Name: 为马科动物疱疹病毒2诊断的呼吸道液体定量PCR检测方法的开发和验证 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 学习开发和验证用于检测马呼吸道液体中EHV-2的定量PCR方法。该技术具有高灵敏度和特异性，符合AFNOR NF U47-600国际标准，可为马科动物呼吸道疾病诊断提供可靠的病毒载量定量数据。

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作者感谢 Sophie Castagnet 和 Nadia Doubli-Bounoua 提供的技术支持。本工作获得了卡尔瓦多斯省议会以及下诺曼底大区与法国政府（CPER 2007-2013；项目 R25 p3）的财政支持。作者感谢法国标准化协会（AFNOR）专家组成员，特别是 Jean-Philippe Buffereau 和 Eric Dubois。

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<li>Diallo, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+real-time+PCR+for+the+detection+and+differentiation+of+equid+herpesvirus+1+%28EHV-1%29+and+equid+herpesvirus+4+%28EHV-4%29%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiplex real-time PCR for the detection and differentiation of equid herpesvirus 1 (EHV-1) and equid herpesvirus 4 (EHV-4).</a> Vet.Microbiol. 4 (1-3), 93-103 (2007).</li>
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<li>Brault, S. A., Bird, B. H., Balasuriya, U. B., MacLachlan, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+heterogeneity+and+variation+in+viral+load+during+equid+herpesvirus-2+infection+of+foals%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic heterogeneity and variation in viral load during equid herpesvirus-2 infection of foals.</a> Vet.Microbiol. 147 (3-4), 253-261 (2011).</li>
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<li>ISO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22EN+ISO-CEI+17025.+General+requirements+for+the+competence+of+testing+and+calibration+laboratories%22">EN ISO-CEI 17025. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories</a>. , (2005).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Manual+of+Diagnostic+Tests+and+Vaccines+for+Terrestrial+Animals+2010.+Chapter1.1.1.4%2F+5.+Principles+and+Methods+of+Validation+of+Diagnostic+Assay+for+Infectious+Diseases%22">Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2010. Chapter1.1.1.4/ 5. Principles and Methods of Validation of Diagnostic Assay for Infectious Diseases</a>. , This thoroughly revised chapter replaces Chapter 1.1.4 Principles of validation of diagnostic assays for infectious diseases and Chapter 1.1.5 Validation and quality control of polymerase chain reaction methods used for the diagnosis of infectious diseases from the sixth edition of the OIE Terrestrial Manual (2009).</li>
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<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J Vis.Exp. (63), e3998(2012).</li>
<li>Sanger, F., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+determining+sequences+in+DNA+by+primed+synthesis+with+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase.</a> J Mol.Biol. 94 (3), 441-448 (1975).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
<li>NCBI. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22BLAST+Homepage+and+Selected+Search+Pages.+Introducing+the+BLAST+homepage+and+form+elements%2Ffunctions+of+selected+search+pages%22">BLAST Homepage and Selected Search Pages. Introducing the BLAST homepage and form elements/functions of selected search pages</a>. , (2015).</li>
<li>Greiner, M., Gardner, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+diagnostic+tests+in+veterinary+epidemiologic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Prev.Vet+Med%22%5BJournal%5D)">Application of diagnostic tests in veterinary epidemiologic studies.</a> Prev.Vet Med. 45 (1-2), 43-59 (2000).</li>
<li>Blanchard, P., Regnault, J., Schurr, F., Dubois, E., Ribiere, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-laboratory+validation+of+chronic+bee+paralysis+virus+quantitation+using+an+accredited+standardised+real-time+quantitative+RT-PCR+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol.Methods%22%5BJournal%5D)">Intra-laboratory validation of chronic bee paralysis virus quantitation using an accredited standardised real-time quantitative RT-PCR method.</a> J Virol.Methods. 180 (1-2), 26-31 (2012).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

自2000年代以来，实时PCR技术正在越来越多的实验室中取代传统的金标准技术（如细胞培养和细菌培养方法）。该技术的实施相对简便，但为确保病原体分子检测与定量结果的准确性、可重复性和可靠性，实验室方法的验证至关重要。
由于提取步骤是生物材料损失的主要来源，因此可被视为不同实验方案之间定量误差的主要来源。因此，在qRT-PCR过程中构建DNA质粒标准曲线（文献中主要报道的方法）仅能反映病毒基因组载量，但未考虑提取步骤的影响。
在 AFNOR 标准 NF U47-600-2 中描述一种针对完整方法验证过程的de novo策略，代表了该领域的重要进展。正如本文中对马疱疹病毒2型（EHV-2）的研究，或他人在蜜蜂中的研究21所示，该策略要求明确区分方法开发阶段与验证阶段，并分别对PCR本身以及整个检测方法进行表征。这一有趣方法的一个局限性在于，任何对实验方案的修改都将导致必须重新验证整个流程，这可能带来高昂的成本。这一局限性还体现在定量限（LOQ）依赖于病毒提取来源（例如，呼吸道分泌物、器官、血液或尿液）的事实。实际上，每种基质在其理化特性方面均具有不同的特异性，因此有必要针对每种用于通过qRT-PCR进行病毒检测和定量的不同基质独立加以定义。这样，可从核酸提取阶段更精确地定量每个生物样本中的病毒基因组载量。此外，方法表征还需考虑所用热循环仪的型号；当在原实验室或其他实验室中，使用先前已充分表征的方法（例如，本文所述的EHV-2 qPCR方法）而需更换新型仪器时，必须确认该仪器的性能。qPCR检测性能的确认是所有检测引入实验室前的先决条件。通常通过分析具有已知特性的参考样本实现。此类核查是必要前提，也是AFNOR标准NF 47-600-1所要求的强制性步骤，以验证qPCR的性能指标（如检出限LOD、定量限LOQ、扩增效率）以及整个方法的稳健性（LOD、LOQ）。不仅在方法开发与表征阶段，而且在科研或诊断应用过程中，均应识别并有效控制潜在风险因素，以确保实验方案的标准化。尤其需要注意的是人员的充分培训、高资质技术人员的配备、耗材的质量控制及其储存条件、实验环境条件的监控，以及对可能影响检测所用科学仪器性能的计量学条件的认知。使用参考样本进行实验室间比对也有助于控制不确定性。通过这种方式，可促进不同实验室间数据的可比性。事实上，实验室间能力验证测试对于评估并确认方法的可重复性至关重要。
以国际单位（IU）表示的病毒基因组载量结果（IU：液体样本为拷贝数/mL，组织样本为拷贝数/g）更便于在不同实验室之间进行结果比较。所有高于定量下限（LOQ）的结果均以拷贝数/mL 表示，而介于检测下限（LOD）与定量下限（LOQ）之间的结果则视为不可定量的阳性结果。以这种方式呈现基因组的定量数据，更准确地反映了分析过程（基因组扩增）。事实上，在细胞培养实验中，通过 TCID50 （半数组织培养感染剂量） 表示病毒载量的方法依赖于细胞类型和病毒毒株的特性。每种毒株具有其独特的感染动力学，某些病毒（如 EHV-2）可能需要数天时间才会出现首次可观察到的细胞病变效应。
总之，这种qRT-PCR表征的新方法将有助于实现实验室之间数据呈现和解释的标准化。这对于qRT-PCR未来潜在的新应用将非常有用，例如建立用于判定疾病状态的阈值，而不仅仅是判断病原体的存在与否。

马疱疹病毒-2（EHV-2）与一种呼吸系统综合征相关，可能的临床表现包括鼻腔分泌物、咽炎和淋巴结肿大1-3。该病毒还被认为与马匹运动性能下降有关，可能对马业造成显著的负面经济影响2。
迄今为止，γ-疱疹病毒（γ-EHV）检测的金标准是细胞培养法。该方法的第一个缺陷是无法区分EHV-2与其他γ-EHV例如， EHV-5）。第二个问题是细胞病变过程发展缓慢，通常需要12至28天才能显现4,5.
建立经过验证且标准化的定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）方法，将有助于快速检测病毒，区分马疱疹病毒2型（EHV-2）与马疱疹病毒5型（EHV-5），并借助其定量特性研究病毒基因组载量与疾病之间的关系。
聚合酶链式反应（PCR）由Mullis于1986年首次描述6，现正成为生物诊断领域（人类、环境和兽医）新的金标准。该方法基于对病原体基因组特定片段的扩增，具有诸多优势：特异性强、灵敏度高、反应迅速。此外，随着实时荧光定量逆转录PCR（qRT-PCR）技术的出现以及质量保证体系的建立，扩增产物污染的风险已显著降低7。然而，要使PCR被认可为新的金标准方法，仅靠性能的提升尚不足够，还必须证明整个方法在开发与验证过程中各环节均得到有效控制，且其性能在长期使用中不会下降。
最初用于检测马疱疹病毒2型（EHV-2）的分子工具耗时较长，需采用套式PCR进行非特异性扩增，随后进行测序8。针对疱疹病毒的靶基因包括脱氧核糖核酸（DNA）聚合酶基因和DNA包装基因9。然而，套式PCR存在较高的扩增子污染风险。此后，已设计出常规PCR检测方法，用于扩增白细胞介素10样基因或糖蛋白B基因，相关研究在2009年已有综述2。近年来，已有研究描述了用于EHV-2定量检测的实时PCR特性10，但尚无关于包含提取步骤在内的整个方法学验证的完整数据报道。
本方案描述了根据相关标准建立和验证一种用于检测和定量马呼吸道液体中EHV-2 DNA的定量PCR方法的步骤 法国标准化协会 （法国标准化协会）标准 NF U47-6003,11,12，即国际标准化委员会的法国代表。该标准详细说明了 &#34;兽用PCR在动物健康分析方法中实施、开发与验证的要求和建议&#34;11,12，依据 NF EN ISO/CEI 17025:200513 以及世界动物卫生组织（OIE）2010年建议14EHV-2 的 qRT-PCR 验证方案包括三个部分：（a）建立 qRT-PCR 检测方法，（b）单独表征 qRT-PCR 检测性能，以及（c）对整个分析方法（从生物样本中提取核酸至 PCR 分析）进行表征。
对qRT-PCR检测及整个分析方法的表征包括两个限值的确定：检出限（LOD）和定量限（LOQ）。LOD95% PCR 表示在95%的情况下能够检测到的每单位体积最低核酸拷贝数。LOQ95% PCR 表示在考虑不确定度的前提下可测定的最低核酸拷贝数量。
该qRT-PCR方法可实现对呼吸道液体中EHV-2的精确定性和快速定量。此外，该方法可在其他实验室推广应用，以确保操作流程的标准化，并可作为开发其他新型qRT-PCR检测方法的通用模板。

<table><tbody><tr><td>AB-1900 天然色 ABgene 96 孔板&amp;nbsp;</td><td>Dutsher</td><td>16924</td><td></td></tr><tr><td>qPCR 绝对粘性封板膜&amp;nbsp;</td><td>Dutsher</td><td>16629</td><td>用于在 qRT-PCR 运行前密封反应板的粘性封膜</td></tr><tr><td>0.5 ml 带裙边微量离心管及管盖</td><td>Dutsher</td><td>039258</td><td></td></tr><tr><td>98% 乙醇</td><td>Sodipro</td><td>SAF322941000</td><td></td></tr><tr><td>引物</td><td>Eurofins</td><td>定制订单</td><td></td></tr><tr><td>探针</td><td>Life Technologies</td><td>定制订单</td><td></td></tr><tr><td>质粒</td><td>Eurofins</td><td>定制订单</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp&amp;nbsp; 病毒RNA小量提取试剂盒&lt;br/&gt;（包含：QIAamp 离心柱、AVL&amp;nbsp;缓冲液、&amp;nbsp;AW1 缓冲液、AW2 缓冲液、AVE 缓冲液、收集管）&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td>AVL 缓冲液：在 72 &amp;deg;C 预热 5 分钟</td></tr><tr><td>Sanger 法测序</td><td>Eurofins</td><td>定制订单</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 通用 PCR 主混合液</td><td>Life Technologies</td><td>4364340</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA 缓冲液</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-296653A</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c 分光光度计</td><td>Thermoscientific</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus 实时荧光定量 PCR 系统</td><td>Life Technologies</td><td>4376600</td><td>预热 15 分钟&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

马疱疹病毒2型呼吸道样本诊断定量pcr方法的开发与验证

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

本方案描述了一种根据NF U47-600标准，利用定量RT-PCR方法检测和定量马呼吸道样本中EHV-2的实验流程。在完成方法开发和初步验证后，依据AFNOR标准进行了两个独立的表征步骤：（a）单独对qRT-PCR检测进行表征；（b）对整个分析方法进行表征。整个分析方法的验证涵盖了从核酸提取到最终PCR分析之间所有步骤的全面评估。
为了准确测定病毒基因组载量，对整个方法进行验证在通过qRT-PCR检测病毒时至关重要。由于提取步骤是生物材料损失的主要来源，因此可被视为不同实验方案之间定量误差的主要来源。基于此原因，AFNOR标准NF-U-47-600建议在提取步骤之前加入质粒稀释梯度。此外，定量限取决于病毒提取来源。以国际单位（IU）表示的病毒基因组载量结果更便于不同实验室之间的结果比较。
这种qRT-PCR表征的新方法应有助于实现实验室之间数据呈现和解释的标准化。

如上所述，采用定量RT-PCR方法检测并定量呼吸道液体中的马疱疹病毒-2。 图1 展示了根据AFNOR标准NF U47-600建立和验证定量RT-PCR方法的示意图工作流程。在PCR逐步开发过程中，已验证引物和探针的特异性。该体系仅扩增EHV-2毒株。随后需对qRT-PCR的性能进行表征。
首先，为了估算 LODPCR，进行了6次十倍系列稀释，以确定下降区间（图2）。在本示例中，进行了从10-5到10-10的6次十倍系列稀释（相当于每2.5 µl样本中26,000至0.26个拷贝），用于估算 LODPCR。下降区间位于10-9和10-10稀释度之间（相当于每2.5 µl样本中2.6至0.26个拷贝）。为确定本例中的 LODPCR 值，在该下降区间内对质粒进行了6次两倍系列稀释，稀释范围为每2.5 µl样本中5.2至0.16个拷贝。最终确定的 LODPCR 值为每2.5 µl样本2.6个拷贝。
确定线性范围和定量限PCR，检测限PCR 用于确定2.6（LOD）之间的6个十倍系列稀释范围的起始值PCR）和 260,000 拷贝/2.5 µl 样品 图3 展示了一次试验中EHV2 qRT-PCR的线性回归结果。线性回归的性能（图4) 采用文中所述计算方法进行四次重复验证。 表3根据绝对偏倚标准计算以确定线性范围i 值 ≤0.25 log10，无论何种水平 i 质粒载量。在此情况下，线性范围介于 2.6 至 260,000 拷贝/2.5 µl 样品。定量限（LOQ）PCR 在线性范围内最低的浓度（即，2.6 拷贝/2.5 µl 样本在此情况下）。ULIN 被确定为 0.12 log10 2.6–260,000 拷贝/2.5 µl DNA
在完成qRT-PCR方法的开发（图1，蓝色）和表征（图1，黄色）之后，AFNOR NF U47-600 标准建议对从DNA提取到qRT-PCR的整个分析方法进行表征（图1，橙色）。诊断灵敏度和特异性按表4所述进行计算。qRT-PCR整个分析方法的定量性能通过准确度轮廓进行评估和验证（图5）。
本方案采用先进的分子技术，使我们能够检测并定量172份来自患有呼吸道疾病和/或临床疑似感染马匹的鼻拭子样本中的EHV-2病毒基因组载量。在该群体中，EHV-2在田间（生物）样本中的检出率为50%（86/172）。定量分析显示，EHV-2病毒基因组载量在幼龄马匹中显著更高，且病毒基因组载量的分布随年龄增长而下降（图6）。在本研究中，EHV-2病毒基因组载量最高值（1.9 × 1011 拷贝/ml）出现在幼驹中（图6）。
<img alt="显示开发、表征和验证的qRT-PCR流程图；方法包括检出限（LOD）、定量限（LOQ）。" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1：根据AFNOR标准NF U47-600-2，定量RT-PCR的开发（蓝色）、定量RT-PCR的表征（黄色）以及从DNA提取到qRT-PCR整个分析方法的表征（橙色）的工作流程图。 该工作流程图汇总了定量RT-PCR开发、定量RT-PCR表征以及从DNA提取到qRT-PCR整个分析方法表征的各个步骤。对于每个步骤，工作流程图标明了所需运行次数、需进行的稀释梯度以及所需分析人员数量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="PCR扩增曲线图，qRn与循环数关系，显示DNA定量结果，包含衰减区和阴性样本。" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2"> 
图2：通过质粒6个10倍系列稀释样本获得的实时PCR扩增曲线代表性结果确定衰减区。为估算衰减区，将质粒进行6个10倍系列稀释，稀释范围从10-5 （26,000 拷贝/2.5 µl 样本）至10-10（0.26 拷贝/2.5 µl 样本）。衰减区位于10-9（2.6 拷贝/2.5 µl 样本）与10-10（0.26 拷贝/2.5 µl 样本）之间。本实验中，在该衰减区内对质粒进行6个2倍系列稀释，以确定LOD95%PCR，范围为5.2至0.16 拷贝/2.5 µl 样本。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="PCR标准曲线，方程 y=-3.34x+36.94，R²=0.999，循环阈值（Ct）与质粒对数值的关系图。" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3"> 
图3：EHV2 定量反转录 PCR 的线性回归分析。 定量检测的线性关系是指检测结果在特定范围内与目标物浓度呈正比的能力。该特性可通过仪器响应值（循环阈值，Ct）与目标物数量对数值（每 2.5 µl 样本中的目标拷贝数）之间的线性回归模型（y = ax + b）进行评估。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="质粒水平与平均偏差图表；误差条表示基因编辑分析中的数据变异性。" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4：EHV-2 qPCR线性回归性能。 平均偏差表示每个质粒水平下测得的质粒数量（<img alt="上方带横线的均值符号，表示数学中的统计平均值。" src="/files/ftp_upload/53672/fig4-1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="fig4-1">）与理论质粒数量（x'i）之间的平均差值。垂直条表示线性不确定度（ULINi），其计算公式为 
<img alt="不确定度公式，U_LINI=2√(SD'i²+mean.bias²)，数学方程。" src="/files/ftp_upload/53672/fig4-2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="fig4-2"> 
其中 SD'i 为测得的质粒数量的标准差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="绝对偏差与EHV2质粒水平（Log₁₀）关系图，显示数据变异性及趋势线。" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图5"> 
图5：基于EHV-2定量逆转录PCR方法验证结果的准确度分析图。 绿色线（圆圈）代表数据的准确性（系统误差或偏差）。实验室将可接受限定义为±0.75 Log10（虚线）。每个质粒载量水平的下限和上限准确度限值由平均偏差±可靠性数据标准差的两倍确定（红线）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="不同年龄组马匹EHV2病毒载量比较图及统计分析；实验结果。" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 6"> 
图 6：根据年龄对EHV-2病毒基因组载量进行定量分析。 本图展示了在鼻拭子样本中检测到的EHV-2病毒基因组载量在不同年龄组中的分布情况。水平线表示标准差范围内的中位数值（m = 月）。* 经ANOVA方差分析及Newman-Keuls事后检验，差异具有统计学意义（p &lt;0.05）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>目的基因</td>
			<td colspan="3">引物、探针及质粒序列（5'-3'）</td>
			<td>核苷酸位置</td>
			<td>扩增产物大小（核苷酸）</td>
			<td colspan="2">热循环条件</td>
			<td>参考文献</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">EHV2 gB 
			(HQ247755.1)</td>
			<td colspan="3">上游引物：GTGGCCAGCGGGGTGTTC </td>
			<td>2113-2130</td>
			<td rowspan="4">78</td>
			<td>95 °C 5 min</td>
			<td></td>
			<td rowspan="4">11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">下游引物：CCCCCAAAGGGATTYTTGAA</td>
			<td>2189-2170</td>
			<td>95 °C 15 sec</td>
			<td rowspan="2">45 个循环</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">探针：FAM-CCCTCTTTGGGAGCATAGTCTCGGGG-MGB</td>
			<td>2132-2157</td>
			<td>60 °C 1 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">质粒： 
			ACCTGGGCACCATAGGCAAGGTGGTGGTCA 
			ATGTGGCCAGCGGGGTGTTCTCCCTCTTTG 
			GGAGCATAGTCTCGGGGGTGATAAGCTTTTT 
			CAAAAATCCCTTTGGGGGCATGCTGCTCATA 
			GTCCTCATCATAGCCGGGGTAGTGGTGGTG 
			TACCTGTTTATGACCAGGTCCAGGAGCATAT 
			ACTCTGCCCCCATTAGAATGCTCTACCCCGG 
			GGTGGAGAGGGCGGCCCAGGAGCCGGGCG 
			CGCACCCGGTGTCAGAAGACCAAATCAGGA 
			ACATCCTGATGGGAATGCACCAATTTCAG</td>
			<td>2081-2381</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：本实验方案中使用的引物、探针及阳性合成DNA对照的序列。 质粒（阳性合成DNA）的序列对应于EHV2gB序列（HQ247755.1）的第2081-2381位核苷酸。本方案中所用引物和探针的设计通过特定软件完成。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">病原体</td>
			<td rowspan="2">参考株（来源）</td>
			<td rowspan="2">菌株数量</td>
			<td>结果</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EHV-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">EHV-2</td>
			<td>VR701 (ATCC)</td>
			<td rowspan="2">20</td>
			<td rowspan="2">阳性</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 个样本（FDL 收藏）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">EHV-5</td>
			<td>KD05 (GERC)</td>
			<td rowspan="2">20</td>
			<td rowspan="2">阴性</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 个样本（FDL 收藏）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">EHV-3</td>
			<td>VR352 (ATCC)</td>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td rowspan="2">阴性</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T934 WSV (GERC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">EHV-1</td>
			<td>Kentucky 株 Ky A (ATCC)</td>
			<td rowspan="2">3</td>
			<td rowspan="2">阴性</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 个样本（FDL 收藏）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EHV-4</td>
			<td>VR2230 (ATCC)</td>
			<td>1</td>
			<td>阴性</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>驴疱疹病毒 AHV5</td>
			<td>FDL 收藏</td>
			<td>1</td>
			<td>阴性</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">马流感病毒</td>
			<td>A/马/Jouars/4/2006 (H3N8)</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">阴性</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(登录号 JX091752)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>马动脉炎病毒</td>
			<td>VR796 (ATCC)</td>
			<td>2</td>
			<td>阴性</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodococcus equi</td>
			<td>FDL 收藏</td>
			<td>1</td>
			<td>阴性</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus</td>
			<td>FDL 收藏</td>
			<td>1</td>
			<td>阴性</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococcus equi subsp. equi</td>
			<td>FDL 收藏</td>
			<td>1</td>
			<td>阴性</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coxiella burnetii</td>
			<td>ADI-142-100 (Adiagene)</td>
			<td>1</td>
			<td>阴性</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlamydophila abortus</td>
			<td>ADI-211-50 (Adiagene)</td>
			<td>1</td>
			<td>阴性</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klebsiella pneumoniae</td>
			<td>FDL 收藏</td>
			<td>1</td>
			<td>阴性</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：EHV-2 qRT-PCR检测的分析特异性。
<img alt="PCR效率分析；用于DNA分析和偏差评估的方程、公式及统计表" src="/files/ftp_upload/53672/53672table3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="表3"> 
表3：偏倚和线性不确定度的计算（改编自NF U47-600-2）12)每次试验中，线性回归的性能（y = ax+b) 使用下表进行验证 y 获得循环阈值； a 为所得斜率； x 质粒水平和 b 是截距。 i 质粒水平（i 从1到 k 水平）； k 所使用的质粒水平数（例如, k = 6 在本表中） j 是该试验（j 从1到 I 试验）； I 是试验次数，介于3到6次之间（例如 I = 4 在本表中。 xi 每个质粒的估计数量 i 质粒水平 x'i  是通过方程计算得到的理论质粒数量 x'i = log10(xi) 每个 i 质粒水平。在每次 j 试验中，每个循环阈值的获得 i 质粒水平通过线性回归计算 yi,j = ajxi,j + bj. <img alt="统计变量符号 x̂ᵢⱼ 在统计方程中表示估计值。" src="/files/ftp_upload/53672/table3-1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="表3-1"> 试验过程中测得的质粒数量 j. 偏差i 是每次试验和每个质粒水平下测得的质粒数量与理论质粒数量之间的差异。 <img alt="向量数学符号，均值估计量表示法，教学示意图" src="/files/ftp_upload/53672/table3-2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="表3-2"> 是……的平均值 <img alt="统计变量 \( \hat{x}_{i,j} \) 方程；用于数据分析和预测模型。" src="/files/ftp_upload/53672/table3-3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="表3-3"> 由每一个 i 质粒水平 SD'i 是测量量的标准偏差 <img alt="统计分析中用于估计 xi,j 的方程符号。" src="/files/ftp_upload/53672/table3-4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="表3-4"> 每个 i 质粒水平 平均偏差 是……的平均值 偏差i; ULINi 每次测定的线性不确定度 i 质粒水平根据以下计算得出 SD'i 和 平均偏差. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672table3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">样本真实状态</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>阳性</td>
			<td>阴性</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">完整方法检测结果</td>
			<td>阳性</td>
			<td>RP（真实阳性）</td>
			<td>FP（假阳性）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>阴性</td>
			<td>FN（假阴性）</td>
			<td>RN（真实阴性）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总计</td>
			<td>RP+FN</td>
			<td>FP+RN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Se = RP/(RP+FN)</td>
			<td>Sp = RN/(RN+FP)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表4：整个方法的诊断灵敏度（Se）和特异性（Sp）的计算。 采用Schwartz表，按照NF U47-600-2标准中的描述，计算整个方法的灵敏度和特异性的95%置信区间。

本文介绍了一种用于检测和定量马呼吸道分泌物中EHV-2 DNA的定量PCR方法的建立与验证方案。EHV-2 qRT-PCR的验证流程包括三个部分：方法建立、qRT-PCR检测体系的单独表征，以及整个分析方法的全面表征。

马疱疹病毒2型呼吸道样本诊断定量PCR方法的开发与验证

该方案描述了一种根据NF U47-600标准，利用定量RT-PCR方法检测和定量马呼吸道液体中EHV-2的实验流程。

qPCR 方法的总体目标是评估来自马匹的生物样本中马疱疹病毒-2的病毒载量。该方法有助于解答马呼吸道疾病诊断领域中的关键问题，为临床兽医提供新的定量数据解读辅助工具。该技术的主要优势在于其具有高灵敏度、高特异性和快速检测的特点。另一个优势是该方法依据法国标准化协会（AFNOR）NF U47-600 标准开发，AFNOR 是国际标准化委员会中的法国代表。本次实验操作将由我单位的年轻研究人员 Erika Hue 进行演示。在生物安全柜中，从呼吸道液体生物样本中提取核酸时，首先向 560 µL 裂解液中加入 140 µL 生物样本，于室温孵育 10 分钟。向样品中加入 560 微升乙醇，取 630 微升总溶液加入硅胶柱中并离心。将剩余的 630 微升加入硅胶柱中，再次离心。样品加入柱子后，分别使用 500 微升洗涤缓冲液 AW1 和 AW2 各洗涤柱子两次。然后，向柱中加入 50 µL 室温的洗脱缓冲液或 AVE 缓冲液以洗脱核酸。盖上盖子，在室温下孵育 1 分钟。随后在 6,000 ×g 下离心 1 分钟。为了扩增DNA，在根据文本方案对引物和探针进行滴定后，通过加入12.5微升PCR主混合液、20微摩尔的正向和反向引物、10微摩尔的探针，以及足量的超纯水至总体积达到22.5微升，为每个反应配制22.5微升的反应混合液。为避免污染，始终应在特定区域配制PCR反应混合液。将22.5微升相应的反应混合液分装至96孔板的每个反应孔中。设置提取和 PCR 的阴性对照，以确保所用试剂未被外源 DNA 污染。随后，向相应的反应孔中加入 2.5 µL 的样本、提取阴性对照、PCR 阴性对照或阳性对照样本。然后使用粘性板封膜覆盖板孔。在6,000 ×g下离心10秒。将板放入实时PCR系统中。然后选择此处所示的检测布局模板和PCR程序设置，并开始运行。将实时 PCR 系统的原始数据转移至电子表格后，在扩增曲线的基线以上及指数增长区域内设定阈值，以获得每个样本的阈值循环数。将每组点标准品绘制为标准曲线以获得线性关系。然后根据标准曲线计算不同样本的拷贝数。为了确定qRT-PCR结果的检测限，将90微升超纯水分别加入六个试管中。为制备针对消除区的质粒六级十倍系列稀释液，首先将10微升质粒工作稀释液转移至含有90微升超纯水的试管中。短暂涡旋振荡并离心该试管。然后从该管中取10微升转移至下一管水中。涡旋混匀并离心后，重复转移操作，直至所有水样管均接收到质粒。按照本视频前述方法对六个十倍梯度稀释的DNA进行扩增后，确定消除带（abatement zone），即产生阳性信号的最后一种质粒稀释度以及首次未检测到信号的稀释度。为制备六组两倍系列稀释液，向六个试管中各加入25微升超纯水。从十倍稀释液中最后一个产生阳性信号的质粒稀释管中，取25微升转移至第一个装有水的试管中。涡旋混匀并离心，然后按照上述方法制备剩余的五个稀释液。按照本视频前面所述方法，对梯度稀释的DNA样本进行扩增。在完成三次独立实验的DNA扩增后，计算每个质粒浓度水平下24个重复样本中呈阳性的重复数。确定95%置信度下的检测下限（LOD 95% PCR），即在24个重复样本中检测到23个阳性结果的最低浓度水平。为确定该方法的检测限，从质粒工作液中取 25 µL 开始，该工作液浓度比十倍稀释后仍能产生阳性信号的最低浓度高四倍，以此制备五份两倍系列稀释液。扩增步骤中使用的质粒来自在特定区域配制的质粒工作液，以避免污染。此步骤至关重要。从每个质粒稀释液中转移5微升至含有135微升阴性资源材料的四个试管中，以获得五个阳性标准品的四份重复样本。对这五个阳性标准品的四份重复样本进行提取，并按照本视频前面所述的方法进行扩增。对每个质粒浓度水平的八份重复样本，统计其中阳性重复样本的数量。最后，确定检测限（LOD）方法，即在八次重复中全部八次均为阳性的最高稀释度。本视频中描述的定量RT-PCR方法用于检测和定量马疱疹病毒-2（equid herpesvirus-2）在呼吸道液体中的含量。在本实验中，通过十倍系列稀释来估算检测下限范围，该范围位于10⁻⁹与10⁻¹⁰稀释度之间。在消除区域中通过新的两倍连续稀释法确定LOD PCR值。为确定线性范围和LOQ PCR，以LOD PCR值作为起始点，进行六次十倍连续稀释，稀释范围从每2.5微升样品2.6拷贝（即LOD PCR值）至260,000拷贝。LOQ PCR为线性范围中的最低浓度。该方法的整体表征涵盖了从呼吸道样本中提取DNA，到目标物的扩增与定量，获得qRT-PCR数据所需所有步骤的验证。本图展示了该qRT-PCR完整分析方法定量性能的评估与验证结果，以准确度概况图表示。如图所示，对172份来自患有呼吸道疾病的马匹的鼻拭子样本中的EHV2病毒基因组载量进行了定量分析。年轻马匹体内的病毒基因组载量较高，最高载量达到每毫升 1.9 × 10¹¹ 拷贝。一旦掌握该技术，每个扩增步骤可在两小时内完成，若操作得当，全部验证步骤可在四周内完成。在进行该操作时，必须注意避免污染风险，尤其是在处理质粒溶液时。完成此操作后，可进行其他方法（如测序），以回答更多问题，例如基因组鉴定。观看本视频后，您应充分了解如何进行 DNA 的提取与扩增，并能够表征其 PCR 产物。请务必注意，操作病原体等生物样本可能具有极高危险性。进行该操作时，应始终采取一些预防措施，例如在通风橱内操作，并在具备适当安全等级的区域中进行。

development-validation-quantitative-pcr-method-for-equid-herpesvirus

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