一种接近高通量的斑马鱼胚胎小分子手动筛选方法

以下实验的总体目标是通过手动样品处理，在斑马鱼胚胎中进行化学筛选。首先将成年斑马鱼放入带有隔板的交配室中过夜，然后在第二天早晨移除隔板以收集胚胎。随后将斑马鱼胚胎分组排列到96孔板中，并在所需发育阶段给予药物处理。

随后，将胚胎在4%多聚甲醛中固定并继续发育，通过检测来评估小分子对特定发育过程的影响。结果显示了发育过程中的变化，例如基因表达区域的获得或缺失，这些变化可提示小分子干预所导致的硫酸化水平或组织形态发生的改变。由于该技术能够鉴定潜在的治疗性化合物，其应用前景可延伸至多种疾病的临床治疗领域。

通常，刚接触该技术的研究人员可能会遇到困难，因为他们需要掌握操作胚胎所需的灵巧性，例如在不损伤胚胎的前提下将其转移至多孔板之间。示范该操作的人员将是我本人以及实验室的本科研究人员 Eric Donahue。设置斑马鱼交配时，使用带有隔板的交配盒，将成年雄性斑马鱼放在隔板的一侧，成年雌性斑马鱼放在另一侧。

对于每一块待测试的小分子96孔板，设置25个交配缸并过夜。第二天，移除分隔每对鱼类的隔间，一小时后，使用细网筛收集胚胎，再用移液管将其转移至含有E3培养基的培养皿中。

在体视显微镜下清除培养皿中的碎片，观察每批胚胎并移除未受精的卵。倾去 E three 培养基，更换为新鲜的 E three 培养基。

然后将每皿胚胎置于28.5°C培养箱中孵育两小时。再次检查培养皿，弃去任何额外的未受精卵。继续孵育胚胎至40%体节期。

从零下80摄氏度取出化合物文库板，用铝箔覆盖，并在室温下使用八通道移液器使其解冻。向96孔板的第2至第12列各加入99微升E3。

然后，向第2至第11列的孔中各加入一微升相应的化合物，这些孔被指定为实验样品。用移液器向对照孔（指定为第12列）中加入一微升DMSO。用铝箔覆盖稀释板，并将储备化学文库放回冰箱。接下来，选择一个含有处于40%原肠胚阶段胚胎的培养皿，使用转移移液器小心地将每孔约10个胚胎放入96孔板的第2至第12列中。

培养板。使用玻璃移液管从每个孔中移除多余的E3，并排入液体废液容器中。为对胚胎进行化学处理，从96孔板中将每种化学稀释液各100微升转移至对应的胚胎孔中，用一张纸巾创建一个湿润环境，并将培养板置于避光容器中。

大小需足以容纳一个96孔板。然后使用封板膜密封孔板。将其置于避光容器中，并在28.5摄氏度下孵育所需的时间。

为了去除化学物质，向每行加药的孔中加入 300 µL 的 E3。然后吸去培养基，再用 E3 洗涤胚胎 3 次以固定胚胎，并将胚胎转移至 4 个已标记的 24 孔板中，移液时将移液器置于深色背景前。每次转移后，检查移液器中是否残留胚胎，以避免交叉污染，并移除任何已死亡的胚胎。

吸去 E3 液体，使胚胎刚好被液体浸没。然后用玻璃移液器向每个孔中加入两滴 50 毫克/毫升的蛋白酶。将胚胎在孔板中孵育 5 分钟，随后振荡孔板，使绒毛膜破裂分散。

使用 E three 将胚胎清洗两次后，吸除并弃去残留的 E three。向每个孔中加入 4%P-F-A-P-B-S，并在 4°C 下孵育胚胎过夜。随后按照文本方案中所述进行特定检测，例如整体原位杂交或 wish，以对化学筛选中的胚胎进行评分。

将它们转移至已标记的12孔板中，然后按照本图所示，使用体视显微镜进行观察。由单人完成约600种化合物的化学生物学筛选是可行的，大约需要连续九周的专注工作；若由三人共同完成，则可缩短至三周。因此，仅需一至数人的实验操作时间，即可避免使用高成本、高资源需求的自动化系统等设备。

如图所示，将斑马鱼胚胎在受精后50%体节期至24小时受精龄（HPF）期间暴露于生物活性化合物文库中的单个化合物，随后使用包含三种核糖探针的混合探针通过原位杂交进行检测，以标记肾单位的不同节段。例如，根据分级系统，若某化合物导致近曲小管（PCT）显著扩张，则将其归为一类，该类别代表表型缺陷最严重且表型观察可信度最高的类别。该化合物将被注释为一类PCT。

此外，这种分类方法提供了一种简单快速的方式来描述感兴趣的小分子，包括其对生物体作用的严重程度、药物作用的部位以及该部位受影响的方式。在进行此操作时，重要的是要记住在正确的发育时间点对胚胎进行分期。观看本视频后，您应能够充分理解如何使用斑马鱼胚胎进行人工化学筛选。