使用 E1A 微型工具研究 mRNA 拼接更改

本协议提供了一个快速和有用的工具，用于评估化疗后在替代拼接调节中具有非同寻常功能的蛋白质的作用。

本协议的总体目标是提供详细的指导，以便使用微型 E1A2 来评估全球 mRNA 拼接变化。这是一个快速、廉价和简单的工具，用于评估目标蛋白在替代拼接调节中的功能，而无需特殊制度或实验室条件。首先培养具有稳定表达兴趣基因的 HEK 293 细胞。

使用0.25%的EDTA将细胞分割，然后在6井板中每井镀30万个细胞，在37摄氏度的5%二氧化碳中孵育24小时。24 小时后，检查汇合，并在 70 到 80% 汇合时转染 HEK 293 稳定细胞。用移液器小心地去除细胞培养介质，然后加入两毫升完整的DMEM介质，不含抗生素，并将板放回孵化器中。

用透射缓冲器准备一根管子，然后加入两微克pMTE1A DNA、涡流，并加入两微升转染试剂。再次漩涡，在室温下孵育10分钟。从孵化器中取出板，小心地加入转染混合物。

转染后六小时，将四环素添加到 HEK 293 稳定细胞中，用于 Nek4 表达感应。转染后24小时，使用荧光显微镜验证细胞形态和转染效率。使用移液器去除细胞培养介质，然后使用化疗添加细胞培养介质。

再孵育细胞24小时。要收集RNA，丢弃细胞培养基，并直接向井中加入0.5至1毫升RNA提取试剂。如果油井非常汇合，请使用一毫升RNA提取试剂来改善RNA质量。

用移液器使细胞同质化，并将其转移到1.5毫升离心机管中。立即进行RNA提取，或将样品储存在零下80摄氏度。将样品解冻在烟气罩中，在室温下孵育五分钟。

加入0.1至0.2毫升氯仿，大力搅拌，然后在室温下孵育3分钟。离心机在12，000倍G和4摄氏度下15分钟，然后收集上水相并转移到一个新的1.5毫升离心机管。收集约60%的总体积，但不收集DNA或有机相。

加入0.25至0.5毫升的等丙醇，通过倒置四次搅拌样品。在室温下孵育10分钟，然后在12，000次G下离心，在4摄氏度下孵化10分钟，并丢弃超高纳特。用乙醇清洗RNA颗粒两次，离心机用7，500次G清洗5分钟，然后丢弃乙醇。

将多余的乙醇倒置在纸巾上，然后将管子放在烟罩内打开，将颗粒部分干燥5至10分钟。将RNA颗粒重新悬浮在DEPC处理水的15微升中。通过测量 230、260 和 280 纳米的吸收量来量化总RNA 并验证 RNA 质量。

为了验证RNA总质量，使用2.5%的次氯酸钠溶液的1.2%预处理1%的玫瑰凝胶，持续30分钟。使用总RNA的一到两微克执行 cDNA 合成。将RNA、一个寡头d-T微升、一个DNTP微升和无核酸酶水组合到12微升。

在65摄氏度的温度下，在热循环器中孵化反应5分钟。从热循环器中取出样品，加入四个反转录酶缓冲器的微升、DTT 的两个微升和核素酶抑制剂的一个微升。在37摄氏度下孵育两分钟。

加入一微升热稳定反转录酶，在37摄氏度下孵育50分钟。在 70 摄氏度下灭活酶 15 分钟。执行文本手稿中描述的 PCR，然后将 PCR 产品的 20 到 25 微升加载到含有核酸污渍的 3%玫瑰凝胶上，然后以 100 伏特的速度运行约一小时。

拍摄凝胶，避免任何带饱和，并使用图像处理软件量化带。631、493 和 156 基对的波段分别对应于 13S、12S 和 9S 等同形。从软件的文件菜单，打开图像文件，并将其转换为灰色刻度。

调整亮度和对比度，必要时消除离群值噪声。使用矩形选择工具在第一车道周围绘制矩形，然后通过分析、凝胶和选择第一车道命令或使用键盘快捷方式选择它。使用鼠标单击并按住第一车道上的矩形中间，然后将其拖至下一条车道。

去分析，凝胶，并选择下一个车道。对于所有剩余车道重复此步骤。在突出显示和编号所有车道后，请前往分析、凝胶和情节车道，绘制每个车道的轮廓图。

使用直线选择工具绘制一条线穿过每个峰值的基座，对应于每个波段，排除背景噪声。在关闭所有车道的峰值后，选择魔杖工具并单击每个峰值内。每个高亮峰值的结果窗口中应弹出测量结果窗口。

仅考虑 13S、12S 和 9S 峰值，对应于 631、493 和 156 基对频段。复制电子表格编辑器的强度数据，并汇总每个样本的所有三个频段的强度，然后计算每个等形体相对于总数的百分比。绘制每个等形的百分比，或相对于未经处理的样本的百分比差异。

含有E1A微基因的质粒用于通过评估每个同位素产生的mRNA比例来观察对替代拼接的影响。E1A 等形变异的基础表达取决于 E1A 表达的细胞线和时间。HEK 293 稳定细胞系（HEK 293 重组包含站点）与 HeLa 细胞相比显示较高的 13S 表达，但在 E1A 表达 48 小时后显示类似级别的 13S 和 12S 等形。

暴露在顺铂下的细胞显示，5个优质S-S拼接选择的转变有利于12S表达。这种效果在 HEK 293 中观察到稳定地表示旗空矢量，以及 Nek4 中的等形之一。在帕利塔塞尔治疗后，替代拼接的变化是非常谨慎的，但变化的方向在旗和Nek4表达细胞相反。

执行此协议时，使用未翻译和非反向转录酶控制以避免对内源性 E1A 表达的误解非常重要，主要是在使用 HEK 293 细胞时。获得阳性结果后，可以评估与化疗反应相关的特定基因的替代拼接。观察到某些效果后，这种简单的协议可以引导这些研究获得更一致的通路，例如，蛋白质在调节化疗反应中的替代拼接方面发挥作用。