利用荧光清除实验评估斑马鱼肾功能

本实验的总体目标是在斑马鱼中建立一种定量的肾功能检测方法。首先将72小时受精龄（HPF）的斑马鱼胚胎进行麻醉，随后将胚胎转移至注射模具中，并调整方向，使其心脏位于视野左侧。

然后向心包腔注射一种罗丹明标记的荧光染料，并使用落射荧光解剖显微镜获取心脏区域的荧光图像。最终，通过落射荧光显微镜评估肾脏对荧光染料的清除情况。该技术的主要优势在于，无需进行血液或尿液检测（这在斑马鱼中无法实现），即可定量读取斑马鱼肾脏功能。

该方法为评估斑马鱼疾病模型中的肾功能提供了一种强有力的工具。根据文本方案制备针头和模具后，首先将用鱼水配制的2%aro溶液倒入90毫米的培养皿中以浇铸模具。将模具放置在培养皿上，使叠放的载玻片边缘以一定角度浸入琼脂表面下方。

静置30分钟。移除载玻片模具，使用含有三卡因麻醉剂且比例为1:25的新鲜鱼用水。覆盖印有aros的载玻片，以进行斑马鱼荧光染料注射。

使用标准的显微注射装置，该装置由空气压缩机连接至压力调节系统，并向直式移液管持器供气，适用于外径为1.0的毛细管。移液管持器应安装在MN 33紧凑型装置内。通过磁性支架将三轴控制的显微操作器固定在钢制底板上，并配合解剖显微镜使用，以观察、操作和注射胚胎，同时按照文本方案中所述的标准条件维持斑马鱼的培养。

根据实验需求选用野生型或转基因斑马鱼品系。每8升水体养殖15尾雄鱼和15尾雌鱼，以维持适当的饲养密度，确保获得最大数量的卵，同时避免对鱼类造成干扰。在收集卵的前一天晚上，将繁殖用鱼缸浸入野生型种鱼的养殖缸中。

在收集当天，让鱼类产卵持续30至40分钟。然后使用筛网和新鲜的养殖水收集卵子并冲洗。将清洗后的卵子置于含有胚胎培养基的90毫米培养皿中，并在28.5°C条件下孵育，以抑制成肌作用。

受精后8小时（hpf），将存活的胚胎用少量液体转移至含有1至100 PTU胚胎培养基的新鲜培养皿中，并在28.5°C下继续孵育。

使用尖头镊子折断针头末端。然后通过将脉冲持续时间调至分钟级以最大化输出，使RD移动至针尖。当溶液到达针尖时，切换回毫秒级设置。

将显微测微尺置于显微镜载物台上，通过调节压力调节器和优化针尖，调整排出液滴的直径至100微米，或体积至0.5纳升，然后进行注射。准备两个35毫米的培养皿，每个培养皿中加入5毫升胚胎培养基，分别标记为“trica”和“恢复”。

向标记为 trica 的培养皿中加入 200 微升 trica 储液。准备注射时，选取一个 72 小时后受精（HPF）的单个胚胎。将极少量液体转移至 trica 培养皿中，并监测胚胎的活动情况。

胚胎麻醉后，将其转移至注射模具中，并在槽内调整方向，使左侧朝上，将心脏置于视野的左侧。为将RD注入心脏，需用针头刺穿心包膜，并向心包腔内注入一纳升的RD。

拔出针头后，将注射过的胚胎连同少量液体转移至恢复皿中，观察一分钟。随后将单个胚胎转移至含有1毫升含PTU新鲜胚胎培养基的24孔板中，并做好相应标记。每个实验组至少注射10个胚胎后，于28.5°C条件下孵育三小时。

注射后3小时（HPI），按照先前所述方法麻醉胚胎，并转移至含有3%甲基纤维素的35毫米培养皿中。轻轻将胚胎推入甲基纤维素中，并调整方向，以便对侧部进行成像。

使用570纳米的UV光发射滤光片获取胚胎图像。在将胚胎放回指定孔位前，使其恢复，然后对所有显微注射的胚胎进行成像，之后继续在28.5°C下培养。在24小时后（HP）获取第二轮图像后，我使用ImageJ软件通过打开图像并指定感兴趣区域（ROI）来定量每个显微注射胚胎的荧光强度。

选择编辑选区，将其值设置为100平方像素。将心脏置于ROI的中心，然后选择分析、设置测量选项，并将测量参数设置为包含平均灰度值和面积。随后进行测量，对每套胚胎在3小时后和24小时后的图像进行荧光定量，并将平均灰度值导入电子表格以进行后续处理。

使用适当的软件进行统计分析，并采用如图所示的学生t检验（student's T-test）比较各组之间的统计学显著性。将RD注射到bbbs九条Morpho注射鱼中，导致40%的胚胎在受精后五天出现腹侧囊肿。此外，与对照组相比，Morpho鱼在感染后24小时（24 HPI）清除荧光染料的能力下降。

每次必须在15分钟内完成对一组10条鱼的注射。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用斑马鱼的光学透明特性，通过定量监测显微注射的荧光染料随时间的清除情况，以此作为评估斑马鱼肾功能的有效读出指标。