在体光学钙成像观察学习诱导的突触可塑性在 Drosophila melanogaster 中的研究

该技术可实时观察黑腹果蝇中突触钙活动，以此作为学习与记忆形成相关细胞过程的生理参数。通过比较果蝇在关联训练前后对气味的神经元反应，我们能够直接关联突触活动与单个果蝇中记忆痕迹的形成。为获得转基因果蝇，使特定目标神经元表达基因编码的钙指示剂，需将携带目标GAL4和UAS构建体的雌性处女蝇与雄蝇杂交，并将雌性子代培养至羽化后3至6天。

为准备果蝇成像，使用精细镊子将经冰麻醉的果蝇放入定制的成像室中。在解剖显微镜下调整果蝇胸部和足部，使其与成像室底部的金属导线接触，并使头部平躺。用透明胶带将果蝇固定在位，再使用外科手术刀片在头部周围的胶带上切出一个窗口，保留触角被胶带覆盖，仅暴露胸部最前端的部分。

使用由凹凸钳夹持的昆虫针，将蓝色光固化胶小心地围绕果蝇头部的侧面和背面。然后使用蓝色LED灯照射以固化胶水。待胶水完全固化后，清除果蝇头部背侧残留的未硬化胶水，并在头部暴露的角质层上滴加一滴林格氏液。

使用刃口极细的刺刀，从后头的单眼处开始，沿头部后部切开角质层，并沿眼内侧向上两侧切割，形成一个可用镊子轻易撕去的角质层瓣。去除可能遮挡目标脑区的多余角质层，并用精细镊子小心清除背侧表面的任何气管，注意避免损伤脑组织本身。根据需要移除并更换任氏液，以清除区域内的组织碎片。

将一根皮下注射式气味递送针头放置在果蝇头部约一厘米处，注意确保没有任何物体阻碍气味传递至触角。然后通过该皮下注射式气味递送针头将成像室与气味递送系统连接。让果蝇恢复10分钟，以从麻醉和手术中苏醒。

为了可视化基于GFP的钙离子指示剂，调节安装在防震台上的多光子显微镜的激光器，该显微镜配备红外激光器和水浸物镜，将激发波长调至920纳米，并安装GFP带通滤光片。使用粗调Z轴调节旋钮，沿脑组织的Z轴方向扫描，以定位目标脑区。利用裁剪功能将扫描范围聚焦于目标区域，以缩短扫描时间。

然后旋转扫描视图，使头部的前部朝下。接着将帧大小调整为 512 × 512 像素，并选择待扫描的区域。根据每帧的计算扫描时间，确保帧速率达到至少 4 赫兹。

为了观察气味诱发的钙瞬变，启动一个预设的宏程序包，该程序包能够连接图像采集软件与气味递送程序，并在显微镜软件中开始持续6.25秒的测量，以建立F0基线值。在气味递送系统中，递送持续2.5秒的气味刺激，此处通过特定气味杯阀门开启和关闭时触发LED灯亮起作为指示。气味刺激结束后，继续记录12.5秒。

然后以相同方式重复递送第二种和第三种气味物质。在此装置中进行关联性条件化时，使用计算机控制的气味递送系统，在60秒内呈现条件刺激-阳性气味，同时施加12次90伏电击。经过60秒的间歇后，单独呈现条件刺激-阴性气味60秒，不施加电击。

在训练阶段结束后三分钟，通过重复训练前的气味刺激方案，再次测量训练后气味诱发的钙瞬变。然后将成像文件以适当的格式保存，用于后续图像分析。此处可观察到按照上述方法获取的代表性蘑菇体输出神经元图像。

特异性定位于区室的 dHomer-GCaMP3 传感器在神经元的轴突区室中不表达，因此在树突区室中呈现出点状信号。在表达 dHomer-GCaMP3 的果蝇中，尽管信号幅度较低，但仍可观察到清晰的气味反应，而相比之下，表达胞质 GCaMP6f 的果蝇则表现出更强的响应。此处展示了一只单个果蝇的代表性钙信号轨迹，反映了不同个体样本之间在噪声水平和信号幅度上可能存在的差异。

该技术使得在亚细胞水平上观察嗅觉表征如何被调节，以及记忆阶段如何通过条件刺激形成成为可能。这类实验对于拓展我们对复杂脑结构（如蘑菇体）的理解，以及阐明关联性记忆如何在分布式的神经元群体中存储至关重要。