马疱疹病毒2型呼吸道样本诊断定量PCR方法的开发与验证

qPCR 方法的总体目标是评估来自马匹的生物样本中马疱疹病毒-2的病毒载量。该方法有助于解答马呼吸道疾病诊断领域中的关键问题，为临床兽医提供新的定量数据解读辅助工具。该技术的主要优势在于其具有高灵敏度、高特异性和快速检测的特点。

另一个优势是该方法依据法国标准化协会（AFNOR）NF U47-600 标准开发，AFNOR 是国际标准化委员会中的法国代表。本次实验操作将由我单位的年轻研究人员 Erika Hue 进行演示。在生物安全柜中，从呼吸道液体生物样本中提取核酸时，首先向 560 µL 裂解液中加入 140 µL 生物样本，于室温孵育 10 分钟。

向样品中加入 560 微升乙醇，取 630 微升总溶液加入硅胶柱中并离心。将剩余的 630 微升加入硅胶柱中，再次离心。样品加入柱子后，分别使用 500 微升洗涤缓冲液 AW1 和 AW2 各洗涤柱子两次。

然后，向柱中加入 50 µL 室温的洗脱缓冲液或 AVE 缓冲液以洗脱核酸。盖上盖子，在室温下孵育 1 分钟。随后在 6,000 ×g 下离心 1 分钟。

为了扩增DNA，在根据文本方案对引物和探针进行滴定后，通过加入12.5微升PCR主混合液、20微摩尔的正向和反向引物、10微摩尔的探针，以及足量的超纯水至总体积达到22.5微升，为每个反应配制22.5微升的反应混合液。为避免污染，始终应在特定区域配制PCR反应混合液。将22.5微升相应的反应混合液分装至96孔板的每个反应孔中。

设置提取和 PCR 的阴性对照，以确保所用试剂未被外源 DNA 污染。随后，向相应的反应孔中加入 2.5 µL 的样本、提取阴性对照、PCR 阴性对照或阳性对照样本。然后使用粘性板封膜覆盖板孔。

在6,000 ×g下离心10秒。将板放入实时PCR系统中。然后选择此处所示的检测布局模板和PCR程序设置，并开始运行。

将实时 PCR 系统的原始数据转移至电子表格后，在扩增曲线的基线以上及指数增长区域内设定阈值，以获得每个样本的阈值循环数。将每组点标准品绘制为标准曲线以获得线性关系。然后根据标准曲线计算不同样本的拷贝数。

为了确定qRT-PCR结果的检测限，将90微升超纯水分别加入六个试管中。为制备针对消除区的质粒六级十倍系列稀释液，首先将10微升质粒工作稀释液转移至含有90微升超纯水的试管中。短暂涡旋振荡并离心该试管。

然后从该管中取10微升转移至下一管水中。涡旋混匀并离心后，重复转移操作，直至所有水样管均接收到质粒。按照本视频前述方法对六个十倍梯度稀释的DNA进行扩增后，确定消除带（abatement zone），即产生阳性信号的最后一种质粒稀释度以及首次未检测到信号的稀释度。

为制备六组两倍系列稀释液，向六个试管中各加入25微升超纯水。从十倍稀释液中最后一个产生阳性信号的质粒稀释管中，取25微升转移至第一个装有水的试管中。涡旋混匀并离心，然后按照上述方法制备剩余的五个稀释液。

按照本视频前面所述方法，对梯度稀释的DNA样本进行扩增。在完成三次独立实验的DNA扩增后，计算每个质粒浓度水平下24个重复样本中呈阳性的重复数。确定95%置信度下的检测下限（LOD 95% PCR），即在24个重复样本中检测到23个阳性结果的最低浓度水平。

为确定该方法的检测限，从质粒工作液中取 25 µL 开始，该工作液浓度比十倍稀释后仍能产生阳性信号的最低浓度高四倍，以此制备五份两倍系列稀释液。扩增步骤中使用的质粒来自在特定区域配制的质粒工作液，以避免污染。此步骤至关重要。

从每个质粒稀释液中转移5微升至含有135微升阴性资源材料的四个试管中，以获得五个阳性标准品的四份重复样本。对这五个阳性标准品的四份重复样本进行提取，并按照本视频前面所述的方法进行扩增。对每个质粒浓度水平的八份重复样本，统计其中阳性重复样本的数量。

最后，确定检测限（LOD）方法，即在八次重复中全部八次均为阳性的最高稀释度。本视频中描述的定量RT-PCR方法用于检测和定量马疱疹病毒-2（equid herpesvirus-2）在呼吸道液体中的含量。在本实验中，通过十倍系列稀释来估算检测下限范围，该范围位于10⁻⁹与10⁻¹⁰稀释度之间。

在消除区域中通过新的两倍连续稀释法确定LOD PCR值。为确定线性范围和LOQ PCR，以LOD PCR值作为起始点，进行六次十倍连续稀释，稀释范围从每2.5微升样品2.6拷贝（即LOD PCR值）至260,000拷贝。LOQ PCR为线性范围中的最低浓度。

该方法的整体表征涵盖了从呼吸道样本中提取DNA，到目标物的扩增与定量，获得qRT-PCR数据所需所有步骤的验证。本图展示了该qRT-PCR完整分析方法定量性能的评估与验证结果，以准确度概况图表示。如图所示，对172份来自患有呼吸道疾病的马匹的鼻拭子样本中的EHV2病毒基因组载量进行了定量分析。

年轻马匹体内的病毒基因组载量较高，最高载量达到每毫升 1.9 × 10¹¹ 拷贝。一旦掌握该技术，每个扩增步骤可在两小时内完成，若操作得当，全部验证步骤可在四周内完成。在进行该操作时，必须注意避免污染风险，尤其是在处理质粒溶液时。

完成此操作后，可进行其他方法（如测序），以回答更多问题，例如基因组鉴定。观看本视频后，您应充分了解如何进行 DNA 的提取与扩增，并能够表征其 PCR 产物。请务必注意，操作病原体等生物样本可能具有极高危险性。

进行该操作时，应始终采取一些预防措施，例如在通风橱内操作，并在具备适当安全等级的区域中进行。