高清傅立叶变换人体组织切片红外（FT-IR）光谱成像对提高病理

傅里叶变换红外 （FT-IR） 光谱成像是一种快速且无标记的方法，可获取细胞和组织的生化数据集。在这里，我们演示了如何获得组织切片的高清 FT-IR 图像，以改善疾病诊断。

该程序的总体目标是获得组织样本的高清红外图像。这是通过首先将组织样本切片到红外兼容载玻片上来实现的。第二步是通过安装适当的物镜来设置高清成像设备。

接下来，收集底物的背景并扫描组织样本。最后一步是使用适当的软件进行数据处理和可视化。最终，高清红外成像用于以非干扰方式可视化和获取生物组织的生化信息。

与光学显微镜等现有方法相比，该技术的主要优点是可以在不使用染料或探针的情况下研究组织的固有生物化学。这种方法可以帮助回答现场病理学的关键问题，例如预测糖尿病肾病的复发和通过 HEPA 汽车成骨对肝病的进展进行分类。该技术的意义延伸到疾病诊断和预后，因为它提供了传统组织病理学无法获得的大量生化信息。

虽然这种方法可以用于诊断。它还可用于跟踪伤口愈合过程中的变化，并识别关键组织特征，例如胃肠道和大脑中的干细胞。使用切片机将 4 微米厚的正式和固定石蜡包埋组织块的第一切片放在 IR 兼容载玻片上。

遵循此。使用干燥空气吹扫 FTIR 显微镜和光谱仪，以去除系统中的大气水。然后使用液氮冷却显微镜中的焦平面阵列检测器和内部碲化汞镉检测器，在确保可见光打开后，将样品载玻片安装在显微镜载物台上进行 FTIR 成像，使用样品捕获程序聚焦在样品上。

接下来，打开捆绑包软件包，然后单击 collect。单击诊断并选择线光谱仪。然后单击 imaging setup（成像设置）以校准系统。

在光学选项卡中，选择探测器作为左侧的地面显微镜探测器，然后在光学模式下选择透射率。单击 setup，这将打开 lancer control 中传输模式的 lancer 控制窗口。使用载物台控制纵杆单击 raw，然后观察 FTIR 干涉图图像的实时视图移动到载玻片的干净区域。

此时，将积分时间调整为大约 8， 000 个计数和底部聚光镜物镜。要将计数数增加到最大值，请观察 lancer 控件中右下角图像的形状，以确保其外观为高斯且相对均匀。调整积分时间后，再次移动载物台以找到一块有结构的组织，最好是组织的边缘。

然后完善图像的焦点。使用 Stage Control 摇杆，移动到幻灯片的干净区域。选择后按下校准按钮。

好的，两次 在"光学"选项卡中，选择"检测器等于 MCT"，选择"显微镜检测器"等于右。然后单击 setup（设置）。在屏幕上显示 FTIR 干涉图后，单击 find center burst 和 okay。

在光学选项卡中，重新选择 Detector equals ground microscope detector equals left。然后选择 setup（设置）。确保图像仍在 lancer control 中的干净区域后，再次单击 calibrate 和 okay。

要收集背景 FTIR 图像，请转到"电子元件"选项卡并选择合适的光谱分辨率，通常为 4 或 8 平方厘米。对于组织，请转到背景选项卡并在扫描件中键入 128 以进行编码。选择 New file 按钮并将背景文件放在相应的文件夹中。

单击 background 并等待扫描完成后，确认保存文件的位置。单击背景、FTIR 图像上的一个区域并检查光谱。此时，单击 setup（设置），然后在 lancer control 中，使用实时 IR 视图。

要查找感兴趣的区域，请转到 electronics 选项卡并键入要 coad 的扫描次数。然后单击扫描 要准备用于高清分析的 FTIR 显微镜，请拧入高倍率物镜代替 15 倍物镜。此时，打开图像处理和分析软件并加载 IR 数据文件。

通过选择光谱工具将基线校正算法应用于 IR 数据，然后向下滚动并单击 absorbent spectra（吸收光谱）。当弹出菜单出现时，选择 baseline correction。通过在吸收光谱菜单选项下选择归一化光谱来执行光谱归一化。

在此之后，观察图像中收集的所有 IR 频率的列表。单击与特定生物分子相对应的频率，以观察所选频率的组织图像，以创建允许可视化不同生物分子成分的图像。单击"光谱工具"，然后选择"峰高比"。

使用单独的全玻片成像系统扫描相应的相邻染色组织切片，该系统在红外图像的同时捕获明场图像。使用可见图像程序调出染色组织的数字图像。接下来，右键单击感兴趣区域的图像，然后选择 Z 轮廓以提供所选像素的光谱信息。

要在图像上标记特定像素，请右键单击图像并选择 ROI 工具。创建要标记的类，例如 Meum 和 Bowman 的 capsule 类。然后选择 ROI 类型点，然后选择要为其选择像素的类，并在 IR 图像上绘制适当的像素。

使用平均 ROI 工具推导出每个类别的平均光谱。最后，通过绘图比较衍生的光谱。在绘图软件中，FT IR 成像允许导出组织的 IR 图像，这些图像可以根据 IR 频率提供不同的对比度。

每个像素都由整个光谱组成，不同的峰值对应于不同的生物分子，可以提供有关细胞类型或疾病状态的生化特性的信息。FTIR 仪器已经从使用不透明孔径的单点映射模式进行测量发展到使用 CASA 晶粒物镜的成像模式，该物镜使用照明物镜，在透射模式下与收集物镜相结合，或者在反射模式下同时照明和收集的单个物镜。随着现在可以识别细胞类型和组织结构，组织成像空间分辨率的进步至关重要。

在这种情况下，在肝组织核心中观察到肾小球功能单位。可以可视化肝细胞和浸润性纤维化区域，该区域分为异型增生和非异型增生性肝硬化两个不同的区域。提高空间分辨率允许在组织学变化明显之前分离可能被疾病化学修饰的特定结构特征。

肾小球结构（如 Bowman 囊、meum、肾小球基底膜和肾小管基底膜）的生化变化可通过 FTIR 成像识别。在尝试此过程时，请务必记住在扫描之前完全清除载玻片 遵循此程序。其他方法（如传统的免疫化学分析）可以在同一组织切片上进行，以关联生化特征和组织形态。

我们的第一项发展，这项技术为组织成像领域的研究人员探索组织内小细胞类型和结构的生物分子状态铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何获得组织样本的高清 FTR 图像并进行基本的光谱分析有一个基本的了解。不要忘记，使用液氮可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取安全预防措施，例如冷冻安全手套和安全护目镜。