手册小分子屏幕接近高通量使用斑马鱼胚胎

以下实验的总体目标是使用手动样品处理对斑马鱼胚胎进行化学筛选。这是通过首先将成年斑马鱼放入带有隔板的交配室过夜，然后在第二天早上取下隔板以收集胚胎来实现的。接下来，将斑马鱼胚胎组排列到 96 孔板中，然后在所需的发育阶段用药物处理。

然后让胚胎发育，用 4% Paraldehyde 固定并测定以测量小分子对感兴趣的发育过程的影响。结果显示了发育变化，例如基因表达域的获得或丢失，这可以表明由被询问的小分子引起的硫酸盐或组织形态发生的改变。由于能够识别潜在的治疗性化合物，该技术的意义延伸到各种疾病的临床治疗。

通常，刚接触这项技术的人可能会遇到困难，因为他们需要获得处理胚胎所需的灵巧性，例如在多孔板之间转移胚胎而不会损坏它们。演示该程序的将是我和实验室的本科研究员 Eric Donahue 设置斑马鱼交配。使用带隔板的交配室，将成年雄性斑马鱼放在隔板的一侧，将成年雌性斑马鱼放在另一侧。

对于每个待测小分子的 96 孔板。设置 25 个配对水箱并放置过夜。第二天，取下分隔每对鱼的腔室，一小时后，使用细网过滤器收集胚胎，然后用移液管将它们放入含有 E 3 培养基的培养皿中。

从板和立体镜下清除碎屑。观察每一窝胚胎并取出任何未受精的卵子。倒出 E 3 培养基，并替换为新鲜的 E 3。

然后将每皿胚胎放入 28.5 摄氏度的培养箱中两个小时。再次检查盘子，丢弃任何其他未受精的鸡蛋。继续将胚胎孵化到 40%eely 阶段。

将化学库板从零下 80 摄氏度中取出。用铝箔覆盖它，并用八通道移液器在室温下解冻。将 99 微升 E 3 添加到 96 孔板的第 2 至 12 列中。

然后在此处将 1 微升适当的化合物添加到第 2 至 11 列的孔中，指定为实验样品 将 1 微升 DMSO 移液到对照柱中，此处设计为第 12 列。使用铝箔覆盖稀释板，并将储备化学库放回冰箱。接下来，在选择含有 40% 外延期胚胎的培养皿后，使用移液管小心地将每孔约 10 个胚胎放入 96 的第 2 至 12 列中。

孔板。使用玻璃移液管从每个孔中取出多余的 E 3 并排入液体废物容器中。为了对胚胎进行化学处理，将 100 微升每种化学稀释液从 96 孔板转移到胚胎的相应孔中，以用纸巾创建一个潮湿室，并将其放入光敏容器中。

足够大，可容纳 96 孔板。然后使用天花板垫密封板。将其放入光敏容器中，并在 28.5 摄氏度下孵育所需的时间长度。

要去除化学物质，请向每行经过药物处理的孔中加入 300 微升 E 3。然后在使用 E 3 洗涤胚胎之前吸出培养基 3 次以固定胚胎，将它们转移到四个标记的 24 孔板中，将移液器放在深色背景前。每次移孔后，为了识别残留在移液管中的胚胎并防止交叉，去除任何死胚胎。

拉出 E 3，使胚胎几乎不会浸没在液体中。然后用玻璃移液管向每滴中加入两滴 50 毫克/毫升链霉蛋白酶。将胚胎孵育 5 分钟，然后搅动孔，使可丽耐破裂。

使用 E 3 洗涤胚胎两次后，取出并丢弃剩余的 E 3。向每个孔中加入 4% P-F-A-P-B-S，并在 4 摄氏度下孵育胚胎过夜。然后执行感兴趣的筛选，例如孔安装原位杂交，或按照文本方案中概述的愿望，从化学筛选中对胚胎进行评分。

立体显微镜观察它们之前，将它们转移到标记的 12 孔板中，如下图所示。一个人在 9 周的专注工作过程中对大约 600 种化合物进行化学遗传学筛选是可行的，如果由三个人进行，这个时间可以减少到三周。因此，一个人或几个人的工作台时间可以绕过对自动化系统等高资源要求设备的需求。

如图所示，斑马鱼胚胎经受来自 50% 人至 24 HPF 的生物活性文库中的单个化合物，然后根据需要进行检测，使用三个核糖探针的混合物检测肾单位段。例如，分级系统，导致近端曲小管或 PCT 急剧增大的化合物将被归类为 1 类，它代表与最严重缺陷相关的类别和对观察到的表型的最高置信度。然后，该化合物将被注释为第一类 PCT。

此外，此分类提供了一种简单快速的方法来描述感兴趣的小分子，包括其对生物体影响的严重程度、受药物影响的区域以及该区域受到影响的方式。在尝试此程序时，重要的是要记住在正确的发育时间点分期您的胚胎。看完这个视频，你应该对如何对斑马鱼胚胎进行手动化学筛选有了很好的了解。