为马科动物疱疹病毒2诊断的呼吸道液体定量PCR检测方法的开发和验证
March 17th, 2016
在这里，我们提出了一种用于检测和定量马呼吸液中 EHV-2 DNA 的定量 PCR 方法的开发和验证方案。EHV-2 qRT-PCR 验证方案涉及三个部分程序：开发、单独表征 qRT-PCR 检测以及整个分析方法的表征。
qPCR 方法的总体目标是评估马生物样本中马疱疹病毒 2 的病毒载量。这种方法可以帮助回答马呼吸系统疾病诊断领域的关键问题，为从业者提供新的解释辅助工具的定量数据。该技术的主要优点是灵敏度高、特异性高、方法快速。
另一个优势是按照 AFNOR 规范 NF U47-600 进行开发，该规范是国际正常化委员会的法国代表。演示该程序的是 Erika Hue，我们单位的一位年轻研究员。要从呼吸液的生物样品中提取核酸，在通风橱下，首先将 140 μL 生物样品加入 560 μL 裂解液中，并在室温下孵育 10 分钟。
向样品中加入 560 微升乙醇，然后将 630 微升总溶液加入二氧化硅柱并离心。将剩余的 630 μL 加入硅胶柱并再次离心。将样品上样到色谱柱上后，使用 AW1 和 AW2 洗涤缓冲液各 500 μL 清洗色谱柱两次。
然后，为了洗脱色谱柱中的核酸，加入 50 μL 室温洗脱液或 AVE 缓冲液。盖上盖子，在室温下孵育 1 分钟。然后以 6， 000 gs 离心 1 分钟。
为了扩增 DNA，根据文本方案滴定引物和探针后，通过添加 12.5 微升 PCR 预混液、20 微摩尔正向和反向引物、10 微摩尔探针和足够的超纯水，为每个反应制备 22.5 微升反应混合物，以达到 22.5 微升。为避免污染，请始终在特定区域制备 PCR 反应混合物。将 22.5 μL 适当的反应混合物分装到 96 孔板的每个反应孔中。
包括用于提取和 PCR 的阴性对照，以确保没有任何试剂被不需要的 DNA 污染。接下来，将 2.5 μL 样品、提取阴性对照、PCR 阴性对照或阳性对照样品添加到相应的反应孔中。然后使用粘性板密封件盖住板。
并以 6， 000 克离心 10 秒。将板置于实时荧光定量 PCR 系统中。然后选择此处所示的分析布局和 PCR 程序设置的模板，并开始运行。
将原始数据从实时荧光定量 PCR 系统传输到电子表格后，在扩增曲线中将阈值设置为高于基线且在指数生长区域内，以获得每个样品的阈值循环。将每个点标准集绘制为标准曲线以获得线性度。然后根据标准曲线计算不同样品的拷贝数。
为了确定 qRT-PCR 结果的检测限，将 90 μL 超纯水分配到 6 个试管中。要制备 6 个 10 倍连续稀释的质粒以靶向减排区，首先将 10 μL 从质粒工作稀释液转移到装有 90 μL 超纯水的试管中。短暂涡旋并离心管。
然后将 10 微升水从试管转移到下一管水中。涡旋和离心后，重复转移，直到所有水管都接收到质粒。如本视频前面所述，在六次 10 倍连续稀释液中扩增 DNA 后，确定消解区，这是产生阳性信号的质粒的最后一次稀释，也是第一次稀释，无需检测。
要制备 6 次 2 倍连续稀释液，请将 25 μL 超纯水分配到 6 个试管中。从最后一次质粒稀释中，从十倍稀释液中发出阳性信号，将 25 μL 从试管转移到第一管水中。如刚才所示，在制备其余五种稀释液之前涡旋并离心。
如本视频前面所述，从两倍连续稀释液中扩增 DNA。扩增来自三个独立试验的 DNA 后：计算每个质粒浓度水平的 24 个重复中的阳性重复数。以 95% 的置信度或 LOD 95% 的 PCR 确定 LOD，这是导致在 24 个重复中检测到 23 个阳性重复的水平。
为了确定方法的 LOD，准备五个 2 倍连续稀释液，从 25 微升质粒工作稀释液开始，该稀释液的浓度是给出阳性信号的 10 倍稀释液的最后浓度的四倍。扩增步骤中使用的质粒来自在特定区域制备的质粒工作稀释液，以避免污染。这是关键的一步。
将每个质粒稀释液中的 5 μL 转移到装有 135 μL 阴性资源材料的 4 个试管中，以获得 5 个阳性标准品的 4 个重复。对 5 个阳性标准品的 4 个重复进行提取，并按照本视频前面所述执行扩增程序。计算每个质粒浓度水平的 8 个重复中的 8 个重复中的阳性重复数。
最后，确定 LOD 方法，这是 8 个仿行中有 8 个仿行为正的最后一个水平。本视频中描述的定量 RT-PCR 方法可检测和定量呼吸液中的马疱疹病毒 2。在这个实验中，进行了 10 倍的连续稀释以估计减排区，该区域位于稀释度 10 到负 9 和稀释 10 到负 10 之间。
在减排区用新的两倍连续稀释法测定 LOD PCR 值。确定线性范围和 LOQ PCR LOD PCR 值用于开始 2.6（LOD PCR 值）与每 2.5 μL 样品 260， 000 个拷贝之间的 6 次 10 倍连续稀释范围。LOQ PCR 是线性范围内的最低浓度。
整个方法的表征是验证从呼吸道样本中提取 DNA 到扩增和定量靶标获取 qRT-PCR 数据所需的所有步骤。qRT-PCR 全分析方法的定量性能通过该图中表示的准确性曲线进行评估和验证。EHV2 病毒基因组载入了 172 个来自呼吸系统疾病马的鼻拭子样本，其中定量如此处所示。
年轻马的病毒基因组载量较高，检测到最高载量为每毫升 1.9 乘以 10 至第 11 个拷贝。一旦掌握了这项技术，每个扩增步骤可以在不到 2 小时内完成，如果执行得当，验证步骤的总数可以在不到 4 周的时间内完成。在尝试此过程时，请务必记住避免污染风险，尤其是在使用质粒溶液时。
按照此程序，可以执行其他方法（如测序）来回答其他问题，例如基因组识别。观看本视频后，您应该对如何进行 DNA 提取和扩增以及表征其 PCR 储备有很好的了解。不要忘记，处理病原体等生物样品可能非常危险。
执行此程序时，应始终采取一些预防措施，例如在引擎盖中工作和适应的安全级别区域。
概述
本文介绍了一种开发和验证定量PCR方法以检测马呼吸道液体中EHV-2 DNA的协议。该方法旨在提供敏感且具体的定量数据，以辅助诊断马的呼吸道疾病。
关键研究组成部分
科学领域
- 兽医诊断
- 病毒学
- 分子生物学
背景
- 马疱疹病毒-2（EHV-2）与马的呼吸道疾病相关。
- 定量PCR（qPCR）是评估病毒载量的有价值工具。
- 方法的标准化对于可靠的结果至关重要。
- 该协议遵循AFNOR norme NF U47-600以确保质量。
研究目的
- 开发一种可靠的qPCR方法用于EHV-2检测。
- 验证该方法在临床诊断中的应用。
- 为从业者提供定量数据以便于更好的决策。
使用的方法
- 从呼吸道液体样本中提取核酸。
- 使用特定引物和探针准备PCR反应混合物。
- 实施实时PCR系统进行扩增和检测。
- 通过系列稀释确定检测限（LOD）。
主要结果
- qPCR方法成功检测了马呼吸道液体中的EHV-2。
- 通过十倍稀释建立了减少区的估计。
- 该方法表现出高灵敏度和特异性。
- 确定了线性范围和定量限（LOQ）以便于准确测量。
结论
- 验证的qPCR方法对临床样本中的EHV-2检测有效。
- 该协议可以增强马呼吸道疾病的诊断能力。
- 未来的研究可能会扩展此方法在不同情况下的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol establishes a standardized quantitative PCR method for equid herpesvirus-2 detection in respiratory fluids, addressing the need for harmonized viral load quantification across laboratories. By incorporating full method validation from extraction to amplification per AFNOR NF U47-600, it reduces inter-laboratory variability and supports reliable comparative diagnostics. The approach enables predictive confidence in viral burden assessment, informing go/no-go decisions in equine respiratory disease research and therapeutic development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of viral load dynamics as a biomarker for respiratory disease pathogenesis in equine models.
- Operational Value: Provides specific and sensitive quantification of EHV-2 genome copies, supporting mechanistic de-risking of host-pathogen interaction studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative outputs with defined limit of detection and linearity range, enabling reliable compound screening against viral replication.
- Operational Value: Standardized extraction and amplification workflow ensures reproducibility across plate-based formats for high-throughput applications.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Viral genome load results in international units (IU) facilitate cross-study comparison and translational biomarker alignment in preclinical efficacy studies.
- Operational Value: Validation of the whole analytical method supports risk-adjusted advancement decisions by accounting for extraction-related variability.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through preclinical evaluation, where quantitative viral load measurement informs mechanistic understanding and therapeutic intervention assessment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding viral load thresholds associated with respiratory disease phenotypes in equine models.
- Screening: Enables assay-ready biological systems with standardized nucleic acid extraction for consistent compound evaluation.
- Analytics: Provides threshold cycle measurements and standard curve-derived copy numbers for quantitative comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery-phase viral load data to preclinical validation through internationally comparable IU measurements.
- Enterprise Reuse: The validated workflow serves as a reusable platform for respiratory virus quantification beyond EHV-2, applicable to other equine pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in viral quantification reduces mechanistic ambiguity in respiratory disease models.
- Operational Value: Standardization per AFNOR norm ensures reproducibility and scalability across laboratory settings.
- Strategic Value: Accurate viral load data improves go/no-go decisions by reducing false negatives in antiviral screening.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of candidates based on dose-response relationships with quantified viral burden.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular diagnostics and real-time PCR instrumentation.
- Dependent on access to silica column-based extraction kits and calibrated thermocyclers.
- Necessitates standardized operating procedures for contamination control when handling plasmid standards.
- Adaptation to alternative sample types (e.g., blood, tissue) would require re-validation of extraction efficiency.
- Practical limitation: Plasmid dilution series must be prepared in a contamination-controlled area to maintain quantification accuracy.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:55
Extraction of Nucleic Acids
2:03
Amplification Procedure
3:57
Limit of Detection of qRT-PCR
5:54
Limit of Detection of the Method Determined by Two Independent Trials
7:04
Results: Validation of Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnosis
8:45
Conclusion
