配备了光学切片与成像定时使用解剖显微镜斑马鱼肾脏发展分析
April 7th, 2016
这里介绍的方法允许在斑马鱼胚胎器官发育的时间推移分析，通过使用荧光解剖能够执行光学切片和调整的简单的策略来纠正焦点和平面漂移的显微镜。
该程序的总体目标是使用荧光解剖显微镜对不同的发育过程进行延时分析，并在向任何方向漂移后采用简单的重新对准策略。这种方法可以帮助回答发育生物学领域的关键问题，因为它可以在几个小时内直接观察活胚胎的组织和器官发育。这种方法的主要优点是，它经济实惠且易于使用，替代通常用于延时记录发育中的组织和器官的更复杂的技术，例如激光扫描或照明显微镜。
虽然这种方法可以深入了解清道鱼胚胎和幼虫发育过程中发生的空间和时间变化，但它也可以应用于研究早期发育过程和其他模式生物。此外，它适用于观察成虫生物体的动态过程，例如根系愈合和再生。在制备过程中，从转基因 GFP 表达系中鉴定高繁殖力的成年鱼。
在植物显微注射前的下午，在 5 个繁殖容器中设置 5 对雄性和雌性繁殖鱼。在容器中，用可拆卸的筛子将雄性和雌性隔开过夜。第二天早上，刚开灯，将雄性和雌性放在筛子上方，这样可以防止它们吃掉鸡蛋。
现在，观察鱼产卵时的情况。一旦这对蛋产生大约 50 个鸡蛋，就将它们分开。然后，使用巴斯德移液管将鸡蛋转移到装满胚胎水的培养皿中进行第一轮注射。
对每个配对对重复此过程。如果需要额外的蛋，可以将相同的交配对放在一起并分开几次。对于显微注射，培养皿和注射针的高级准备以相当标准的方式完成。
详细信息可以在 text protocol 中找到。首先加载准备好的注射针头。使用微型装载器尖端，用两微升 MO 工作溶液回填针头，然后将针头连接到微型作器中。
然后，可以打开针尖。用解剖显微镜观察时，用镊子捏开末端，或将尖端推向刚性表面。然后，通过将 MO 溶液注入刻度上的一滴矿物油中来校准进样体积。
调整进样量，制成 75 微米的液滴，相当于约 200 皮升的溶液。接下来，准备要注射的胚胎。沿着显微注射皿的凹槽排列大约 21 个细胞期胚胎，植物极朝向显微注射针的入口，与凹槽成 45 度角。
现在，注射胚胎。用针头在绒毛膜和蛋黄上穿孔，然后将加载的吗啉溶液注入蛋黄中。这适用于一细胞或双细胞阶段的胚胎。
注射所有胚胎后，使用大口径巴斯德收集它们。将注射的胚胎转移到装满胚胎水的培养皿中，并在 28.5 摄氏度下孵育。下午晚些时候，吸出死胚胎并更换胚胎水。
第二天早上，在胚胎经过原肠胚形成后，用含有微量 PTU 的胚胎水代替水来抑制它们的黑色素化。小心，PTU 会在原肠胚形成前破坏正常的发育。后来，在所需的发育阶段，用锋利的镊子将胚胎去绒毛膜。
使用显微镜，用一对镊子抓住绒毛膜，然后尝试用第二对镊子抓住绒毛膜的另一侧。然后，小心地将镊子拉开，不要破坏胚胎。然后，用 Tri卡因麻醉胚胎，并继续将胚胎和琼脂糖包埋在放置在盖玻片底部微培养皿中的 15 微米重新定位网格上。
然后，将 1 mL等分试样的熔化琼脂糖上样到 1.5 mL反应管中。将管子放入设置为 36 摄氏度的加热块中，等待它们冷却。然后，使用大口径移液器将胚胎转移到微培养皿中。
吸掉多余的胚胎水，并在胚胎上覆盖琼脂糖。当琼脂糖仍为液体时，使用两个小移液器吸头定位胚胎。将感兴趣的结构（在本例中为 pronephros）放置在尽可能靠近玻璃底部的位置，并靠近网格。
网格不应覆盖感兴趣的结构。将最多四个胚胎嵌入不同的微型培养皿中是有利的，并计划对最好的胚胎进行成像。正确的嵌入需要一些练习。
当琼脂糖仍然是液体时，胚胎必须定向到所需的位置。如果它是靠近玻璃底部的 pronephros，并且与重新定位网格保持适当的距离。定期检查琼脂糖。
一旦它足够坚硬，可以容纳胚胎，再静置两到三分钟。然后，用含有微量 PTU 和三卡因的胚胎水覆盖包埋的胚胎。倒出或虹吸掉多余的胚胎水，并锁上盖子以防止蒸发。
结果不应有任何气泡。现在可以在玻璃底部面向物镜的情况下对胚胎进行成像。使用准备工作制作延迟图像，例如，通过在几个小时内定期拍摄 Z 堆栈图像，有必要校正焦点漂移。
如果可能，请应用自动对焦策略。切换软件控件中的自动对焦选项。对于参考通道，选择透射光明场通道以最大限度地减少光毒性。
选择足够大的标本相关搜索范围也很重要，以便自动对焦正常工作。在收集图像之前，将印记网格的特定点放置在软件十字准线中靠近感兴趣结构的位置，然后使用屏幕截图保存此位置。然后，在每个成像时间间隔结束之前，参考屏幕截图并重新调整载物台的位置和焦点（如果未使用自动对焦）。
所提出的方法用于分析转基因斑马鱼系 WT1A胚胎的肾脏发育。在肾源性早期，该系在肾祖细胞出现的中间中胚层中选择绿色荧光，后来在形成的小管和肾单位原基的发育过程中选择绿色荧光。延时成像显示对照 Morpholino 注射胚胎的肾发生正常。
受精后 20 小时，可以看到发育中的肾前肾小管。在它们的前端，可以检测到代表形成肾单位原基的细胞的球形积累。在接下来的几个小时里，小管和肾单位原基生长，原基开始在中线融合。
相比之下，突变体的肾生成受到严重破坏。尽管受精后 20 小时可以看到 GFP 阳性肾小管结构，但它们是弥散的和发育不全的。延时成像显示原肾单位从未形成，位于发育中的肾单位外的大量荧光细胞向腹侧迁移，离开了肾前视野。
在尝试此方案时，重要的是要记住，如果没有额外的设备，例如温度控制或防蒸发表，则需要定期检查漂移和重新调整。按照此程序，可以处理图像胚胎以执行其他方法，例如免疫组织化学、体内增大或实时 PCR，以识别细胞、组织的特定成分或评估基因表达。
概述
这种方法使用荧光解剖显微镜实现斑马鱼胚胎器官发育的延时分析。它允许对组织和器官发育进行数小时的直接观察，为发育生物学提供了见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 发育生物学
- 斑马鱼胚胎学
- 显微镜技术
背景
- 延时成像对于研究发育过程至关重要。
- 传统方法可能复杂且昂贵。
- 这种方法提供了一种更简单和更经济的替代方案。
- 它可以应用于各种模式生物。
研究目的
- 促进对活体胚胎器官发育的观察。
- 提供一种易于使用且成本效益高的方法。
- 使研究人员能够研究动态发育过程。
所用方法
- 成年斑马鱼的繁殖准备。
- 将Morpholino溶液微量注射到胚胎中。
- 将胚胎嵌入琼脂糖中以便成像。
- 使用荧光解剖显微镜进行延时成像。
主要结果
- 成功观察到斑马鱼胚胎器官发育。
- 证明了该方法在延时成像中的有效性。
- 提供了关于发育过程中空间和时间变化的见解。
- 显示了该方法对其他发育过程和生物的适用性。
结论
- 这种方法是发育生物学研究的有价值工具。
- 它简化了长时间观察活体胚胎的过程。
- 它为研究各种发育现象开辟了新的途径。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method provides an accessible approach for time-lapse imaging of organogenesis in zebrafish embryos, enabling direct observation of developmental processes without requiring complex or expensive microscopy infrastructure. By supporting longitudinal imaging of tissue dynamics in a vertebrate model, it facilitates early-stage target validation and mechanistic de-risking in discovery pipelines. The technique offers a cost-effective alternative for generating quantitative, reproducible data on morphogenetic events relevant to disease modeling and phenotypic screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in kidney development by visualizing spatial and temporal alterations in nephrogenesis upon wt1a knockdown.
- Operational Value: Supports hypothesis testing through direct visualization of pronephric tubule formation and nephron primordia fusion in live embryos.
- Predictive Value: Facilitates assessment of phenotypic severity in morphant models, aiding in target confidence evaluation for renal disease pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative z-stack and time-lapse readouts of fluorescently labeled kidney structures for comparative analysis between control and perturbed conditions.
- Operational Value: Utilizes a fluorescence dissecting microscope with autofocus and relocation grids to minimize drift, enhancing reproducibility across imaging sessions.
- Assay Readiness: Produces standardized imaging outputs that can be used to establish baseline phenotypes for compound screening or genetic modifier studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables observation of conserved developmental processes in zebrafish, a disease-relevant system for modeling human kidney disorders.
- Mechanistic De-risking: Allows tracking of cellular migration and tubule morphogenesis defects, providing insight into off-target or pathway-specific effects of genetic perturbations.
- Preclinical Alignment: Supports progression from discovery to preclinical validation by establishing dose- or time-dependent phenotypic readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, particularly for renal pathways where dynamic tissue imaging informs mechanism of action and phenotypic outcome.
- Discovery Biology: Supports functional validation of targets like wt1a by enabling real-time observation of downstream developmental consequences in a living system.
- Screening: Generates reproducible fluorescence-based readouts suitable for assessing compound effects on kidney morphogenesis in a vertebrate context.
- Analytics: Provides quantitative measurements of tubule length, primordia formation, and cellular localization over time, enabling objective comparison across experimental groups.
- Translational Research: Connects early developmental phenotypes to later-stage organ dysfunction, supporting biomarker-aligned assessment of renal toxicity or repair.
- Enterprise Reuse: Represents a scalable imaging capability that can be applied across multiple developmental models and organ systems with minimal reconfiguration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation by linking genetic perturbation to observable developmental defects in a physiological context.
- Operational Value: Enhances reproducibility through hardware-based drift correction (autofocus, relocation grids) and standardized embryo preparation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency by providing early, visual confirmation of pathway modulation in a whole-organism assay.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on severity and specificity of developmental phenotypes observed in vivo.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry, microinjection, and embryo staging for successful application.
- Dependent on fluorescence dissecting microscope with z-stack capability and software supporting autofocus and stage repositioning.
- Necessitates standardization of agarose embedding and embryo orientation to ensure consistent imaging quality across users and sessions.
- Adaptation to other organs or models may require changes in transgenic reporters, injection timing, or developmental staging.
- Practical limitations include lower throughput compared to automated systems and manual effort required for drift monitoring when autofocus is not used.
