抗体</td><td>Millipore Corporation</td><td>MAB374</td><td>1:10,000稀释</td></tr><tr><td>Amersham ECL化学发光Western印迹检测试剂</td><td>GE Health Life Science</td><td>RPN2209</td><td>化学发光检测系统</td></tr></tbody></table>

上皮-间质转化过程中可变剪接的检测

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

选择性剪接在上皮-间充质转化（EMT）中发挥关键作用，EMT 是多种生理和病理过程中的重要细胞程序。本文介绍一种利用可诱导 EMT 模型检测 EMT 过程中选择性剪接的策略，该模型通过表达转录抑制因子 Twist 来诱导 EMT。EMT 的进程通过细胞形态的变化、细胞间连接处 E-钙黏蛋白定位的丧失，以及 EMT 标志物的转换表达来监测，例如上皮标志物 E-钙黏蛋白和 γ-连环蛋白的减少，以及间充质标志物 N-钙黏蛋白和波形蛋白的增加。利用亚型特异性引物组，通过定量 RT-PCR 分析目标 mRNA 的选择性剪接。相应蛋白亚型的产生通过免疫印迹实验进行验证。本文所述的剪接亚型检测方法也适用于其他生物学过程中选择性剪接的研究。

上述步骤为检测上皮-间质转化（EMT）过程中的可变剪接提供了一种可靠的方法。以下以Twist诱导的EMT过程中CD44剪接异构体转换的代表性结果为例进行说明。
在HMLE/Twist-ER细胞中，由Twist诱导的上皮-间质转化（EMT）表现为从类似铺路石的上皮表型转变为细长的成纤维细胞样表型（图2A），上皮标志物E-钙黏蛋白、γ-连环蛋白和闭合蛋白消失，同时间充质标志物纤维连接蛋白、N-钙黏蛋白和波形蛋白表达上调（图2B）。此外，通过观察细胞间连接处E-钙黏蛋白定位的丧失来评估EMT的发生（图2C）。
通过qRT-PCR和免疫印迹检测EMT过程中CD44剪接异构体的表达转换。人类CD44基因包含9个可变外显子。CD44的可变剪接使细胞能够产生至少包含一个可变外显子的CD44变异体（CD44v），以及不包含任何可变外显子的CD44标准型（CD44s）。图3A展示了用于检测不同CD44剪接异构体...

已证明可变剪接调控参与上皮-间质转化（EMT），EMT 是多种生理和病理过程中的重要细胞程序。本文介绍了一种利用可诱导 EMT 模型检测 EMT 过程中可变剪接的方法。

可变剪接在上皮-间质转化（EMT）中发挥关键作用，EMT 是一种重要的细胞程序，发生在多种……

以下实验的总体目标是检测上皮-间质转化（EMT）过程中选择性剪接的变化。该目标通过利用一种可诱导的EMT模型来实现，该模型在人乳腺上皮细胞中表达融合蛋白Twist-ER，在他莫昔芬处理的第二步中触发细胞发生EMT。通过使用特异性引物组进行定量逆转录聚合酶链式反应（R-T-P-C-R），分析剪接异构体的表达，从而揭示RNA水平上的选择性剪接变化。随后，通过免疫印迹法检测各剪接异构体对应蛋白的丰度，以确认剪接异构体在蛋白水平的表达。根据定量R-T-P-C-R和免疫印迹分析获得的结果，可观察到在上皮-间质转化（EMT）过程中目的基因的选择性剪接发生变化。该方法有助于回答RNA选择性剪接与EMT领域中的关键科学问题，例如EMT过程中选择性剪接的调控机制，以及该调控如何影响EMT及其相关病理过程。该技术的应用意义在于癌症治疗，因为EMT在促进肿瘤侵袭和转移中发挥重要作用。尽管该方法可为上皮-间充质转化（EMT）过程中的可变剪接提供见解，但这种针对特定异构体的MRA检测方法也可应用于其他系统，例如研究神经元分化过程中的可变剪接以及程序性细胞死亡。第一步是将表达Twist-ER融合蛋白的细胞接种至10厘米组织培养皿中，每组设两个重复；接下来，配制他莫昔芬溶液并避光保存，以诱导上皮-间充质转化（EMT）；用含有20 nmol/L他莫昔芬的培养基处理细胞，对于未使用他莫昔芬处理的对照组，则向另一组细胞中添加0.01%乙醇；在孵育两天后进行处理。在10倍放大倍数的光学显微镜下拍照，以记录任何形态学变化。接着，用预冷的PBS洗涤细胞。将培养板一半的细胞刮入RNA裂解缓冲液中用于RNA提取，另一半刮入100微升冰预冷的RIPA缓冲液中用于蛋白质分析。按照之前所示的方法对两组细胞进行传代，并持续用20纳摩尔他莫昔芬或溶剂处理。每隔一天重复这些步骤，直至第14天，此时经他莫昔芬处理的Twist ER细胞应呈现纺锤形的间充质形态，而经溶剂处理的对照组细胞则应维持类似鹅卵石的上皮形态。此处以一个包含四个外显子的pre-mRNA为例，用于检测外显子的包含情况。在可变外显子三内设计一条正向引物，在邻近的组成型外显子四内设计一条反向引物，以特异性扩增包含可变外显子三的剪接异构体，从而特异性检测外显子跳跃事件。同时设计跨越组成型外显子二与外显子四连接区域的引物，该连接区域在可变外显子三被保留时将不复存在。在组成型外显子四内设计另一条引物，以检测该基因的全部转录本，并避免扩增自基因组DNA或前体mRNA的PCR产物。准备就绪后，在两个组成型外显子内设计引物。按照标准RNA提取流程，从先前收集的细胞样本中分离RNA。通过紫外吸收法测定RNA的浓度和质量，用于合成第一链cDNA，在20微升终体积中建立逆转录反应。在42摄氏度下进行逆转录反应1小时，随后在70摄氏度下孵育5分钟。为使逆转录酶失活以用于实时PCR，设置20微升反应体系，其中包含10微升SYBR Green预混液、0.1至1.0微升cDNA模板以及各5皮摩尔的正向和反向引物。进行40个循环的实时PCR实验，每个样本设三个复孔。检查解离曲线，确保每对引物均仅出现单一峰。通过计算扩增曲线的二阶导数来获得定量循环值。使用ΔΔCQ法（公式如下所示）计算诱导样品中目标mRNA相对于未诱导样品的相对含量。将用于蛋白质分析的细胞置于冰上约10分钟，然后离心并收集上清液。测定蛋白质浓度后，用SDS上样缓冲液稀释样品，并将20至40微克蛋白质加入10% SDS-PAGE凝胶中。以20毫安电流运行SDS-PAGE凝胶电泳1.5小时。电泳结束后，在湿转系统中以85伏电压、4摄氏度条件下将蛋白质转移至PVDF膜上，转移时间为3小时。根据目标蛋白的分子量调整转移时间。接着，用5%脱脂牛奶在室温下封闭膜30分钟至1小时。随后将膜在4°C下与一抗孵育过夜。该一抗可识别组成型外显子包被区域中的表位，并根据蛋白大小的不同同时检测Slic异构体。同时，通过免疫印迹法监测 EMT。对于 EMT 标志物，使用 eec、ahern、γ-连环蛋白和闭合蛋白作为上皮标志物，使用纤连蛋白、N-钙黏蛋白和 menton 作为间充质标志物。次日，用 TBST 间隔 5 分钟洗涤膜三次。接着，将膜与 HRP 偶联的二抗以 1:10,000 的稀释比例在室温下孵育 1 小时。孵育结束后，再次用 TBST 间隔 5 分钟洗涤膜三次。最后，使用化学发光检测系统显影蛋白质，并将膜暴露于自动放射自显影胶片上。由扭转诱导的上皮-间质转化（EMT）表现为从类似铺路石样的上皮表型转变为细长的成纤维细胞样表型，表现为上皮标志物E-钙黏蛋白、γ-连环蛋白和闭合蛋白的缺失，以及间充质标志物纤连蛋白、N-钙黏蛋白和波形蛋白的上调。此外，通过观察细胞间连接处E-钙黏蛋白定位的丧失来评估EMT。以下是用于检测 CD44 剪接异构体的引物设计。不同颜色的箭头表示引物的位置。定量逆转录聚合酶链反应（QRT-PCR）分析结果表明，在 TAM 处理 14 天后，CD44 V mRNA 显著减少，而 CD44 s mRNA 增加。相比之下，在 EMT 过程中，CD44 的总转录本保持不变，这与 Q-R-T-P-C-R 的结果一致；然而，CD44v 蛋白水平显著下降，而 CD44s 蛋白的表达则大幅上调。在进行该操作时，必须牢记成功诱导 EMT 至关重要。因此，必须通过多种方法谨慎验证 EMT 是否成功，例如检测细胞形态的变化、EMT 标志物的表达以及 RIN 在细胞表面的定位。在完成本实验步骤后，可进一步开展其他方法，如剪接报告基因检测分析，以回答更多相关问题，例如：这些顺式作用元件和反式作用因子在发育完成后如何影响可变剪接的调控？该技术为RNA生物学、发育生物学和癌症生物学领域的研究人员探索正常发育及癌症转移过程中上皮-间质转化（EMT）的可变剪接调控机制奠定了基础。

detection-alternative-splicing-during-epithelial-mesenchymal

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

检测选择性剪接的过程中上皮 - 间质转化

本文描述了一种在多种细胞类型中诱导上皮细胞向间充质细胞转化（EMT）的简便方法，并包含了通过免疫细胞化学分析处于EMT状态细胞的方法。...

上皮间质转化的诱导与分析

本文描述了一种旨在研究异常剪接对实体瘤和血液系统恶性肿瘤耐药性影响的实验方案。为此，我们分析了亲本株和耐药株的转录组谱型 体外...

利用RNA测序检测与药物耐药性相关的新剪接变异体 体外 癌症模型

本报告介绍了一种生物工程技术，用于设计和构建新型人工剪接因子（ASFs），以特异性调控哺乳动物细胞中靶基因的剪接过程。该方法可进一步拓展，用于构建多种人工因子，以操控RNA代谢的其他方面。...

在人类细胞中设计人工因子以特异性调控选择性剪接

本文介绍一种基于过表达miR-200家族成员与grainyhead样2（GRHL2）来诱导肉瘤细胞发生间充质-上皮转化（MET）的细胞培养方法。该方法适用于深入理解表型可塑性对癌症侵袭性及治疗反应的生物学影响。...

肉瘤细胞中诱导间充质-上皮转化

利用RNA对小鼠脑切片中pre-mRNA选择性剪接进行定量分析 原位 杂交实验

我们描述了一种系统性工作流程，通过研究TGF-β信号通路中涉及的蛋白和基因表达，来探究TGF-β信号传导及TGF-β诱导的上皮-间质转化（EMT）。该方法包括蛋白质印迹（Western...

研究乳腺癌及正常细胞中TGF-β信号通路与TGF-β诱导的上皮-间质转化

本方案提供了一种快速且实用的工具，用于评估在化疗处理后功能尚未明确的蛋白质在选择性剪接调控中的作用。...

利用E1A微基因工具研究mRNA剪接变化

我们描述了通过观察细胞形态变化以及利用免疫荧光染色检测内皮-间质转化（EndMT）相关标志物表达变化，来研究TGF-β2诱导内皮细胞发生EndMT的方法。同时介绍了CRISPR/Cas9基因编辑技术，并用于敲除编码Snail的基因，以探究其在TGF-β2诱导EndMT过程中的作用。...

TGF-β介导的内皮细胞向间充质细胞转化（EndMT）及利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对EndMT效应分子的功能评估

可变剪接（AS）和可变多聚腺苷酸化（APA）能够扩展转录本异构体及其产物的多样性。本文中，我们描述了用于分析整体RNA测序（bulk...

RNA-seq 数据中可变剪接与多聚腺苷酸化位点的鉴定

明暗交替实验是测量小鼠焦虑样行为最常用的实验方法之一。本文展示了一段视频，详细介绍了我们进行该实验的具体操作步骤。...

小鼠明暗转换实验

了解利用可诱导EMT模型检测人乳腺上皮细胞中选择性剪接变化的方法。通过定量RT-PCR和免疫印迹技术分析剪接异构体表达，揭示EMT过程中的RNA调控机制，为癌症治疗研究提供重要依据。

上皮-间质转化过程中可变剪接的检测

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