Name: 高清傅立叶变换人体组织切片红外（FT-IR）光谱成像对提高病理 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: 学习使用高清傅立叶变换红外光谱成像技术获取人体组织切片的生化信息。该方法无需染料即可揭示组织固有生物化学特征，有助于疾病诊断与预后评估，为病理学研究提供重要工具。

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我们感谢伊利诺伊大学芝加哥分校病理学系提供的经费支持。组织学和可见光成像服务由伊利诺伊大学芝加哥分校研究资源中心——研究组织学与组织成像核心设施提供，该核心设施的建立得到了研究副校长办公室的支持，特别是感谢瑞安·迪顿（Ryan Deaton）和安迪·霍尔（Andy Hall）的专业技术支持。我们还要感谢安捷伦科技公司（Agilent Technologies），特别是弗兰克·韦斯顿（Frank Weston）在支持工作以及出借额外红外镜头方面所提供的帮助。

1. 设置傅里叶变换红外显微镜并获取组织图像
<ol>
	<li>使用切片机将甲醛固定石蜡包埋的组织块以 4 μm 厚度切片至适用于红外（IR）检测的载玻片上。或者，使用恒冷箱切片机将液氮冷冻的组织以 4 μm 厚度切片至 IR 兼容载玻片上。 
	注意：通常还会在普通玻璃载玻片上切取连续切片，并用特殊染色（如苏木精-伊红染色（H&amp;#38;E））或免疫组织化学染色进行染色。此外，也可将培养的细胞系直接生长在 IR 兼容载玻片上。IR 兼容载玻片可以是用于反射模式成像的 IR 反射载玻片（例如 MirrIR 载玻片、金镀层），或用于透射模式成像的 IR 透明载玻片（例如 BaF2、CaF2）。</li>
	<li>使用干燥空气或干燥氮气对傅里叶变换红外（FT-IR）显微镜和光谱仪进行吹扫，以去除系统中的大气水分。成像前至少等待 45 分钟，确保系统充分吹扫。</li>
	<li>使用液氮冷却 FT-IR 显微镜中的焦平面阵列（FPA）探测器（至 79 K）和内置的 MCT 探测器。大约每 6 小时需重新冷却一次探测器。 
	警告！液氮为低温液体，可导致冷灼伤、冻伤，在密闭空间中还可能引起窒息。</li>
	<li>将样本载玻片安装在 FT-IR 显微镜的载物台上进行成像。</li>
	<li>确保可见光源已开启，然后通过双目镜或样本捕获程序（该程序提供组织的实时可见光图像）对样本进行调焦。</li>
	<li>打开配套软件包（如 Resolutions Pro），点击“Collect”，然后点击“Diagnostics”，再选择“Align Spectrometer”。确保光路通往光谱仪内部探测器的路径无遮挡。</li>
	<li>点击“Imaging Setup”。</li>
	<li>在“Electronics”选项卡中，根据系统情况选择合适的“Speed”（速度）、“Under Sampling Ratio (UDR)”（欠采样比）和“Filters”（滤光片）设置。 
	注意：本示例中设置为 Speed = 2.5 KHz，UDR = 4，Filters = None（无）。</li>
	<li>在“Optics”选项卡中，确保选择“Mid-IR source”（中红外光源）、“Open aperture”（开放光圈）和“100% beam attenuator”（100% 光束衰减器）。</li>
	<li>为校准系统，在“Optics”选项卡中，将“Detector”设为“Ground”（接地），将“Microscope Detector”设为“Left”（左侧），然后根据所用载玻片类型在“Optics mode”下选择“Transmittance”（透射）或“Reflectance”（反射）。</li>
	<li>点击“Setup”，将弹出“Lancer Control”窗口。 
	注意：反射模式请遵循 1.12 和 1.13 步骤，透射模式请遵循 1.14 至 1.16 步骤。之后从 1.17 步骤继续执行。</li>
	<li>对于反射模式，在“Lancer Control”中点击“Raw”。使用载物台控制摇杆并观察 FT-IR 干涉图图像的实时画面（右上角图像），移动至载玻片上的洁净区域。</li>
	<li>将积分时间调整至约 8,000 计数。接着移动载物台，寻找具有组织结构的区域，优先选择组织边缘，并精确调焦图像。可调整“Warmth”（色调）和“Contrast”（对比度）选项以辅助成像，从而改善聚焦效果，但这些调整对红外数据无影响。继续执行 1.18 步骤。</li>
	<li>对于透射模式，在“Lancer Control”中点击“Raw”。使用载物台控制摇杆并观察 FT-IR 干涉图图像的实时画面（右上角图像），移动至载玻片上的洁净区域。</li>
	<li>将积分时间调整至约 8,000 计数。</li>
	<li>调节底部聚焦/聚光镜物镜，使计数达到最大值。观察 Lancer Control 中右下角图像的形状，确保其呈高斯分布且相对均匀。再次将积分时间调整至约 8,000 计数。 
	注意：若 FT-IR 干涉图图像中任何像素变为白色，应降低积分时间。</li>
	<li>移动载物台，寻找具有结构的组织区域，优先选择组织边缘，并精确调焦图像。可选地，调整色调和对比度选项以辅助成像，改善聚焦，但这些调整对红外数据无影响。</li>
	<li>使用载物台控制摇杆，移动至载玻片上的洁净区域。按下“Calibrate”按钮。确保“Out Of Range (OOR)”值小于 50，且“High Flux”与“Low Flux”计数之间的差值至少为 4,000 计数。</li>
	<li>连续点击“OK”两次。在“Optics”选项卡中选择：“Detector” = “MCT”，“Microscope Detector” = “Right”，然后点击“Setup”。此时屏幕上将显示 FT-IR 干涉图。点击“Find Centerburst”，再点击“Okay”。</li>
	<li>在“Optics”选项卡中，重新选择“Detector” = “Ground”，“Microscope Detector” = “Left”，然后点击“Setup”。</li>
	<li>在 Lancer Control 中——确保图像仍位于洁净区域，再次点击“Calibrate”。点击“Okay”。</li>
	<li>接下来，采集背景 FT-IR 图像，以校正大气、系统和载玻片的吸收影响。进入“Electronics”选项卡，选择适当的光谱分辨率，通常组织样本为 4 cm-1 或 8 cm-1 。</li>
	<li>进入“Background”选项卡，在“Scans to co-add”中输入 128。点击“New File…”按钮，并将背景文件保存至适当文件夹。检查“Imaging”选项卡，确保拼接图像（mosaicing）设置为 1×1。点击“Background”，等待扫描完成，并确认文件保存位置。在背景 FT-IR 图像上点击某一区域并检查其光谱。</li>
	<li>为获取样本的大范围拼接图像，选择“Imaging”选项卡，并输入所需的 X 和 Y 方向图像帧数以设定拼接尺寸。</li>
	<li>点击“Setup”，在 Lancer Control 中使用实时红外图像定位感兴趣区域。若进行拼接成像，应将实时画面居中于感兴趣区域中央。点击“Okay”。进入“Electronics”选项卡，输入需累加的扫描次数（通常组织样本为 2 至 16 次）。点击“Scan”。</li>
	<li>在屏幕上检查采集到的 FT-IR 图像，确保其聚焦良好。点击图像以提取该位置的红外光谱，并检查信噪比是否可接受。同时采集样本的可见光图像。</li>
	<li>保存图像并将其导出为所需格式，例如 ENVI-IDL。</li>
</ol>
2. 为傅里叶变换红外显微镜适配高分辨率功能
注意：大多数傅里叶变换红外光谱（FT-IR）系统配备的物镜放大倍数约为15倍，数值孔径（NA）为0.5。为了实现高分辨率成像，可使用与红外兼容的36倍或74倍物镜，以获得衍射极限的成像能力。
<ol>
	<li>通过逆时针旋转卸下系统的 15X 物镜。</li>
	<li>将 36X 或 74X 物镜旋入其位置。使用前需对物镜进行对齐。使用镜头延长管将物镜调整至足够接近样品的位置。</li>
	<li>将组织置于新物镜下方，使用双目镜或 Sample Capture 程序通过可见光进行聚焦。 
	注意：高分辨率成像必须在透射模式下进行。由于这些物镜的工作距离非常短（1–2 mm）且景深极浅，因此必须缓慢而小心地聚焦，花时间将物镜逐渐降低，避免接触样品。</li>
	<li>按照步骤 1.6 至 1.11 的说明操作。 
	注意：由于聚焦难度显著增加且到达探测器的光量大幅减少，以下步骤根据 1.14 进行了调整。</li>
	<li>在透射模式下，点击“Raw”。使用载物台控制摇杆并观察 FT-IR 干涉图图像的实时画面（右上角图像），移动至组织区域并进行聚焦（理想情况下选择组织边缘）。 
	注意：此过程可能较为困难，因此可调整“Warmth”和“Contrast”选项以帮助形成图像，从而改善聚焦效果（这些选项对红外数据无影响）。</li>
	<li>聚焦完成后，使用载物台控制摇杆和实时红外图像，移动至玻片上的干净区域。将积分时间调整至约 8,000 计数。调节底部聚焦物镜，使计数达到最大值。再次将积分时间调整至约 8,000 计数。</li>
	<li>移动载物台，寻找具有结构特征的组织区域，优先选择组织边缘，并进一步优化图像聚焦。</li>
	<li>若需在高分辨率下进行图像拼接，请调整载物台，确保其可在所需距离内准确移动以实现精确拼接。如需更改载物台距离设置，请进入 Lancer Control 中的“Setup stage”选项，并调整水平和垂直对齐参数，以确保正确拼接。</li>
	<li>使用载物台控制摇杆移动至玻片的干净区域。按下“Calibrate”按钮。确保 36X 和 74X 物镜的超出范围（OOR）值均小于 50。确保 74X 物镜的高通量与低通量值之差至少为 1,000 计数，36X 物镜至少为 2,000 计数。</li>
	<li>继续执行步骤 1.19 至 1.27。由于信号减弱，步骤 1.23 和 1.25 中的扫描次数需相应调整：背景图像约为 256 次扫描，组织图像为 16 至 128 次扫描。</li>
</ol>
3. 红外光谱数据集的可视化与分类
注意：在本节中，我们将讨论如何使用地理空间图像处理与分析软件（如 ENVI+IDL）对光谱图像进行可视化和数据提取，但该过程与其他软件（如 MATLAB、免费软件 CytoSpec 或仪器开发商自有的软件）中的操作也非常相似。针对红外数据，可采用几种不同的光谱处理技术。
<ol>
	<li>打开地理空间图像处理与分析软件，并加载红外（IR）数据文件。</li>
	<li>通过选择“Spectral tools”并向下滚动后点击“Absorbance spectra”，对红外数据应用基线校正算法。观察弹出菜单并选择“Baseline correction”。 
	注意：基线校正将消除由于散射引起的光谱数据中的基线偏移或斜率</li>
	<li>进行光谱归一化处理，方法是将数据与某一特定光谱峰（通常为酰胺I带（1,650 cm-1）或酰胺II带（1,550 cm-1））或光谱中某一定义区域下的面积进行比值计算。可通过在“Absorbance Spectra”菜单选项下选择“Normal spectra”来实现。 
	注意：进行光谱归一化的目的是确保所观察到的光谱差异反映的是真实的生化差异，而非由样品厚度或密度差异所致。</li>
	<li>如有必要，使用降噪算法去除光谱中的噪声28。 
	注意：目前存在多种可实现基线校正、光谱归一化和降噪的方法，大多数软件均内置了自动化的算法。此外，近年来还涌现出一系列用于校正光谱畸变的方法，已有详细讨论29-42；然而，学术界尚未就哪些方法是必需的达成共识。</li>
	<li>观察图像中采集到的所有红外频率列表（通常光谱范围为900至4,000 cm-1）。点击对应于特定生物分子的频率，以查看该频率下组织的图像。
	<ol>
		<li>例如，点击1,650 cm-1波段以观察样品中蛋白质的分布情况；或点击1,080 cm-1波段以观察样品中核酸的分布情况。使用波数1,650 cm-1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过计算光谱峰高比值、峰面积比值等方法生成额外图像，以实现对不同生物分子组分的可视化。点击“Spectral Tools”，然后选择“Peak Height Ratios”或“Calculate Image Area”来创建图像。</li>
	<li>使用另一套可捕获明场图像的全片扫描成像系统，对相应的相邻组织切片进行扫描。在红外图像旁，使用可见光图像程序调出染色组织的数字图像。</li>
	<li>在图像的兴趣区域右键点击并选择“Z profile”，以获取所选像素点的光谱信息。</li>
	<li>查看来自多个类别（如不同细胞类型、疾病状态）的多个像素点的红外光谱。使用“Regions Of Interest”（ROI）工具在图像上标记特定像素点。操作方法为：在图像上右键点击并选择“ROI tool”。创建需要标注的类别，例如正常、异型增生和癌症类别。然后选择“ROI type”——“Point”。选择待标记的类别，并在红外图像上相应位置绘制像素点。使用“Average ROI”工具计算每一类别的平均光谱。</li>
	<li>通过绘图软件绘制并比较所获得的光谱。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

傅里叶变换红外光谱（FT-IR）是一种新兴的无标记生化成像技术，可用于组织切片的检测，在提升当前病理学诊断标准方面具有重要意义。目前病理学的金标准需要对组织进行活检，经福尔马林固定、石蜡包埋，多次切片并使用多种染色方法染色。随后，由经验丰富的病理医师主观地通过视觉评估组织结构和细胞形态，从而做出诊断。本文展示了如何从同类组织切片中采集高分辨率红外图像，并讨论了一些用于分析不同细胞类型及疾病状态下化学差异的计算方法。
本方案中的关键步骤是确保组织样本被非常仔细地对焦，并确保系统经过良好校准，以获得高质量的光谱数据。在使用高倍物镜时，系统设置过程中的细致操作尤为关键。为帮助排查问题，以下列出了一些可能遇到的潜在困难：
问题：反射模式成像时红外信号强度较低。解决方案：检查红外载玻片的方向，因为反射涂层可能位于载玻片的错误一侧。
问题：Lancer 控制系统中信号弱/出现红色警告标志。解决方案：使用液氮（LN2）冷却探测器。焦平面阵列（FPA）探测器需要液氮才能正常工作，需定期补充液氮。
问题：速度误差/运动误差。解决方案：重置光谱仪并减少振动。振动会导致干涉仪中的移动镜面受到干扰。
问题：数据中出现水蒸气峰。解决方案：增加系统吹扫，并使样品免受空气影响。
问题：中心峰无效。解决方案：重新寻找中心峰。
问题：尽管已聚焦，透射过程中的通量差异仍较低。解决方法：调节底部聚光器。此现象是由于红外光未能在样品上聚焦成一个点所致。
本文重点介绍如何以透射或漫反射模式获取组织的高清晰度红外图像。傅里叶变换红外成像（FT-IR imaging）的特点在于，数据采集过程中可进行多种调整，例如基底类型、固定方法、样品厚度、光谱分辨率、干涉仪镜面速度等。这些参数的影响最近已有详尽讨论4,5,17,51。
可对成像系统进行多种改进，包括以ATR模式成像10,24,26以及采用纳米级热分析方法52,53，以实现高分辨率红外成像。高分辨率红外成像的主要限制在于组织样本必须经过仔细制备，并且足够薄以允许红外光穿透（通常厚度为4 μm）。此外，由于水对红外光具有吸收作用，透射式和反射式傅里叶变换红外（FT-IR）成像要求样本处于干燥状态。然而，FT-IR成像相较于其他技术具有显著优势，能够快速对大面积组织进行成像，同时获取丰富且详细的生化信息。其他以无标记方式获取生化信息的类似技术包括拉曼光谱，但其数据采集速度较慢，成像耗时较长。目前新兴的拉曼成像技术包括受激拉曼散射（SRS）和相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）；然而，这些技术的光谱范围有限，或仅能实现单频率成像。
数据采集速度、空间分辨率以及计算方法的可及性等方面的进步，极大地推动了傅里叶变换红外成像（FT-IR成像）作为一种新型病理学成像工具向临床转化的可行性。近年来空间分辨率的提升尤为关键，因为传统FT-IR成像系统无法分辨组织病理学中的某些重要细胞类型。Reddy et al. 最近发表的研究展示了如何构建理想系统以实现FT-IR成像系统的最优空间分辨率5。本文中展示的肾组织示例说明了更高空间分辨率在从肾小球结构中提取生化信息方面的重要性（图&#160;3 和 图&#160;5）。未来，量子级联激光器作为高亮度红外光源54-57、三维光谱成像58，以及纳米级红外技术领域52,53,59,60的新进展，将为组织成像研究开辟令人振奋的新方向，可能对未来组织成像产生重大影响。
我们展示了肝脏和肾脏疾病中的一些应用实例，这些领域需要额外的生化信息以提供诊断价值。位于伊利诺伊大学芝加哥分校病理学系的光谱病理学实验室，致力于将红外成像技术转化为改进疾病诊断和更准确预测患者预后的临床工具。傅里叶变换红外（FT-IR）成像技术有望克服当前病理学实践中对定量和客观信息需求所面临的部分局限性。特别是，未来的研究重点在于识别当前病理实践中的薄弱环节，即现有技术无法提供足够的诊断敏感性或信息量有限的领域。当前病理学实践亟需改进，以向病理医师提供关于患者疾病状态的更多、更详尽的信息，而高分辨率FT-IR成像技术可能实现这一目标。

红外光谱技术自20世纪30年代以来便以某种形式成为一种分析工具；然而，直到过去十年，傅里叶变换红外光谱（FT-IR）在组织成像领域的应用才迅速发展。FT-IR在组织成像方面的进步主要得益于三个关键进展：1）由于配备了通常包含数千个红外敏感探测器的大型焦平面阵列（Focal Plane Array, FPA）探测器，数据采集速度显著提高1,2；2）先进数据处理算法的发展以及用于处理大规模高光谱数据集的计算能力的提升3；3）对FT-IR成像系统的建模优化，以实现空间分辨率的最大化4,5。近年来已发表大量高质量且内容详尽的综述文章，全面回顾了FT-IR光谱领域的发展6-16，此外还有一篇《自然实验手册》（Nature Protocols）论文详细描述了从组织样本获取点光谱或图谱的步骤17。本文将重点介绍在经过改装并具备高分辨率成像能力的FT-IR系统中，使用128 × 128 FPA探测器获取组织图像的实验方案。
由于傅里叶变换红外（FT-IR）成像能够获得每个像素都包含丰富生化信息的图像，长期以来被认为是一种用于细胞和组织成像的潜在理想工具。FT-IR成像基于这样一个原理：样品中的不同生物分子会定量吸收中红外光谱的不同区域，从而可获得一种“生化指纹”。大量研究已表明，这种生化指纹在不同细胞类型和疾病状态下会发生改变。与传统病理学实践中需要使用染色剂和免疫组织化学标记物来可视化并识别用于指导诊断和治疗方案的细胞类型及组织结构不同，FT-IR图像的形成依赖于组织固有的生化特性。目前用于诊断的组织染色技术耗时较长、具有破坏性、操作繁琐，且依赖病理学家的主观判断；而FT-IR技术则有望使该过程变得快速、无损、高度自动化且更具客观性。此外，FT-IR还提供了一种获取额外生化信息的新途径，这些信息可能难以通过传统的染色技术获得。
近年来最令人振奋的进展之一是高分辨率成像技术的出现，这些技术能够实现对细胞类型和组织结构的可视化与表征，而这对于全面的疾病诊断至关重要。其中一种技术是衰减全反射（Attenuated Total Reflectance, ATR）傅里叶变换红外光谱（FT-IR），该技术结合了高折射率的固体浸没透镜（SIL），可实现高分辨率成像18，已有许多极具前景的研究展示了其应用价值19-25。此外，最近的研究表明，ATR成像所具备的更高空间分辨率能够实现对乳腺组织中内皮细胞和肌上皮细胞的可视化与分类，而这两类细胞是乳腺癌诊断中的关键组成部分26。尽管ATR成像非常有用，但该技术需要SIL与组织直接接触才能生成FT-IR图像；因此，在需要快速成像大面积组织的组织病理学应用中，其使用受到一定限制。
另一种方法是将高倍物镜耦合到现有的傅里叶变换红外（FT-IR）系统上，该系统使用同步辐射作为明亮的红外光源，从而能够完全照亮焦平面阵列（FPA），并实现有效像素尺寸为 0.54 × 0.54 μm 的成像。这使我们能够可视化乳腺和前列腺组织中的关键结构，而这些结构在传统 FT-IR 系统下无法分辨4。尽管红外图像空间分辨率的这一显著提升令人振奋，但其应用仍受限于对同步辐射光源的需求。随后，研究人员设计出一种优化系统，能够在无需同步辐射光源的情况下，仅使用传统的陶瓷红外光源（globar IR source），实现像素尺寸为 1.1 × 1.1 μm 的高清晰度成像5。本文中，我们展示了如何改造现有的商用 FT-IR 成像系统，使其能够结合多种红外物镜（15X、36X 和 74X），在可接受的信噪比条件下实现组织的衍射极限红外成像。三种物镜对应的有效像素尺寸分别为 5.5 × 5.5 μm（15X）、2.2 × 2.2 μm（36X）和 1.1 × 1.1 μm（74X）。随后，我们举例说明了在肝脏和肾脏活检样本中，空间分辨率提升对于疾病检测的重要意义27。

<table><tbody><tr><td>Cary 600 系列傅里叶变换红外光谱系统</td><td>Agilent</td><td>多种配置&amp;nbsp;</td><td>存在其他可选的傅里叶变换红外成像系统</td></tr><tr><td>可调反射式物镜 74X/0.65 NA IR</td><td>Edmund Optics</td><td>66-592</td><td></td></tr><tr><td>可调反射式物镜 36X/0.5 NA IR</td><td>Edmund Optics</td><td>66-586</td><td></td></tr><tr><td>MirrIR 载玻片</td><td>Kevley Technologies</td><td>CFR</td><td>用于傅里叶变换红外反射模式测量</td></tr><tr><td>氟化钡载玻片</td><td>International Crystal Laboratories</td><td>多种尺寸</td><td>用于傅里叶变换红外透射模式测量</td></tr><tr><td>氟化钙载玻片</td><td>International Crystal Laboratories</td><td>多种尺寸</td><td>用于傅里叶变换红外透射模式测量</td></tr><tr><td>干燥氮气/干燥空气气体</td><td>多家气体供应商</td><td>多种规格</td><td></td></tr><tr><td>正己烷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>多种规格</td><td>用于组织脱蜡</td></tr><tr><td>液氮</td><td>多家低温液体供应商</td><td>多种规格</td><td></td></tr><tr><td>ENVI-IDL 软件</td><td>Exelis-Vis</td><td></td><td>其他可用的软件包</td></tr><tr><td>全片扫描仪</td><td>Scanscope (Aperio) 或 Nanozoomer (Hamamatsu)</td><td></td><td>用于成像染色载玻片</td></tr></tbody></table>

高分辨率傅里叶变换红外（ft-ir）光谱成像技术在人体组织切片中的应用以提升病理学诊断水平

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

高分辨率傅里叶变换红外（FT-IR）光谱成像是一种新兴技术，可获得具有相关生化信息的详细图像。组织的FT-IR成像基于中红外区不同波段被细胞或组织内不同化学键（例如，C=O、C-H、N-H）吸收的原理，从而反映生物分子（例如，脂质、DNA、糖原、蛋白质、胶原蛋白）的存在与组成。在FT-IR图像中，每个像素均包含完整的红外（IR）光谱，可提供有关细胞生化状态的信息，进而用于细胞类型或疾病类型的分类。本文中，我们展示：如何使用FT-IR系统获取人体组织的IR图像，如何改造现有仪器以实现高分辨率成像能力，以及如何可视化FT-IR图像。随后，我们以肝脏和肾脏为例，介绍FT-IR在病理学中的一些应用。FT-IR成像在提供细胞和组织生化信息方面具有广阔前景，它以完全无标记、非侵入的方式，为了解疾病过程中生物分子的变化提供了新视角。此外，这种生化信息还可能有助于实现疾病诊断中某些方面的客观化和自动化分析。

傅里叶变换红外（FT-IR）成像技术能够获得组织的红外图像，其对比度可根据感兴趣的红外频率而变化。此外，在一幅红外图像中，每个像素都包含完整的红外光谱，其中不同的吸收峰对应不同的生物分子，可提供有关细胞类型或疾病状态的生化特性信息（图1）。本文已展示了如何在不同类别之间比较光谱特征，但还可通过使用其他算法3,43-50（如贝叶斯分类、随机森林、人工神经网络和层次聚类分析）对数据进行更高级的自动化分类。有监督分类方法可用于构建分类器，通过训练实现对细胞类型或疾病状态的自动识别；无监督分类方法则可用于探测由于生化差异导致的组织或细胞中自然存在的差异。
在过去的几十年中，傅里叶变换红外光谱（FT-IR）仪器不断发展，从最初使用红外不透明光阑进行单点测量或映射模式，发展到如今采用卡塞格林物镜的成像模式，该模式可在透射模式下使用照明物镜与收集物镜耦合，或在反射模式下使用同一物镜同时进行照明和信号收集（图2）。最近的研究表明，在透射模式下，可将收集物镜更换为更高放大倍数和更高数值孔径的物镜，从而实现衍射极限的红外成像，显著提高所采集红外图像的空间分辨率4,5。空间分辨率的提升对于组织成像至关重要，如今我们已能够识别细胞类型和组织结构，例如利用自行改装的实验室FT-IR系统识别肾脏的功能单位——肾小球（图3）。
高分辨率傅里叶变换红外成像技术可用于详细分析组织图像，以识别异常区域，并区分不同细胞类型的生化差异。在肝组织芯样本中，可清晰观察到肝细胞以及浸润性纤维化区域，后者将两片不同的异型增生区与非异型增生性肝硬化区分开来（图4）。我们正致力于利用该技术开发自动化诊断工具，以应用于疑难肝病病例的诊断。
重要的是，现在提高的空间分辨率使我们能够在组织学变化显现之前，分离出可能因疾病而发生化学修饰的特定结构特征。例如，我们的研究重点是在病理学家观察到变化之前，识别肾脏肾小球结构（如肾小囊、系膜、肾小球基底膜和肾小管基底膜）中的生化改变（图5）。特别是，我们致力于识别与糖尿病肾病进展以及移植患者慢性排斥反应相关的改变，而目前的技术尚无法在足够早期的阶段发现这些变化，从而难以实现有效的干预。
<img alt="组织学与组织FTIR光谱；显示吸光度与波数关系的示意图，带有峰值。" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 肝组织穿刺样本的傅里叶变换红外成像与光谱。 （A）肝活检组织H&amp;E染色切片图像，以及同一穿刺样本连续切片在（B）3,286 cm-1 和（C）2,603 cm-1 处的红外吸光度图像，突出显示了不同的结构特征。（D）组织典型的红外光谱图，重要吸收峰已标注。比例尺 = 100 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="透射与反射模式红外显微镜示意图；组织切片红外载玻片及物镜。" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 详细说明傅里叶变换红外显微镜操作模式的光学示意图。（A）在透射模式下，样品通过底部物镜被照明，穿过样品的光由顶部物镜收集。（B）在反射模式下，顶部物镜既用于照射样品，也用于收集反射光。底部物镜不使用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜图像、细胞结构分析、灰度显微镜、细胞细节分辨率比较。" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 不同显微镜物镜对肾小球在2,925 cm-1处FT-IR图像的比较。（A）15X收集物镜，数值孔径NA = 0.5（像素尺寸为5.5 × 5.5 µm）。（B）36X收集物镜，NA = 0.5（像素尺寸为2.2 × 2.2 µm）。（C）74X收集物镜，NA = 0.65（像素尺寸为1.1 × 1.1 µm）。比例尺 = 50 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肝细胞与纤维化组织分析；吸收光谱、组织学、生化差异。" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 肝脏组织芯中纤维化组织与肝细胞的光谱差异。（A）肝活检组织的 H&amp;E 染色切片。（B）连续切片组织芯在傅里叶变换红外光谱（FT-IR）下扫描的图像（36倍物镜设置）。（C）从（A）和（B）中标注箭头所示区域提取的肝细胞和纤维化组织的代表性光谱。比例尺 = 100 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肾小球组织学；膜的FTIR光谱；显微图像；光谱分析。" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图5"> 
图5. 利用高分辨率傅里叶变换红外成像技术对肾组织活检特征进行区分。（A）过碘酸雪夫染色切片，标示出待提取的特征结构。（B）同一组织连续切片在CH2不对称伸缩振动区域（36倍物镜设置）的高分辨率傅里叶变换红外成像。（C）利用（B）中的傅里叶变换红外图像提取（A）中标注的特征，从而实现对组织中四种特征结构的化学区分。比例尺 = 50 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

傅里叶变换红外（FT-IR）光谱成像是一种快速、无需标记的细胞和组织生化数据获取方法。本文展示了如何获取高分辨率的组织切片FT-IR图像，以提升疾病诊断的准确性。

高分辨率傅里叶变换红外（FT-IR）光谱成像技术在人体组织切片中的应用以提升病理学诊断水平

高分辨率傅里叶变换红外（FT-IR）光谱成像是一种新兴技术，可用于获取具有相关...的详细图像

本实验的总体目标是获得组织样本的高分辨率红外图像。首先将组织样本切片并置于兼容红外成像的载玻片上，以完成第一步。第二步是通过安装合适的物镜来搭建高分辨率成像装置。接下来，采集底物的背景信号，并对组织样本进行扫描。最后一步是使用适当的软件进行数据处理和可视化。最终，利用高分辨率红外成像以非侵入性的方式对生物组织进行可视化并获取其生化信息。与现有的光学显微镜等方法相比，该技术的主要优势在于无需使用染料或探针即可研究组织固有的生物化学特性。该方法有助于回答病理学领域的关键问题，例如预测糖尿病肾病的复发以及通过HEPA细胞成骨作用对肝病进展进行分类。鉴于该技术能够提供传统组织病理学无法获得的大量生物化学信息，其在疾病诊断与预后方面具有广泛的应用前景。尽管该方法可用于诊断，也可用于追踪伤口愈合过程中的变化，并鉴定胃肠道和脑组织中的干细胞等关键组织特征。使用切片机将福尔马林固定、石蜡包埋的组织块切成四微米厚度，并贴附于红外兼容载玻片上。此后，使用干燥空气吹扫傅里叶变换红外显微镜和光谱仪，以去除系统中的大气水分。然后，使用液氮冷却显微镜中的焦平面阵列探测器和内置的汞镉碲探测器。在确保可见光源已打开后，将样品载玻片放置在显微镜载物台上，用于进行傅里叶变换红外成像，并使用样品采集程序对样品进行聚焦。接下来，打开配套软件包并点击采集。点击诊断并选择线阵光谱仪。然后点击成像设置以校准系统。在光学选项卡中，将检测器选择为地面显微镜检测器并置于左侧，然后在光学模式下选择透射率。单击设置，这将在Lancer控制中打开透射模式的Lancer控制窗口。使用载物台控制操纵杆单击原始位置，并观察FTIR干涉图图像的实时画面，将图像移动到载玻片的干净区域。此时，调整积分时间至约 8,000 计数，并调节底部聚光镜物镜。为使计数达到最大值，请观察激光控制界面中右下角图像的形状，确保其呈高斯分布且相对均匀。调整积分时间后，再次移动载物台，寻找具有结构的组织区域，优选组织边缘部位。然后优化图像的焦距。使用载物台控制摇杆，移动到玻片的干净区域。选择后按下校准按钮。好的，在光学选项卡中两次选择检测器等于MCT，显微镜检测器等于右侧。然后点击设置。当屏幕上显示FTIR干涉图后，点击寻找中心脉冲并确认。在光学选项卡中，重新选择检测器等于接地显微镜检测器等于左侧。然后选择设置。在确保图像仍在Lancer控制中的洁净区域后，再次单击校准并确认。为采集背景傅里叶变换红外（FTIR）图像，请转到电子选项卡并选择适当的光谱分辨率，通常为4或8 cm⁻¹。对于组织样本，请转到背景选项卡，在扫描次数（scans to coad）中输入128。点击新建文件按钮，并将背景文件保存至相应文件夹中。单击背景并等待扫描完成后，确认文件的保存位置。在背景、FTIR 图像上单击某个区域，并检查光谱。此时，单击设置，在 Lancer 控制中使用实时红外视图。为找到目标区域，请进入电子标签页并输入需合并的扫描次数，然后点击扫描。为准备进行高分辨率分析的傅里叶变换红外显微镜，将高倍物镜拧入以替换原有的15倍物镜。此时，打开图像处理与分析软件，并加载红外数据文件。通过选择光谱工具对红外数据应用基线校正算法，向下滚动并点击吸收光谱。当弹出菜单出现时，选择基线校正。在吸收光谱菜单选项下选择归一化光谱，进行光谱归一化处理。随后，观察在图像中采集到的所有红外频率列表。单击与特定生物分子相对应的频率，以查看在选定频率下的组织图像，从而生成能够显示不同生物分子组分的图像。单击光谱工具，然后选择峰高比。使用另一套能够同时采集明场图像和红外图像的全片成像系统，扫描对应的相邻染色组织切片。通过可见光图像程序调出染色组织的数字图像。随后，在感兴趣区域右键点击图像，选择Z轴轮廓（Z profile），以获取所选像素处的光谱信息。要在图像上标记特定像素，可右键单击图像并选择 ROI 工具。创建需要标注的类别，例如 Meum 和 Bowman's capsule 类别。然后选择 ROI 类型为点，接着选择要标注像素的类别，并在红外图像上相应的位置绘制像素点。使用平均 ROI 工具计算每个类别的平均光谱。最后，通过绘图比较所获得的光谱。在绘图软件中，傅里叶变换红外（FT IR）成像能够生成组织的红外图像，这些图像可根据不同的红外频率提供不同的对比度。每个像素都包含完整的光谱，其不同的峰对应不同的生物分子，可提供关于细胞类型或疾病状态的生化特性信息。傅里叶变换红外（FTIR）仪器已从最初使用不透光光阑进行单点映射测量，发展到如今采用CASA颗粒物镜的成像模式，该模式可通过透射方式中照明物镜与收集物镜的组合，或通过单一物镜在反射模式下同时实现照明与信号收集。空间分辨率在组织成像方面的进步至关重要，因为现在已能够识别出不同的细胞类型和组织结构。在此情况下，可在肝组织芯中观察到肾小球功能单位。可以清晰辨识出肝细胞以及浸润性纤维化区域，该纤维化区域将两片不同的异型增生区与非异型增生性肝硬化区分开来。提高的空间分辨率使得能够在组织学改变显现之前，分离出可能因疾病而发生化学修饰的特定结构特征。通过傅里叶变换红外成像（FTIR成像）可识别肾小球结构（如肾小囊、内皮、肾小球基底膜和肾小管基底膜）中的生化变化。在进行该操作时，需注意在扫描前务必彻底去除载玻片上的水分。完成此步骤后，可对同一组织切片进行其他方法检测，例如传统的免疫化学分析，以关联生化特征与组织形态学。我们的首个开发成果，该技术为组织成像领域的研究人员探索组织内小型细胞类型和结构的生物分子状态铺平了道路。观看本视频后，您应基本掌握如何获取组织样本的高分辨率FTR图像，并进行基本的光谱分析。请务必注意，使用液氮可能具有极高危险性，在执行该操作时，必须采取安全防护措施，例如佩戴耐低温手套和护目镜。

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高清傅立叶变换人体组织切片红外（FT-IR）光谱成像对提高病理

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此处，我们介绍一种利用光学光热红外-荧光技术的实验方案 原位 杂交技术（OPTIR-FISH），也称为中红外光热-FISH（MIP-FISH），可用于鉴定单个细胞并研究其代谢活动。该方法具有广泛适用性，可用于多种应用，包括以单细胞分辨率绘制细胞代谢图谱。...

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基于紧凑且超稳定的双折射干涉仪的宽场傅里叶变换显微镜，可对二维探测器的所有像素并行采集光谱。该时域方法能够分离光致发光信号与拉曼信号，并实现快速拉曼成像（约5毫秒/像素），空间分辨率约为1 µm，光谱分辨率约为23...

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体内 近红外荧光（NIRF）血管内分子成像技术对炎症斑块的检测：一种多模态动脉粥样硬化成像方法

高分辨率经颅直流电刺激（HD-tDCS）采用4×1环形电极布局，是一种非侵入性脑刺激技术，兼具传统tDCS的神经调节效应与更高的聚焦性。本文系统性地演示了4×1...

4×1环形高分辨率经颅直流电刺激（HD-tDCS）的技术与应用注意事项

学习使用高清傅立叶变换红外光谱成像技术获取人体组织切片的生化信息。该方法无需染料即可揭示组织固有生物化学特征，有助于疾病诊断与预后评估，为病理学研究提供重要工具。

高分辨率傅里叶变换红外（FT-IR）光谱成像技术在人体组织切片中的应用以提升病理学诊断水平

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