手册小分子屏幕接近高通量使用斑马鱼胚胎
November 8th, 2014
斑马鱼是一种极好的生物实验，研究脊椎动物发育过程和模型人类疾病。在这里，我们描述了如何用一个执行手动高通量化学屏幕在斑马鱼胚胎的协议整个安装原位杂交（WISH）读出。
以下实验的总体目标是使用手动样品处理对斑马鱼胚胎进行化学筛选。这是通过首先将成年斑马鱼放入带有隔板的交配室过夜，然后在第二天早上取下隔板以收集胚胎来实现的。接下来，将斑马鱼胚胎组排列到 96 孔板中，然后在所需的发育阶段用药物处理。
然后让胚胎发育，用 4% Paraldehyde 固定并测定以测量小分子对感兴趣的发育过程的影响。结果显示了发育变化，例如基因表达域的获得或丢失，这可以表明由被询问的小分子引起的硫酸盐或组织形态发生的改变。由于能够识别潜在的治疗性化合物，该技术的意义延伸到各种疾病的临床治疗。
通常，刚接触这项技术的人可能会遇到困难，因为他们需要获得处理胚胎所需的灵巧性，例如在多孔板之间转移胚胎而不会损坏它们。演示该程序的将是我和实验室的本科研究员 Eric Donahue 设置斑马鱼交配。使用带隔板的交配室，将成年雄性斑马鱼放在隔板的一侧，将成年雌性斑马鱼放在另一侧。
对于每个待测小分子的 96 孔板。设置 25 个配对水箱并放置过夜。第二天，取下分隔每对鱼的腔室，一小时后，使用细网过滤器收集胚胎，然后用移液管将它们放入含有 E 3 培养基的培养皿中。
从板和立体镜下清除碎屑。观察每一窝胚胎并取出任何未受精的卵子。倒出 E 3 培养基，并替换为新鲜的 E 3。
然后将每皿胚胎放入 28.5 摄氏度的培养箱中两个小时。再次检查盘子，丢弃任何其他未受精的鸡蛋。继续将胚胎孵化到 40%eely 阶段。
将化学库板从零下 80 摄氏度中取出。用铝箔覆盖它，并用八通道移液器在室温下解冻。将 99 微升 E 3 添加到 96 孔板的第 2 至 12 列中。
然后在此处将 1 微升适当的化合物添加到第 2 至 11 列的孔中，指定为实验样品 将 1 微升 DMSO 移液到对照柱中，此处设计为第 12 列。使用铝箔覆盖稀释板，并将储备化学库放回冰箱。接下来，在选择含有 40% 外延期胚胎的培养皿后，使用移液管小心地将每孔约 10 个胚胎放入 96 的第 2 至 12 列中。
孔板。使用玻璃移液管从每个孔中取出多余的 E 3 并排入液体废物容器中。为了对胚胎进行化学处理，将 100 微升每种化学稀释液从 96 孔板转移到胚胎的相应孔中，以用纸巾创建一个潮湿室，并将其放入光敏容器中。
足够大，可容纳 96 孔板。然后使用天花板垫密封板。将其放入光敏容器中，并在 28.5 摄氏度下孵育所需的时间长度。
要去除化学物质，请向每行经过药物处理的孔中加入 300 微升 E 3。然后在使用 E 3 洗涤胚胎之前吸出培养基 3 次以固定胚胎，将它们转移到四个标记的 24 孔板中，将移液器放在深色背景前。每次移孔后，为了识别残留在移液管中的胚胎并防止交叉，去除任何死胚胎。
拉出 E 3，使胚胎几乎不会浸没在液体中。然后用玻璃移液管向每滴中加入两滴 50 毫克/毫升链霉蛋白酶。将胚胎孵育 5 分钟，然后搅动孔，使可丽耐破裂。
使用 E 3 洗涤胚胎两次后，取出并丢弃剩余的 E 3。向每个孔中加入 4% P-F-A-P-B-S，并在 4 摄氏度下孵育胚胎过夜。然后执行感兴趣的筛选，例如孔安装原位杂交，或按照文本方案中概述的愿望，从化学筛选中对胚胎进行评分。
在使用立体显微镜观察它们之前，将它们转移到标记的 12 孔板中，如下图所示。一个人在 9 周的专注工作过程中对大约 600 种化合物进行化学遗传学筛选是可行的，如果由三个人进行，这个时间可以减少到三周。因此，一个人或几个人的工作台时间可以绕过对自动化系统等高资源要求设备的需求。
如图所示，斑马鱼胚胎经受来自 50% 人至 24 HPF 的生物活性文库中的单个化合物，然后根据需要进行检测，使用三个核糖探针的混合物检测肾单位段。例如，分级系统，导致近端曲小管或 PCT 急剧增大的化合物将被归类为 1 类，它代表与最严重缺陷相关的类别和对观察到的表型的最高置信度。然后，该化合物将被注释为第一类 PCT。
此外，此分类提供了一种简单快速的方法来描述感兴趣的小分子，包括其对生物体影响的严重程度、受药物影响的区域以及该区域受到影响的方式。在尝试此程序时，重要的是要记住在正确的发育时间点分期您的胚胎。看完这个视频，你应该对如何对斑马鱼胚胎进行手动化学筛选有了很好的了解。
概述
本文介绍了一种在斑马鱼胚胎中进行手动高通量化学筛选的协议，利用整体原位杂交（WISH）进行分析。斑马鱼是研究脊椎动物发育和人类疾病的宝贵模型。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 药理学
背景
- 由于斑马鱼的胚胎是透明的，因此它们在发育生物学中被广泛使用。
- 高通量筛选允许有效评估大量化合物。
- 整体原位杂交是一种用于可视化基因表达的技术。
- 本研究旨在识别影响发育过程的小分子。
研究目的
- 开发一种用于斑马鱼胚胎化学筛选的手动方法。
- 评估小分子对基因表达和组织形态发生的影响。
- 提供一个可供新手研究人员使用的协议。
使用的方法
- 为斑马鱼设置交配室以收集胚胎。
- 将胚胎排列到96孔板中进行药物处理。
- 使用整体原位杂交来评估基因表达变化。
- 根据化合物对发育表型的影响进行分类。
主要结果
- 识别化学处理导致的斑马鱼胚胎的发育变化。
- 根据观察到的缺陷严重程度对化合物进行分类。
- 证明手动筛选多达600种化合物的可行性。
- 对治疗化合物识别的潜在影响。
结论
- 手动化学筛选方法对于研究发育过程是有效的。
- 这种方法可以促进具有治疗潜力的化合物的发现。
- 胚胎的适当分期对于准确结果至关重要。
常见问题
Executive Industry Relevance
Manual high-throughput small molecule screening in zebrafish embryos enables early-stage target validation and phenotypic assessment without the need for automated platforms. This approach supports rapid hypothesis testing and functional de-risking in discovery biology, making it accessible for diverse R&D teams. The method provides a scalable entry point for identifying compounds with developmental or disease-modifying effects, directly informing portfolio triage and lead prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a whole-organism vertebrate context.
- Supports functional target validation by visualizing gene expression and tissue morphogenesis changes.
- Facilitates mechanistic de-risking through direct observation of compound-induced phenotypes.
- Provides actionable data for predictive confidence in early-stage compound selection.
Screening & Assay Development
- Prepares validated zebrafish embryo systems for downstream phenotypic screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative outputs via standardized WISH-based readouts.
- Enables scalable screening of up to hundreds of compounds with minimal infrastructure.
- Supports reliable evaluation of compound effects on developmental processes.
Translational & Preclinical Research
- Aligns phenotypic screening with disease-relevant developmental pathways.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by linking gene expression changes to organismal outcomes.
- Informs risk-adjusted advancement decisions based on observed severity and specificity of phenotypes.
- Offers predictive de-risking for translational biomarker identification when supported by gene expression data.
Pipeline & Workflow Integration
This manual screening protocol bridges early discovery and lead identification by enabling functional assessment of small molecules in a vertebrate model. It integrates with workflows requiring hypothesis testing, phenotypic screening, and quantitative analytics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of compound effects on developmental pathways and gene expression.
- Screening: Provides assay-ready zebrafish embryos and standardized WISH outputs for reproducible screening.
- Analytics: Enables classification and quantitative scoring of phenotypic outcomes for comparative analysis.
- Translational Research: Connects early phenotypic findings to disease models and potential biomarker development.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, scalable platform for ongoing compound library evaluation and mechanistic studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in early-stage screening.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible results without reliance on high-cost automation.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of promising compounds.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in zebrafish embryo handling and WISH analysis.
- Needs basic laboratory infrastructure, including multi-well plates, pipettes, and stereomicroscopy.
- Demands cross-team standardization for staging, scoring, and data annotation.
- Adaptable to various developmental stages and gene targets within zebrafish models.
- Manual throughput is limited by personnel availability and dexterity with embryo manipulation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:33
Preparation of Zebrafish Mating Chambers and Collection of Embryos
2:41
Arraying and Chemically Treating Zebrafish Embryos
4:34
Embryo Fixation and Chemical Screening
5:52
Results: Zebrafish Embryonic High-throughput Chemical Screen
7:17
Conclusion
