方法来提高高分辨率的敏感性疟疾熔单核苷酸多态性基因分型
November 10th, 2015
虽然高分辨率熔解分析提供了一个异质群体的单核苷酸多态性区分的能力，突变等位基因扩增偏置可提高其检测存在于样品中相对较低的百分比等位基因的能力。本协议描述的改进，提高了高分辨率熔解分析的灵敏度。
以下高分辨率熔解实验的总体目标是提高单个样品中低浓度存在的突变等位基因的检测灵敏度。这是通过首先通过将模板稀释至必要的体积和浓度来制备提取的 DNA 来实现的。第二步是制备正向和反向引物比例不对称的测定，以增加模板探针产物。
制备反应后，当与野生型或突变型模板结合时，将退火温度设置在探针的熔解温度之间。最后一步是在适当的 HRM 平台上分析扩增的产物。最终，突变等位基因扩增偏倚和基于探针的不对称 PCR 可以更灵敏地检测样品中存在的低浓度具有挑战性的 SNP 突变。
这种增加的敏感性对于群体中的突变监测很有用。与标准高分辨率熔解或 tac man 基因分型等现有方法相比，该技术的主要优点是它可以提高对低浓度等位基因的敏感性，并且还允许对基因组中彼此靠近的 SNP 进行基因分型。尽管这种方法可以深入了解疟疾寄生虫中耐药性的传播。
它也可以应用于其他系统，例如监测其他传染病类型（如 HIV）或检测细胞群中的罕见癌症变异。演示该程序的是 Caitlin Durphy。我们实验室的一名技术人员。
用于高分辨率熔解或 HRM 的模板由恶性疟原虫样品制备，该样品直接从参与现场研究的患者的血液中获得。样品可以储存在滤纸上、用于快速检测测试或作为沉淀红细胞样品也可以用于体外生长的培养物。一些用于分析的标准实验室菌株可以从疟疾研究和参考试剂资源中心订购样品可以从全血、红细胞或滤纸中提取，也可以直接从沉淀的红细胞中提取或用于从沉淀的红细胞中直接扩增的培养物。
首先，按照疾病控制和预防中心的程序，使用薄涂片显微镜确定红细胞的 para。然后将 paras 高于 0.5% 的红细胞稀释 1 至 400。在 TE 中，每 5 至 10 微升反应将使用 3 微升稀释的红细胞，由于在一种变异性之间，阳性和阴性对照必须始终包含在 HRM 分析中。
每 1 微升稀释的质粒或标准品制备 10 pg 至 10 ng，并将序列验证的 snip 基因型作为阳性 trolls。使用 PCR 级水作为扩增反应的无模板阴性对照。通过准备 10 x 引物和探针的工作储备液来开始此过程。
相同的方案适用于使用 96 孔板、384 孔板、8 个联管或玻璃毛细管的检测。但出于此演示的目的，将仅使用 96 孔板和玻璃毛细管。下表显示了基于封闭探针的 HRM 基因分型的推荐 10 x 工作储备液浓度以及最终浓度。
为每个准备反应混合物。好吧，加入 10 x 工作储备液、正向和反向引物和探针中各 1 微升。4 至 5 μL HRM 预混液、1 μL 模板和 PCR 级水，总反应体积为 10 μL。
对每个玻璃毛细管执行相同的作。盖上板和玻璃毛细管。使用光学板密封件进行基于板的扩增，使用塑料瓶盖进行基于毛细管的系统。
确保覆盖完整，板和盖完全密封并固定以防止蒸发。在扩增过程中。旋转样品以去除气泡。
在台式离心机中以 1， 800 倍 G.离心玻璃毛细管在 pico 离心机中旋转板 3 分钟，离心玻璃毛细管 10 至 15 秒。将反应板和玻璃毛细管置于热循环仪中运行标准封闭探针或 MAAB 扩增方案。PCR 扩增后，从系统软件界面进行熔解分析。
将板从 40 摄氏度熔化到 80 摄氏度，以产生探针和扩增子熔解峰。在 light cycler four 80 上进行的第一步熔解分析是从标准化荧光相对于温度视图的负导数进行归一化。移动归一化条以包围探针熔解区域。
探针熔解区域是两个熔解区域中较低的温度。归一化条应位于熔峰的底部。归一化后，选择 calculate groups （计算组） 以自动将样本分配到组，如有必要，手动将样本重新分配给特定组。
选择未扩增或熔解峰呈锯齿状的样品。然后转到新呼叫并选择负数。选择任何剩余的错误分类样品后，转到 New Call，选择适当的分组，然后单击 Apply change 根据标准品为每个组分配基因型。
确认计算的组正确后，选择分组选项卡下的编辑组名称。在相应的彩色框中输入标准品的基因型。例如，如果标准 3D 7 具有已知的 C 基因型并且位于第一组中，则第一组中的所有样品都具有基因型 C 压制结果，并且基因型显示在样品旁边。
最后，将结果导出为 TXT 文件，以便进一步进行样本群体分析。在 light cycler 2.0 上运行完成后，在样品数据下记录样品名称和位置 开始分析之前，标记阴性对照和熔解标准品的基因型。通过选择分析开始熔解分析，在熔解曲线分析和压榨下选择基因分型。好。
要提高自动分组的灵敏度，请选择所有样品，以便在熔解曲线图中显示。将归一化条滑动到探针熔解峰的上限。通过在 group name （组名称） 下单独选择每个组，确认样本已正确分组。
通过选择所有样品、复制数据并粘贴到工作表中来导出每个样品的基因型。归一化荧光相对于温度的负导数图通常是可视化熔解峰和确定基因型的最直接方法。将分析窗口设置为仅探针区域可清晰区分对应于特定 SNP 的峰。
完美匹配会产生更高的熔解峰（以红色表示）。虽然 SNP 错配的熔解温度较低，但当样品中存在两个等位基因时，以灰色表示。基于概率的 HRM 分析将两个等位基因表示为两条峰曲线，以橙色显示，与单个等位基因样品匹配的峰以红色和灰色显示，在扩增过程中逐渐降低 ealing 温度导致偏向于由多基因组或多等位基因样品中左侧峰表示的突变等位基因。
这种突变等位基因扩增偏倚导致 HRM 对检测多基因组或多等位基因样品中存在小于 1% 的次要等位基因具有敏感性。在尝试此程序时，请务必记住样本质量是关键。缓冲液浓度的微小差异会改变 HRM 曲线。
使用控件是标准化结果的有用方法。观看本视频后，您应该对如何使用基于概率的不对称 PCR 和突变等位基因扩增偏差来准确、灵敏地对各种样本类型的疟疾 SNP 进行基因分型有很好的了解。
概述
该协议通过优化DNA制备和检测条件，提高了高分辨率熔解（HRM）分析在低浓度下检测突变等位基因的灵敏度。它能够更好地检测具有挑战性的SNP突变。
关键研究组成部分
科学领域
- 遗传学
- 分子生物学
- 病原体监测
背景
- 高分辨率熔解分析可以区分单核苷酸多态性（SNPs）。
- 突变等位基因扩增偏差可以提高检测灵敏度。
- 适用于监测人群中的突变，包括药物耐受性。
- 适用于各种传染病和癌症变异。
研究目的
- 提高检测低浓度突变等位基因的灵敏度。
- 改善紧密位点SNP的基因分型。
- 提供一种可靠的突变监测方法。
使用的方法
- 从患者样本中提取DNA的准备。
- 使用不对称引物比例以增强扩增。
- 使用HRM平台进行热循环和熔解分析。
- 在分析中包括阳性和阴性对照。
主要结果
- 提高了低浓度SNP突变的检测能力。
- 成功应用于监测疟疾的药物耐受性。
- 在各种样本类型中证明了有效性。
- 结果可以导出以供进一步分析。
结论
- 该方法显著提高了标准HRM的灵敏度。
- 它适用于疾病监测的不同应用。
- 为未来的遗传学研究提供了一个稳健的框架。
常见问题
Executive Industry Relevance
Enhanced sensitivity in SNP genotyping supports early detection of low-frequency drug-resistant malaria strains, a critical need for surveillance in elimination settings. The method enables reliable genotyping of polygenomic infections, improving the accuracy of resistance marker tracking and parasite population fingerprinting. This capability strengthens predictive confidence in resistance emergence and informs timely public health interventions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by detecting minor allele variants associated with drug resistance.
- Operational Value: Supports functional target validation through sensitive SNP discrimination in complex genomic backgrounds.
- Predictive Value: Increases confidence in lead identification by reducing false negatives in low-abundance mutation detection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by ensuring accurate SNP genotyping.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through asymmetric primer optimization and melting curve normalization.
- Scalability: Compatible with 96-well plates, 384-well plates, and capillary systems for high-throughput surveillance workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by enabling consistent SNP monitoring across sample types.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in resistance mechanism attribution by improving detection of minor allele variants.
- Disease-Relevant System: Applicable to Plasmodium falciparum field samples, supporting real-world surveillance relevance.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early SNP detection to lead optimization and preclinical validation, particularly for resistance mechanism studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling sensitive detection of resistance-associated SNPs.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs through normalized melting peak analysis and group calling.
- Analytics: Provides statistical confidence via group reassignment and genotype calling based on melting curve clustering.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling longitudinal tracking of allele frequency shifts in parasite populations.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable genotyping platform adaptable to other infectious diseases and cancer variant surveillance.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in resistance detection.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across sample types and platforms.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions in resistance monitoring, capital efficiency in surveillance programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of interventions based on early detection of emerging resistance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in PCR optimization, melting curve analysis, and genotype calling.
- Dependent on HRM-capable thermal cyclers and normalized fluorescence analysis software.
- Necessitates cross-team standardization of primer ratios, annealing temperatures, and normalization protocols.
- Adaptation across model systems requires validation of asymmetric PCR conditions for each target SNP.
- Practical limitations include sensitivity to buffer quality and the need for proper negative controls to prevent false positives.
