的发展在体外模型研究的交互系统雅科仕 caballus以其高亲和力受体了FcεRI的IgE
2014年11月1日
本研究描述了基于大鼠嗜碱性白血病细胞与马 FcεRIα 基因转染的基因工程检测系统的开发和应用。转染的细胞表达一种功能性受体，其中过敏反应介质的释放可被 IgE 和抗原激活。
以下实验的总体目标是测量 RAD 嗜碱性粒细胞白血病细胞释放的 IgE 依赖性介质的数量。过敏症状是由组胺等介质的释放引起的。现在，组胺并不是嗜碱性粒细胞释放的唯一介质是肥大细胞。
这些细胞释放的所有介质的总和导致速发型和迟发型超敏反应的体征和症状。现在，人类并不是唯一患有过敏症的生物，狗和马也患有过敏症。为了进一步发展研究并找到针对过敏的治疗方法，例如疫苗，需要进行释放测定来量化研究治疗中释放的介质量（如果有）。
这就是这种释放测定的原因。用于人体系统的 RBL 介质释放检测试剂盒由 Ian 和 Hook 于 1986 年首次开发并发表。它后来是为 DOC 系统开发的，现在是为 horse 系统开发的。
修饰就像改变目标蛋白质一样简单。细胞系新闻是大鼠巴索白血病或 RBL 两个 H 3.1 细胞系，表达马高 FNT ffc 丝氨酸 R 一个受体 α 链，细胞密度为每毫升 500， 000 个细胞。添加目标 IgE 抗体至终浓度为 1 ng/mL。
将 100 微升混合物加入 96 度的土壤板中，并在 16 度下孵育 37 小时。这使得细胞能够粘附在孔表面，并且抗体与其受体洗涤液结合。将含有剩余未结合抗体和死细胞的培养基与 100 μL 温热的 37 度释放缓冲液加倍。
丢弃上次洗涤的缓冲液，并用 100 μL 目标浓度的目标抗原替换。在 37 度孵育 20 分钟后，将 50 微升含有释放介质的 SUP natin 转移到新孔中，并用 50 微升 Triton X 缓冲液替换剩余的上清液以溶解细胞并释放细胞内剩余的介质。在 50 μL 的 200 万摩尔 β hx 中。
底物溶于柠檬酸盐缓冲液中多年。在 37 度孵育 2 小时后，向每个孔中加入 150 微升 tris 缓冲液，使孔变黄。16 小时后测量 405 纳米处的颜色吸光度。
将释放测定缓冲液（也称为 Ian 缓冲液）加热 37 度。还要在释放缓冲液中以浓度制备抗原的浓度梯度。零 0.1 1 10、100、1000 和 10， 000 纳克/毫升。
然后升至 37 度。通过快速轻弹培养皿以去除培养基来清洗孔，然后向孔壁轻轻添加 100 微升温释放缓冲液。这是为了减少温差引起的细胞压力，温差会导致它们过早释放介质。
盘子应该洗两次。弃去最终释放缓冲液，洗涤并加入 100 微升抗原，从 A 行的抗原浓度为零开始为阴性对照，然后沿着浓度梯度从 B 行到 G 行，最后到 Triton X 切片，在 H 行缓冲。将板在 37 度下孵育 20 分钟。
这是细胞在孵育期后释放介质的点。将每个孔中的 50 μL 液体转移到各自的孔中。在第 7 至 12 列，将第 1 至第 6 位的剩余液体完全挤出并丢弃，并替换为 50 微升 Triton X 裂解缓冲液。
将 50 微升制备的底物添加到培养皿的所有 96 个孔中。在 37 度下孵育 2 小时。β H，很多天将底物转化为四种硝基苯酚。
孵育期后，加入 150 μL tris 缓冲液终止反应，将四种硝基苯酚变成黄色。使用 405 纳米的板分光光度计读取板。测量吸光度数据后，通过乘以计算孔位置 A 中细胞内的介质总数。
它在位置 a 乘 2 的 7 对应的井，并将结果与 1 处的值相加。这是因为在实验过程中，当我们将其转移到新的井对立物中时，我们有包含释放介质对立物 A 的螺旋体。一个 7。
对其余的井重复计算。通过将 A 7 位置值乘以 2，从计算出的细胞内总介质中释放介质的百分比 A 7 中计算出来。同样，因为在实验过程中，我们有包含 Reese 介质的 supernat。
当我们将其转移到一个新的中时，然后将该乘积乘以 100，然后将该乘积除以该位置的细胞内介质的相应总值。这给出了膨胀的释放介质的百分比。对其余的孔重复计算，因为每行中的六个膨胀受到相同浓度的抗原平均值的挑战。
这些值并计算标准差将这些值绘制在图表上，如下所示。该图显示，随着抗原浓度的增加，释放出更多的介质，直到达到每毫升 100 纳克的峰值，之后介质释放随着抗原浓度的增加而减少。最终的实验结果应如图 B 所示，浅蓝色的对照释放测定不含 IgE 抗体，因此显示介质释放随抗原浓度的增加而没有变化。
将此结果与深蓝色的实验结果进行比较，深蓝色可能含有 IgE 抗体。这是正在进行安全性测试的抗 IgE 疫苗的一个例子。从这张红色的图表中可以清楚地看出，抗 IgE 血清与细胞表面的受体交联，导致 RBL 细胞脱颗粒，就像在紫色的阳性对照中看到的那样，与灰色的阴性对照相比，使这种疫苗不安全。
该测定非常有用，因为它可以测量介质释放或其滞后性，当测试潜在的抗过敏药物或疫苗也可以适用于人类犬或马系统时，该测定可以确定在测试抗过敏抗体时成功阻断或不成功阻断介质释放。
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概述
本研究重点关注一种基因工程测定系统，利用转染了马Fc蔚RI伪基因的大鼠嗜碱性白血病细胞。该系统允许测量对IgE和抗原的介质释放反应，这对理解过敏反应至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 过敏研究
- 细胞生物学
背景
- 过敏反应是由组胺等物质的释放所介导的。
- 人类和动物，如狗和马，都可能遭受过敏。
- 理解介质释放对开发过敏治疗至关重要。
- 释放测定对于研究中定量介质是必要的。
研究目的
- 开发可靠的测定法以测量IgE依赖的介质释放。
- 增强对各种生物体内过敏反应的理解。
- 促进潜在治疗（包括疫苗）的开发。
使用的方法
- 用马Fc蔚RI伪基因转染大鼠嗜碱性白血病细胞。
- 通过IgE和抗原激活受体以触发介质释放。
- 定量释放的介质以评估过敏反应。
- 利用基因工程细胞系进行实验测定。
主要结果
- 转染的细胞成功表达功能性Fc蔚RI伪受体。
- IgE和抗原激活导致可测量的介质释放。
- 该测定提供了研究过敏反应的平台。
- 结果有助于理解过敏机制。
结论
- 基因工程测定对于研究IgE介导的反应是有效的。
- 研究结果可以为未来过敏治疗的开发提供信息。
- 这种方法可能会增强对各种物种过敏反应的研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
This assay system enables quantitative assessment of IgE-dependent mediator release in an equine model, supporting target validation and mechanistic de-risking in allergy therapeutic development. By providing a reproducible platform to evaluate IgE-FcεRI interactions, it aids in preclinical screening of biologics such as anti-IgE vaccines or monoclonal antibodies. The model offers translational continuity across species, facilitating cross-species extrapolation of pharmacological profiles and safety assessments.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of equine IgE-FcεRI binding affinity and receptor functionality.
- Operational Value: Provides a standardized cell-based system for evaluating target engagement in allergic pathways.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by confirming receptor-mediated signaling before in vivo studies.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Utilizes β-hexosaminidase release as a quantitative, scalable readout for mediator secretion.
- Reproducibility: Demonstrates consistent dose-dependent responses across antigen concentrations, supporting assay robustness.
- Platform Adaptability: Can be modified for human, canine, or equine systems, enabling cross-species assay reuse.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models physiological allergic responses observed in horses, which mirror human and canine hypersensitivity.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to preclinical evaluation of therapeutic candidates.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs go/no-go decisions based on mediator release profiles and safety signals.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical assessment, particularly for allergy-focused biologics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of IgE receptor interactions and pathway clarification in mast cell/basophil activation.
- Screening: Enables evaluation of therapeutic candidates (e.g., anti-IgE antibodies) for their ability to block or induce mediator release.
- Analytics: Generates quantitative mediator release data (e.g., peak at 36.68% ± 4.88% at 100 ng/mL antigen) for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects in vitro mechanism to preclinical safety and efficacy evaluation in animal models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for allergic disease model development across multiple species.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by confirming functional receptor expression and signaling.
- Operational Value: Delivers a standardized, quantitative assay with defined controls and measurable outputs.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of biological activity or safety concerns.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of allergy therapeutics based on mechanistic de-risking data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture, transfection, and immunological assay techniques.
- Dependent on fluorescence or colorimetric detection infrastructure (e.g., plate reader at 405 nm).
- Necessitates standardization of cell density, IgE sensitization, and antigen titration across laboratories.
- Requires adaptation of antigen concentrations and incubation times when applied to different species or models.
- Limited to in vitro mediator release and may not reflect full in vivo pathophysiological complexity.
