一个离体激光诱导脊髓损伤模型，以评估轴索变性的机制在实时
November 25th, 2014
我们提出了一种利用双光子激发延时显微镜同时实时可视化轴突和髓鞘损伤动力学的方案。该拟议的方案允许研究内在和外在因素，这些因素可以影响受伤后中央髓鞘轴突的命运并导致永久性临床残疾。
以下实验的总体目标是实时评估急性轴突变性机制。这是通过分离大腿一个 YFP 阳性神经和脊髓组织，同时不断用含氧低钙人工脑脊髓液灌注组织来实现的。然后在保持生理条件的同时，在双光子显微镜物镜下对脊髓组织进行排列，并用亲脂性荧光染料尼罗红对髓鞘进行染色。
接下来，通过调整激光功率在背柱的背表面创建一个微小的病变，以便横切柱内的有髓轴突。结果显示，基于图像的定量测量，受损轴突回缩、轴突周围、髓鞘肿胀和其他细胞反应。因此，与现有方法相比，这种技术的主要优点是我们使用整个颈椎，因此背柱纤维保持完整。
因此，这避免了对下面的中央髓鞘纤维的损伤，这通常发生在白质条带制备过程中。演示该程序的是 Starlin ada 博士，他是我实验室的博士后研究员，他真正倡导这项技术 为心内灌注做准备。用两倍浓缩的 BNC 原液制备低钙、人工脑脊髓液或 A CSF，以丰富离体脊髓。
在成像过程中，在玻璃瓶中用两倍储备溶液 A 和 B 制备正常 A CSF。提供 pH 值为 7.4 的溶液。将低钙 A CSF 保持在解剖区域附近冷却，并将正常 A CSF 保持在显微镜附近的室温下。
使用前将两种溶液与汽车和气体一起鼓泡半小时，并在使用时连续鼓泡。接下来，准备开放式浴灌注室进行成像。首先，将在线加热器金属输出连接到腔室。
然后用大量粘性材料将成像室粘附到溢出室上，以便有可能稍微调整成像室的位置。将在线加热器反馈温度探头固定在液体入口附近，并将不锈钢抽吸管固定到腔室出口处的真空管线上。现在打开真空泵和灌注泵。
一旦腔室充满 A CSF，将泵的剂量降至每分钟 1.5 至 2 毫升。然后通过真空管路的位置控制腔室内的 A CF 体积。调整 6 至 10 周龄 TH 1 只 YFP 转基因小鼠的安乐死。
首先，确认没有反射性的脚趾捏合反应。然后剃掉覆盖脊髓和大脑的区域。剃须后，用 Betadine 和 70% 乙醇擦拭裸露的皮肤。
现在用 70% 乙醇喷洒胸部和腹部区域，并用碳水化合物气泡低钙 A CSF 灌注动物 trans Cardi。当肝脏开始变白时，用夹子将灌注针连接到心脏。然后将动物翻过来，用 70% 乙醇擦拭背皮侧。
从鼻子到臀部沿中线切开，露出颅骨帽和椎骨上方的组织。使用别针拉开皮肤，将动物固定在鼻子和臀部。现在将准备工作移至解剖显微镜中，用剪刀在颅骨背表面的嗅球水平上牢固地剪开。
将剪刀尖端插入新制作的切口中，并沿着颅骨帽的两个边缘剪开，露出小脑。不要完全切除颅骨帽。提起露出大脑的颅骨帽，小心地切开小脑上方顶骨的左右边缘。
现在，在轻轻拉动颅骨帽和背椎柱表面的同时，在后神经根下方进行切割，以进一步暴露脊髓。然后使用细尖剪刀，小心地双侧剪断椎骨。在 45 度角时，避免损坏背柱至关重要。
这些亮白色的纤维很容易损坏，不小心，在切割椎骨的同时继续轻轻地将切除的骨骼和肌肉拉回。切开 1 到 2 厘米以分离适合成像的一段颈脊髓组织。然后用剪刀剪下平行于脊柱的组织和骨骼。
还要清除色谱柱下方的组织。使这些切口尽可能水平，因为组织平放在腔室水平上以进行成像非常重要。最后，使用 11 号手术刀在草 ulu 纤维末端和上胸
水平上横切脑干。然后用剪刀剪开这两个点的组织和骨骼。分离的组织应包含脊柱的三分之二，包括脊髓脑干、颈椎扩大和上胸脊髓。将分离的脊柱转移到离体成像室，并在接下来的一小时内逐渐将灌注 8 温度提高到 36 到 37 摄氏度之间。
在成像过程中保持此温度。该协议的一个关键方面是确保您在不损坏背柱纤维的情况下隔离脊髓。该协议的第二个最关键的方面是确保脊髓持续灌注含氧人工脑脊髓液。
使用改良的组织载玻片架，小心地将脊柱固定在腔室中。重要的是要避免触摸暴露的脊髓、背柱，或用类似线对它们施加压力。现在要对髓鞘进行染色，请短暂停止溶液流动并移除真空管路。
在脊髓的绳端附近添加 5 至 10 微升 5 毫摩尔尼罗红染料。然后在整个成像室中轻轻混合溶液，让组织孵育一两分钟。染色后，将含氧 A CSF 的流速恢复到每分钟 1.5 至 2 毫升之间，并使用双照相显微镜更换真空管路。
使用水浸物镜对脊髓进行成像。慢慢将物镜降低到 A CSF 表面，然后在 AF 荧光灯下使脊髓聚焦。现在切换到扫描模式，对上升的草进行基线成像。
Oculus 有髓纤维。为了激发 YFP 和尼罗红，将激发设置为 950 纳米，并使用 DI chronic 和 bend pass 滤光片隔离荧光发射。如果在成像后一小时内，您注意到超过 3% 的轴突含有类固醇，则意味着脊髓在隔离过程中受损。
现在最好丢弃制剂 用激光伤害组织。首先，找到组织中看起来水平的区域。然后将查看区域放大倍率增加到 30.3 倍。
将激光器调谐到 800 纳米，并将其功率增加到约 110 毫瓦。现在执行五次视野激光扫描。结果应该是完整的 20 微米直径消融。
在标准成像设置下，使用 17 毫瓦和 20.08 倍放大倍率的激光检查损伤。如果消融时的轴突纤维未完全横切，则丢弃制剂。现在，将延时设置与 Z 捕获结合使用，以制作动态损伤反应记录。
制备物可以成像长达 24 小时。脊髓节段被分离并按照基线 T-P-L-S-M 所述定位。记录显示有髓草关节撒克逊为平行排列的 YFP 阳性轴突在鞘中 dinar 红色染色的髓鞘，带有少量轴突类固醇或其他轴突变性的形态学迹象。
可以看到精细的细节，例如箭头突出显示的 ROM VA 的鼻子。激光诱导脊髓损伤后 40 分钟后。大多数横断的轴突形成特征性的轴突末端球，从损伤部位缩回，与损伤部位相邻的轴突发生继发性变性，轴突肿胀变得更加突出。
与季度回缩纤维不同，位于病变和类固醇远端的大多数回缩轴突末端球都用尼罗红强烈标记，表明轴突内的环境发生了变化。7 小时时，轴突继续从病变部位缩回。然而，这在位于病变远端或嘴部的末端球茎中比位于病变近端或绳状的末端球茎中更明显。
最终，最初幸免于难的轴突逐渐经历了延迟的继发性变性。观看此视频后，您应该对如何隔离神经和脊髓并进行激光诱导的脊髓损伤有很好的了解。因此，您将能够实时检查原发性和继发性轴突变性的动态方面。
从使用该模型系统获得的信息可能会导致对受伤后轴突和髓鞘损伤的重要机制理解。
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概述
本研究提出了一种利用双光子激发时间推移显微镜实时可视化轴突和髓鞘损伤的协议。该方法允许评估影响损伤后髓鞘轴突命运的内在和外在因素。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 显微镜学
- 轴突退化
背景
- 了解轴突退化机制对于解决临床障碍至关重要。
- 双光子显微镜提供了一种独特的方法来研究这些动态。
- 实时可视化可以增强我们对损伤反应的理解。
- 在损伤背景下，髓鞘在轴突健康中的作用非常重要。
研究目的
- 实时评估急性轴突退化机制。
- 可视化轴突和髓鞘损伤的动态。
- 探索影响损伤后轴突命运的因素。
使用的方法
- 分离YFP阳性神经和脊髓组织。
- 用氧化低钙人工脑脊液灌流。
- 在双光子显微镜下对脊髓组织进行对齐。
- 用尼罗红染料染色髓鞘。
主要结果
- 观察到受损轴突的收缩。
- 检测到轴突周围的髓鞘肿胀。
- 定量测量细胞反应。
- 实验期间保持背柱纤维。
结论
- 该协议允许全面研究轴突损伤动态。
- 实时成像提供了对细胞对损伤反应的洞察。
- 该方法通过保持组织完整性，比现有技术具有优势。
常见问题
Executive Industry Relevance
This ex vivo spinal cord injury model enables real-time visualization of axonal degeneration mechanisms, providing a controlled system to dissect primary and secondary injury pathways. By preserving dorsal column integrity and allowing precise environmental manipulation, the model supports mechanistic de-risking in neurotherapeutic target validation. The approach offers predictive value for screening compounds that modulate axonal retraction, myelin integrity, or secondary degeneration processes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by distinguishing primary axonal transection from secondary degeneration mechanisms in real time.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for functional target validation using quantitative imaging of axonal retraction and myelin swelling.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that delay axonal end bulb formation or reduce peri-axonal degeneration.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantifiable readouts of axonal integrity and myelin dynamics for compound screening campaigns.
- Reproducibility: Controlled laser injury and perfusion system ensure consistent lesion parameters across replicates.
- Scalability: Compatible with time-lapse imaging and pharmacological perfusion for medium-throughput mechanistic screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models clinically relevant axonal pathologies including spheroid formation, retraction, and myelin degeneration observed in spinal cord injury.
- Translational Continuity: Bridges discovery mechanisms to preclinical validation by enabling real-time assessment of neuroprotective or remyelinating candidates.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports go/no-go criteria based on inhibition of secondary axonal degeneration or preservation of myelin integrity.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for neuroprotective and axon-sparing strategies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of axonal degeneration pathways and mechanistic clarification of injury responses.
- Screening: Enables assay development with quantitative endpoints such as axonal retraction velocity and myelin integrity loss.
- Analytics: Provides high-content imaging data for statistical comparison of treatment effects on axonal and myelin dynamics.
- Translational Research: Connects acute axonal responses to delayed degeneration processes relevant to chronic neurodegeneration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for multiple neurotherapeutic programs targeting axonal stability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in axonal injury models by isolating primary from secondary degeneration events.
- Operational Value: Standardized perfusion and injury protocol ensure reproducibility across laboratories and time points.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, mechanism-based efficacy signals in axonal preservation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds that demonstrate real-time protection against axonal retraction or myelin damage.
Implementation Considerations
- Expertise in two-photon microscopy and live tissue imaging is required for successful implementation.
- Instrumentation includes a tunable laser, water immersion objective, and perfusion system capable of maintaining physiological temperature and flow.
- Cross-team standardization is needed for injury parameters, dye staining protocols, and quantitative image analysis pipelines.
- Adaptation to disease models requires validation of transgenic reporters and injury relevance to specific pathophysiological contexts.
- Practical limitations include the 24-hour imaging window and the need for ex vivo tissue viability maintenance throughout experiments.
