斑马鱼肾功能评价采用荧光测定间隙
February 20th, 2015
斑马鱼是一种流行的工具来模拟慢性肾脏病（CKD）。然而，它们的小尺寸使得它不可能用传统方法评估肾功能。我们描述一个荧光染料肾清除率法1，允许在CKD斑马鱼肾功能定量分析。
该程序的总体目标是在斑马鱼中生成定量肾功能测定。这是通过首先在 72 HPF 下麻醉斑马鱼胚胎来实现的。接下来，将胚胎转移到注射模具中并调整方向，使其心脏位于视野的左侧。
然后用瘤胃 dextra 荧光染料注射心包腔，并使用 epi 荧光解剖显微镜需要心脏区域的荧光图像。最终，使用 epi 荧光显微镜评估荧光染料的肾脏清除率。这种技术的主要优点是它不需要血液或尿液检查即可产生斑马鱼肾功能的定量读数，这在斑马鱼中是不可能的。
该方法为评估斑马鱼疾病模型中的肾功能提供了强大的工具。根据文本方案拔针并准备模具后，首先将鱼水中制成的 2%aro 溶液倒入 90 毫米培养皿中，铸造模具。将模具放在培养皿上，让堆叠的滑动边缘以一定角度浸没在农产品表面下。
静置 30 分钟。取下载玻片模型，使用含有 trica 麻醉剂的新鲜鱼水，比例为 1：25。为了覆盖印记的载玻片，aros 进行斑马鱼荧光染料注射。
使用标准显微注射装置，该装置由连接到压力调节器系统的空气压缩机组成，该空气压缩机送入直式移液器支架，用于 1.0 外径毛细管。移液器支架应安装在 MN 33 紧凑型移液器内。三轴控制微纵器通过磁力架用户解剖显微镜固定在钢底板上，以观察、作和注射胚胎，同时使用文本协议中概述的标准条件维护斑马鱼。
根据实验使用野生型或转基因斑马鱼品系。保持每 8 升水箱 15 只雄性对 15 只雌性的放养密度，以确保在不干扰鱼的情况下收集最大的卵。在收集前一天晚上将繁殖池浸入野生型种罐中。
在收集当天，等待 30 到 40 分钟让鱼产卵。然后使用网状过滤器和新鲜的水族箱水收集并冲洗鸡蛋。将清洗后的鸡蛋存放在含有胚胎、培养基的 90 毫米培养皿中，并在 28.5 摄氏度下孵育以抑制肌生成。
八小时。受精后或 HPF。将最小液体中的活胚胎转移到含有 1 至 100 PTU 的新鲜培养皿中，放入胚胎培养基中，并在 28.5 摄氏度下进一步孵育。
使用细尖镊子折断针头的末端。然后通过将脉冲持续时间最大化到分钟设置，将 RD 移动到针尖。当溶液到达尖端时，切换回毫秒。
将千分尺放在显微镜载物台上，用压力调节器和针尖微调剂，在注射前将排出液滴的大小调整为 100 微米直径或 0.5 纳升的体积。设置 2 个 35 毫米培养皿。每个含有 5 毫升胚胎培养基，标记一个 trica 和另一个回收。
将 200 微升高汤 trica 加入 trica 标记的培养皿中。准备好注射后，选择一个 72 HPF 的单个胚胎。将最少的液体转移到 trica 培养皿中并监测胚胎的活动。
麻醉胚胎后，将其转移到注射模具中并将其定位在槽中，使左侧朝上。将心脏定位在视野的左侧。要将 RD 注射到心脏中，请用针头刺穿心包并将 1 纳升 RD 注射到心包腔中。
拔出针头后，将注射的胚胎在最少的液体中转移到恢复皿中并监测一分钟。然后将单个胚胎转移到含有 1 毫升含有 PTU 的新鲜胚胎培养基的 24 孔板中，并进行适当标记。每个实验组注射至少 10 个胚胎后，在 28.5 摄氏度下孵育 3 小时。
如前所述，在注射后 3 小时或 HPI 麻醉胚胎。并转移到含有 3% 甲基纤维素的 35 毫米培养皿中。轻轻地将胚胎推入甲基纤维素中并定向，以便可以对侧面进行成像。
使用 570 纳米的紫外光发射滤光片，获取胚胎的图像。让胚胎恢复后再将其放入指定井中，获取所有注射胚胎的图像，然后继续在 28.5 摄氏度下孵育。在以 24 HP 获取第二轮图像后，我使用 image J 软件通过打开图像并指定感兴趣区域或 ROI 来量化每个注射胚胎的荧光强度。
通过选择 edit selection （编辑选择），指定值并将其设置为 100 平方像素。将心形置于 ROI 的中心，然后选择 analyze（分析）、set measurements（设置测量值）并将测量值设置为包括平均灰度和面积。然后进行测量，量化每组图像在每个胚胎 3 HPI 和 24 HPI 下的荧光，并将平均灰度值传输到电子表格中进行进一步处理。
使用适当的软件进行统计分析，并使用学生的 T 检验比较各组的统计显著性，如下所示。将 RD 注射到 bbbs 9 条 Morpho 注射的鱼中，导致 40% 的胚胎在受精后 5 天出现易发的 fric 囊肿。此外，与对照组相比，吗啡鱼在 24 HPI 后清除荧光染料的能力降低。
一次必须注射一组 10 条鱼，可以在 15 分钟内注射。观看此视频后，您应该对如何利用斑马鱼的光学透明度来定量监测微量注射荧光染料的时间清除率作为斑马鱼肾功能的有效读数有一个很好的了解。
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概述
斑马鱼是研究慢性肾脏病（CKD）的有价值模型。本文介绍了一种新型的荧光染料肾脏清除测定法，能够定量评估斑马鱼的肾功能，克服了传统方法的局限性。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 肾功能评估
背景
- 斑马鱼常用于生物医学研究。
- 传统的肾功能测试不适用于斑马鱼。
- 荧光染料测定提供了一种无创替代方法。
- 了解肾功能对于CKD研究至关重要。
研究目的
- 开发一种用于斑马鱼肾功能的定量测定法。
- 利用荧光成像测定肾脏清除。
- 促进使用斑马鱼模型进行CKD研究。
使用的方法
- 在受精后72小时（HPF）对斑马鱼胚胎进行麻醉。
- 将rumine dextra荧光染料注射到心包腔。
- 使用表观荧光显微镜捕捉心脏区域的图像。
- 定量评估荧光染料的肾脏清除。
主要结果
- 该测定法提供了肾功能的可靠定量测量。
- 荧光成像允许进行无创评估。
- 该方法适用于研究斑马鱼的CKD。
- 结果表明该方法对未来研究的可行性。
结论
- 荧光染料肾脏清除测定法对斑马鱼有效。
- 该方法克服了传统肾功能测试的局限性。
- 它为使用斑马鱼模型进行CKD研究开辟了新途径。
常见问题
Executive Industry Relevance
Assessing renal function in vertebrate disease models remains a bottleneck in preclinical CKD research due to technical limitations in sampling. The zebrafish kidney clearance assay addresses this gap by leveraging optical transparency to deliver quantitative, non-invasive functional readouts. This enables mechanistic de-risking of ciliopathy and fibrosis targets early in discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses in genetic models of cystic and ciliopathic kidney disease.
- Operational Value: Enables functional target validation without reliance on blood or urine biomarkers.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying dye clearance as a functional readout of tubular and glomerular integrity.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized fluorescence intensity measurements over time for compound screening.
- Scalability: Compatible with 24-well plate formats and automated imaging for medium-throughput evaluation.
- Reproducibility: Uses defined ROI analysis and emission filters to ensure consistent signal quantification across groups.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models human CKD pathways through conserved pronephric structure and cilia-dependent fluid transport.
- Translational Continuity: Bridges zebrafish phenotypes to mammalian renal function via conserved solute handling mechanisms.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on statistically significant changes in clearance rates post-intervention.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation to lead optimization by providing functional confirmation of pathway modulation in whole-organism contexts.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking of targets involved in nephron development and tubular function.
- Screening: Delivers quantitative, time-resolved outputs suitable for hit confirmation and dose-response profiling.
- Analytics: Enables group comparison via mean gray scale intensity and statistical testing (e.g., Student’s T-test).
- Translational Research: Aligns with preclinical continuity by measuring functional outcomes analogous to human clearance assays.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative testing across genetic and pharmacological models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in kidney disease models through direct functional measurement.
- Operational Value: Standardizes assay execution via timed imaging and defined injection volumes (0.5 nL).
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early failure of non-translatable targets.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization using quantitative clearance deficits as go/no-go criteria.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish microinjection and fluorescence microscopy.
- Dependent on epi fluorescence systems with 570 nm emission filters and ROI analysis tools.
- Necessitates standardization across labs for embryo staging (72 HPF) and incubation conditions (28.5°C).
- Involves adaptation considerations when translating to mutant or morphant models with developmental phenotypes.
- Limited by embryo size and dye retention constraints, which may affect signal-to-noise in severely impaired models.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:09
Preparation of Instruments and Anesthetic
2:21
Zebrafish Husbandry and Pre-injection Treatment
3:33
Microinjection
5:27
Imaging Acquisition and Processing
7:08
Results: Injection of Rhodamine Dextran in bbs9 Morpholino Knockdown Zebrafish
7:37
Conclusion
