配备了光学切片与成像定时使用解剖显微镜斑马鱼肾脏发展分析

该程序的总体目标是使用荧光解剖显微镜对不同的发育过程进行延时分析，并在向任何方向漂移后采用简单的重新对准策略。这种方法可以帮助回答发育生物学领域的关键问题，因为它可以在几个小时内直接观察活胚胎的组织和器官发育。这种方法的主要优点是，它经济实惠且易于使用，替代通常用于延时记录发育中的组织和器官的更复杂的技术，例如激光扫描或照明显微镜。

虽然这种方法可以深入了解清道鱼胚胎和幼虫发育过程中发生的空间和时间变化，但它也可以应用于研究早期发育过程和其他模式生物。此外，它适用于观察成虫生物体的动态过程，例如根系愈合和再生。在制备过程中，从转基因 GFP 表达系中鉴定高繁殖力的成年鱼。

在植物显微注射前的下午，在 5 个繁殖容器中设置 5 对雄性和雌性繁殖鱼。在容器中，用可拆卸的筛子将雄性和雌性隔开过夜。第二天早上，刚开灯，将雄性和雌性放在筛子上方，这样可以防止它们吃掉鸡蛋。

现在，观察鱼产卵时的情况。一旦这对蛋产生大约 50 个鸡蛋，就将它们分开。然后，使用巴斯德移液管将鸡蛋转移到装满胚胎水的培养皿中进行第一轮注射。

对每个配对对重复此过程。如果需要额外的蛋，可以将相同的交配对放在一起并分开几次。对于显微注射，培养皿和注射针的高级准备以相当标准的方式完成。

详细信息可以在 text protocol 中找到。首先加载准备好的注射针头。使用微型装载器尖端，用两微升 MO 工作溶液回填针头，然后将针头连接到微型作器中。

然后，可以打开针尖。用解剖显微镜观察时，用镊子捏开末端，或将尖端推向刚性表面。然后，通过将 MO 溶液注入刻度上的一滴矿物油中来校准进样体积。

调整进样量，制成 75 微米的液滴，相当于约 200 皮升的溶液。接下来，准备要注射的胚胎。沿着显微注射皿的凹槽排列大约 21 个细胞期胚胎，植物极朝向显微注射针的入口，与凹槽成 45 度角。

现在，注射胚胎。用针头在绒毛膜和蛋黄上穿孔，然后将加载的吗啉溶液注入蛋黄中。这适用于一细胞或双细胞阶段的胚胎。

注射所有胚胎后，使用大口径巴斯德收集它们。将注射的胚胎转移到装满胚胎水的培养皿中，并在 28.5 摄氏度下孵育。下午晚些时候，吸出死胚胎并更换胚胎水。

第二天早上，在胚胎经过原肠胚形成后，用含有微量 PTU 的胚胎水代替水来抑制它们的黑色素化。小心，PTU 会在原肠胚形成前破坏正常的发育。后来，在所需的发育阶段，用锋利的镊子将胚胎去绒毛膜。

使用显微镜，用一对镊子抓住绒毛膜，然后尝试用第二对镊子抓住绒毛膜的另一侧。然后，小心地将镊子拉开，不要破坏胚胎。然后，用 Tri卡因麻醉胚胎，并继续将胚胎和琼脂糖包埋在放置在盖玻片底部微培养皿中的 15 微米重新定位网格上。

然后，将 1 mL等分试样的熔化琼脂糖上样到 1.5 mL反应管中。将管子放入设置为 36 摄氏度的加热块中，等待它们冷却。然后，使用大口径移液器将胚胎转移到微培养皿中。

吸掉多余的胚胎水，并在胚胎上覆盖琼脂糖。当琼脂糖仍为液体时，使用两个小移液器吸头定位胚胎。将感兴趣的结构（在本例中为 pronephros）放置在尽可能靠近玻璃底部的位置，并靠近网格。

网格不应覆盖感兴趣的结构。将最多四个胚胎嵌入不同的微型培养皿中是有利的，并计划对最好的胚胎进行成像。正确的嵌入需要一些练习。

当琼脂糖仍然是液体时，胚胎必须定向到所需的位置。如果它是靠近玻璃底部的 pronephros，并且与重新定位网格保持适当的距离。定期检查琼脂糖。

一旦它足够坚硬，可以容纳胚胎，再静置两到三分钟。然后，用含有微量 PTU 和三卡因的胚胎水覆盖包埋的胚胎。倒出或虹吸掉多余的胚胎水，并锁上盖子以防止蒸发。

结果不应有任何气泡。现在可以在玻璃底部面向物镜的情况下对胚胎进行成像。使用准备工作制作延迟图像，例如，通过在几个小时内定期拍摄 Z 堆栈图像，有必要校正焦点漂移。

如果可能，请应用自动对焦策略。切换软件控件中的自动对焦选项。对于参考通道，选择透射光明场通道以最大限度地减少光毒性。

选择足够大的标本相关搜索范围也很重要，以便自动对焦正常工作。在收集图像之前，将印记网格的特定点放置在软件十字准线中靠近感兴趣结构的位置，然后使用屏幕截图保存此位置。然后，在每个成像时间间隔结束之前，参考屏幕截图并重新调整载物台的位置和焦点（如果未使用自动对焦）。

所提出的方法用于分析转基因斑马鱼系 WT1A胚胎的肾脏发育。在肾源性早期，该系在肾祖细胞出现的中间中胚层中选择绿色荧光，后来在形成的小管和肾单位原基的发育过程中选择绿色荧光。延时成像显示对照 Morpholino 注射胚胎的肾发生正常。

受精后 20 小时，可以看到发育中的肾前肾小管。在它们的前端，可以检测到代表形成肾单位原基的细胞的球形积累。在接下来的几个小时里，小管和肾单位原基生长，原基开始在中线融合。

相比之下，突变体的肾生成受到严重破坏。尽管受精后 20 小时可以看到 GFP 阳性肾小管结构，但它们是弥散的和发育不全的。延时成像显示原肾单位从未形成，位于发育中的肾单位外的大量荧光细胞向腹侧迁移，离开了肾前视野。

在尝试此方案时，重要的是要记住，如果没有额外的设备，例如温度控制或防蒸发表，则需要定期检查漂移和重新调整。按照此程序，可以处理图像胚胎以执行其他方法，例如免疫组织化学、体内增大或实时 PCR，以识别细胞、组织的特定成分或评估基因表达。