肾单位的组成与功能的成年斑马鱼肾脏分析
August 9th, 2014
斑马鱼成人肾脏是一个很好的系统，肾功能恢复及疾病的研究。这种研究的一个重要方面是肾结构和功能的评估。这个协议描述了可被实现来评估肾小管组成，并评估肾重吸收的数种方法。
以下实验的总体目标是评估成年斑马鱼肾脏中的肾单位节段组成和功能。这是通过首先将荧光标记的糊精注射到绑住斑马鱼的巢穴中来实现的。第二步是取出并固定肾脏，为后续标记方法准备组织。
接下来，对肾脏进行漂白以去除色素沉着，然后染色以荧光标记所需的肾单位段。使用免疫荧光、显微镜和/或明场成像获得结果，从而能够根据选定的染色或染色实现肾脏解剖结构的可视化。以下标记方法可以帮助回答肾脏领域中有关器官解剖学的关键问题，并可用于研究肾单位组成和评估损伤事件前后的肾功能。
这些技术的影响延伸到成人肾脏形成中遗传异常的研究，也可用于在慢性疾病建模期间评估肾脏状态。首先，从麻醉的鱼中倒出溶液，然后小心地将动物放在湿海绵模具的腹侧。接下来，在胰岛素注射器中加入 20 微升解冻的糊精原液。
放置针头，使插入在腹部腹侧中线处以浅角进行。为避免轻微注射器官，请在注射后立即抬起针头以抬起体壁并创造一个空间来注射溶液。注射后，轻轻地将鱼放回水箱以从麻醉中恢复。
首先，从麻醉的鱼中倒出任何多余的溶液，然后将其放在纸巾或纸巾上。切除头部和内脏后，用超细解剖针钉开体壁。找到粘附在动物背壁上的肾器官。
使用细镊子将肾脏从背壁上分离。轻轻地将肾脏放入含有 1 个 XPBS 的 5 毫升玻璃瓶中，洗涤 3 次，每次 5 分钟。用移液管取出肾脏，并将其放在干净的玻璃载玻片上，滴一到两滴一个 XPBS。
使用细镊子将载玻片上的肾脏压平，确保没有组织卷曲或以其他方式翻转。钨丝工具可用于在结缔组织中做小切口，以促进肾脏的平坦定位。接下来，将小块造型粘土放在 18 x 18 毫米玻璃盖玻片的每个角落上。
慢慢地将盖玻片放在肾脏上，保持一个小角度。为了最大限度地减少气泡滞留，如有必要，请额外添加一滴 XPBS 以填充盖玻片和载玻片之间的空间。将另一组斑马鱼安乐死并在固定剂中浸泡过夜。
准备好后，使用细镊子小心地将肾脏从体背壁上分离，然后将器官放入玻璃瓶中。用 3 到 5 毫升含 0.05% 补间的 1 XPBS 清洗解剖的肾脏 3 次，每次 5 分钟。接下来，去除 PBS 溶液，用 3 毫升 5% 蔗糖溶液冲洗肾脏 30 分钟。
在此之后，用 3 毫升 30% 蔗糖替换溶液，并在第二天在 4 摄氏度下储存过夜。取出溶液并洗涤肾脏两次，然后加入 3 至 5 毫升漂白溶液。要去除肾脏器官上的黑色素细胞色素沉着，请将玻璃瓶放在旋转器上，仔细观察色素沉着消失。
脱色通常需要大约 20 分钟，但有时可能需要长达 60 分钟。如果漂白溶液放置时间过长，可能会发生崩解，因此建议每 10 到 15 分钟监测一次样品，以检查色素沉着从肾脏洗涤液中去除两次后的完整性，并在室温下与 4% PFA 溶液孵育 1 小时。接下来，去除 4% PFA 溶液，最后一次洗涤后用 3 至 5 毫升封闭溶液洗涤肾脏 3 次，并在室温下孵育肾脏 2 小时。
封闭完成后，直接进行选定的染色方案。取出封闭溶液并清洗肾脏 3 次，然后让肾脏浸泡在一个 XPBS 中至少 10 分钟。在此期间，将肾脏转移到 12 孔或 24 孔培养皿中。
用足够的工作碱性磷酸酶底物溶液替换一个 XPBS，以覆盖样品，并将样品在室温下放在旋转器上 30 分钟。在此之后，通过在碱性磷酸酶洗涤缓冲液中洗涤肾脏来终止反应。在 10 到 15 分钟内用 3 次洗涤缓冲液冲洗肾脏。
接下来，去除洗涤缓冲液并将肾脏安装在干净的玻璃杯上。滑入标记试剂盒中包含的磷酸酶封固剂。使用带有 Debbie 滤光片组的立体显微镜或复合显微镜观察碱性磷酸酶染色的肾脏。
首先，通过在一台 XPBS 中稀释 DBA 来制备 200 μL 的工作 DBA 溶液。用 200 微升 DBA 溶液替换 PBS 溶液，并将样品在室温下放在旋转器上 1 小时。在此之后，取出 DBA 溶液，用 3 至 5 毫升 1 XPBS 洗涤肾脏 3 次，每次 5 分钟。
取出一个 XPBS 并将肾脏安装在干净的载玻片上。如前所述，使用荧光立体显微镜或复合显微镜上的标准 Trixie 或 Texas 红色滤光片组可视化肾脏的 DBA 染色远端段。在这张未漂白肾脏的明场图像中，黑色色素沉着对应于分散的黑色素细胞群。
在这里，在糊精注射后三天观察肾单位 PCT 片段。插图包含带有黑色素细胞的单个肾单位的图像。这张图片显示了去除黑色素细胞色素沉着后的成人肾脏。
这些代表性图像描述了 PCT 片段之间的轻微形态变化，而许多肾单位 PCT 紧密盘绕。其他肾单位包含具有最小卷曲糊精级联蓝糊精的 PCT 区域，荧光荧光黄和荧光糊精红宝石都优先标记肾单位中的 PCT 片段，糊精级联蓝和荧光黄都显示出一些非特异性标记，在荧光素黄处理的肾脏中观察到更高的背景。相比之下，糊精氟 Ruby 在强烈的 PCT 标记下显示出显著降低的背景。
通过希望检测 PCT 转运蛋白细胞类型的特异性标志物对成人肾脏进行染色，显示出糊精摄取的表达模式特征，分布着各种紧密卷曲的环状 PCT 结构域，以及更细长的 PCT 延伸，显示出一致的宽直径。看完这个视频，你应该对如何成功标记成年斑马鱼肾脏内的肾单位段有一个很好的了解，比如用碱性磷酸酶标记近端肾小管和用 DBA 的药物远端肾小管。不要忘记，使用 4% 的异构醛可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如穿外套、手套和眼镜。
概述
本文介绍了一种评估成年斑马鱼肾脏肾元组成和功能的协议，这是一个对肾脏研究非常有价值的模型。所描述的方法有助于评估肾元结构和肾脏重吸收，为肾脏再生和疾病研究做出贡献。
关键研究组成部分
科学领域
- 肾脏学
- 再生医学
- 比较生物学
背景
- 斑马鱼是研究肾脏功能和再生的模型生物。
- 了解肾元结构对肾脏疾病研究至关重要。
- 荧光标记技术增强了肾脏解剖结构的可视化。
- 研究结果涉及遗传异常和慢性疾病建模。
研究目的
- 评估斑马鱼肾脏中的肾元组成。
- 评估损伤前后的肾脏功能。
- 开发适用于肾脏研究的方法。
使用的方法
- 向斑马鱼注射荧光标记的糊精。
- 进行肾脏解剖和固定以备制备组织。
- 肾元分段脱色和染色。
- 使用免疫荧光和显微镜技术进行可视化。
主要结果
- 成功染色后可视化肾元分段。
- 技术允许对肾脏进行详细的解剖评估。
- 结果有助于理解肾脏解剖结构和功能。
- 方法可以适用于各种肾脏研究应用。
结论
- 斑马鱼肾脏模型对肾元研究有效。
- 荧光标记技术提供了对肾脏功能的洞察。
- 研究结果对肾脏疾病和再生具有重要意义。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding nephron regeneration mechanisms in zebrafish provides predictive value for identifying compounds that modulate renal repair pathways. This model supports target validation by enabling functional assessment of nephron segment integrity before and after injury. The protocol facilitates mechanistic de-risking in early discovery by linking genetic or pharmacological perturbations to measurable renal phenotypes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to renal regeneration pathways through segment-specific labeling.
- Operational Value: Provides reproducible readouts of nephron epithelial integrity and tubular function in adult zebrafish.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing compounds that promote true regeneration versus transient repair.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts for proximal and distal tubule segments to assess compound effects.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation and staining workflows for high-content imaging platforms.
- Scalability: Compatible with multi-well plate formats for dose-response screening in renal injury models.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage nephron labeling to preclinical evaluation of renal recovery in injury paradigms.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of structural nephron changes with functional dextrin clearance as a translational readout.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by quantifying nephron segment-specific damage and regeneration kinetics.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead optimization by providing functional renal phenotyping capabilities.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of renal regeneration mechanisms via visualization of nephron segment composition.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized kidney preparations with segment-specific fluorescent outputs for compound screening.
- Analytics: Enables quantitative comparison of dextrin uptake and segment intensity across conditions to assess renal functionality.
- Translational Research: Connects structural nephron assessment to functional recovery metrics in chronic disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for longitudinal renal phenotyping across genetic and pharmacological injury models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in renal target validation through direct visualization of nephron segment integrity.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized fixation, bleaching, and multi-step staining protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of nephrotoxic liabilities in lead candidates.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by quantifying regenerative capacity in preclinical renal models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, microsurgery, and fluorescence microscopy.
- Dependent on dextrin labeling reagents, bleaching solutions, and immunofluorescence infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for consistent kidney dissection and mounting procedures.
- Adaptation considerations include species-specific pigmentation and nephron architecture in non-zebrafish models.
- Practical limitations include tissue fragility during dissection and potential dextrin efflux affecting longitudinal studies.
