Name: 方法来提高高分辨率的敏感性疟疾熔单核苷酸多态性基因分型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: 学习高分辨率熔解曲线分析技术，通过优化DNA制备和不对称引物比例，提高低浓度突变等位基因的检测灵敏度。该方法适用于疟疾SNP基因分型和病原体监测研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

作者感谢比尔和梅琳达·盖茨基金会对技术开发和培训的支持。

注意：本方案包含适用于96孔板、8联管条和基于毛细管系统（10 µl&#160;反应体积）的试剂体积和浓度；然而，通过相应调整所有试剂体积，HRM也可在384孔板系统中进行，反应体积为5 µl&#160;。大多数系统的检测范围为10 pg至10 ng模板DNA。&#160;
1. 准备模板
<ol>
	<li>从参与野外现场研究的患者血液中直接获取恶性疟原虫样本，样本可保存为全血、压积红细胞或滤纸片。 
	注意：样本也可经培养适应以生长 体外；用于分析的一些标准实验室菌株可从疟疾研究与参考试剂资源中心（MR4）订购。样本可直接使用红细胞沉淀或培养物，或从全血、红细胞或滤纸中提取。</li>
	<li>从滤纸或培养适应菌株中提取的DNA 
	注意：高分辨率熔解（HRM）对盐浓度敏感；由于提取方法不同导致的浓度差异会显著影响熔解温度。虽然特定的最终缓冲液对实验成功并非关键因素，但建议使用一种标准的常用洗脱或重悬缓冲液（即，水，1x Te [“低 Te”或“DNA 悬浮液缓冲液”：10 mM Tris-Cl，0.10 mM EDTA] 或 1x TE [10 mM Tris-Cl，1 mM EDTA]，用于所有样品，以避免出现异常或不一致的熔解曲线。
	<ol>
		<li>制备每份10 pg–10 ng的模板稀释液 &#181;l&#160;在标准 Te、TE 或水中，每 10 &#181;l&#160;反应</li>
	</ol>
	</li>
	<li>直接从红细胞沉淀中进行扩增
	<ol>
		<li>使用薄血涂片显微镜检查法测定红细胞寄生率 
		注意：检测感染红细胞寄生虫血症的方法可参见美国疾病控制与预防中心（CDC）提供的资料：http://www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/blood/microexam.html</li>
		<li>将高于0.5%的寄生虫血症样本用PCR级水、TE或Te稀释400倍。使用3 &#181;l&#160;每5–10 &#181;l&#160;反应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对照组 
	注意：高分辨率熔解曲线分析（HRM）可用于基因扫描，以检测群体中的序列变异12；然而，准确的基因分型需要使用经序列验证、含有目标SNP的标准品。可使用已知基因型的质粒构建体或疟原虫分离株。在大多数应用中，使用3D7（MR4 MRA-151）作为野生型对照。由于不同运行之间的变异性，每次实验均需包含阳性和阴性对照。
	<ol>
		<li>阳性对照：每1准备10 pg – 10 ng &#181;l&#160;具有序列验证的SNP基因型的质粒或标准品的稀释液。</li>
		<li>阴性对照：在扩增反应中使用PCR级水作为无模板对照（NTC）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

2. PCR 扩增
<ol>
	<li>准备反应混合物
	<ol>
		<li>（可选）矿物油覆盖层。注意：某些高分辨率熔解（HRM）系统为独立的熔解平台，在扩增过程中无加热盖以防止冷凝和产物蒸发。
		<ol>
			<li>在加入反应混合物前，向每孔板中加入 20 µl&#160;轻质矿物油。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>制备所有检测的 10 倍工作储备液
		<ol>
			<li>参见表 1，了解基于封闭探针的 HRM 基因分型推荐的 10 倍工作储备液浓度以及最终浓度。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>制备反应混合物
		<ol>
			<li>向板或管的每个孔中加入 1 µl&#160;10 倍工作储备液的正向和反向引物及探针，4.0 – 5.0 µl&#160;2.5 倍或 2.0 倍 HRM 预混液，1 µl&#160;模板，以及 PCR 级水，使总反应体积为 10 µl。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>覆盖板或管
		<ol>
			<li>对于基于板的扩增系统使用光学板封膜，对于基于条形管的系统使用光学帽，对于基于毛细管的系统使用塑料帽。确保完全覆盖，并将板和盖完全密封固定，以防止扩增过程中的蒸发。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>离心样品
		<ol>
			<li>以 1,800 × g 离心 3 分钟，以去除气泡；若使用矿物油，可分离油相和水相。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扩增程序
	<ol>
		<li>将反应板或管放入热循环仪中。运行标准的封闭探针或 MAAB 扩增程序（分别为表 2 和表 3）。注意这两种方法之间退火温度的差异。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. HRM 分析
<ol>
	<li>熔化
	<ol>
		<li>PCR扩增后，进行熔解分析。对于没有内置扩增功能的独立熔解系统（例如，BioFire Defense LightScanner 系统），从PCR仪中取出扩增后的反应板并放入高分辨率熔解曲线（HRM）分析仪中。通过系统软件界面，将反应板以40–80 ℃进行熔解分析 &#176;C 以同时产生探针和扩增子的熔解峰。 
		注意：为节省熔解和分析时间，可缩短熔解程序的温度范围，仅覆盖探针或扩增子的熔解区域。熔解完成后，必要时可对板和管进行再次熔解，并于-20℃保存。 &#176;C 或 4 &#176;C. 仅在 4℃ 下储存玻璃管 &#176;C 以防止试管破裂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>熔解分析
	<ol>
		<li>去除阴性样本&#160;
		<ol>
			<li>在分析软件中，剔除未扩增或熔解峰呈锯齿状的样本，不再进行后续分析。注意：选择单个运行文件的分析模式后，仪器会自动将阳性与阴性样本分组。在对每个子集进行基因分型之前，用户可手动修改判读结果。&#160;
			<ol>
				<li>在熔解曲线或熔解峰视图中，右键单击需删除的曲线以选中它们。选择分类错误的样本后，进入“新建分型”，选择适当的分组，然后点击“应用更改”。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
		<li>标准化
		<ol>
			<li>从归一化荧光对温度的负导数（–dF/dT）（“差异曲线”）视图中，移动归一化条以包围探针熔解区域。 
			注意：探针熔解区域是两个熔解区域中温度较低的一个。归一化基线应位于熔解峰的底部。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>计算分组&#160;
		<ol>
			<li>归一化后，选择“计算分组”以自动将样本分配至各组。 
			如有必要，可手动将样本重新分配至特定组别。 
			注意：某些分析软件具有无法更改的高灵敏度阈值；在这种情况下，软件可能会将样本划分到与其视觉归属不同的组别中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>分配基因型
		<ol>
			<li>根据标准（阳性对照）为每组分配基因型。
			<ol>
				<li>在用户确认计算出的分组正确后（若不正确，则需在“分组”选项卡中，通过选择分类错误的样本，并从“新调用”旁边的下拉框中选择正确的组别来完成修正），点击“分组”选项卡下的“编辑组名称”。</li>
				<li>将标准品的基因型输入对应的彩色框中（例如，若标准品3d7已知为A基因型且位于红色组，则在红色组中输入基因型A）。点击“OK”并保存结果。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
		<li>导出结果
		<ol>
			<li>将基因型分型结果导出为电子表格，用于进一步的样本群体分析。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22World+Health+Organization+report+2013%22">World Health Organization report 2013</a>. , 1-286 (2013).</li>
<li>Hayton, K., Su, X. -Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+resistance+and+genetic+mapping+in+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Current+genetics%22%5BJournal%5D)">Drug resistance and genetic mapping in Plasmodium falciparum.</a> Current genetics. 54 (5), (2008).</li>
<li>Neafsey, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+SNP+genotyping+highlights+the+role+of+natural+selection+in+Plasmodium+falciparum+population+divergence%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide SNP genotyping highlights the role of natural selection in Plasmodium falciparum population divergence.</a> Genome biology. 9 (12), R171(2008).</li>
<li>Volkman, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+map+of+diversity+in+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide map of diversity in Plasmodium falciparum.</a> Nature. 39 (1), 113-119 (2007).</li>
<li>Volkman, S. K., Neafsey, D. E., Schaffner, S. F., Park, D. J., Wirth, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+genomics+and+genome+biology+to+understand+malaria+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Harnessing genomics and genome biology to understand malaria biology.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (5), 315-328 (2012).</li>
<li>Manske, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Plasmodium+falciparum+diversity+in+natural+infections+by+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Analysis of Plasmodium falciparum diversity in natural infections by deep sequencing.</a> Nature. 487 (7407), 375-379 (2012).</li>
<li>Auburn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+within-host+Plasmodium+falciparum+diversity+using+next-generation+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Characterization of within-host Plasmodium falciparum diversity using next-generation sequence data.</a> PLoS ONE. 7 (2), e32891(2012).</li>
<li>Daniels, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+SNP-based+molecular+barcode+for+Plasmodium+falciparum+identification+and+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">A general SNP-based molecular barcode for Plasmodium falciparum identification and tracking.</a> Malaria Journal. 7, 223(2008).</li>
<li>Daniels, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+surveillance+detects+both+clonal+and+epidemic+transmission+of+malaria+following+enhanced+intervention+in+Senegal%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Genetic surveillance detects both clonal and epidemic transmission of malaria following enhanced intervention in Senegal.</a> PLoS ONE. 8 (4), e60780(2013).</li>
<li>Daniels, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((field-deployable+method+for+genotyping+and+discovery+of+single-nucleotide+polymorphisms+associated+with+drug+resistance+in+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+agents+and+chemotherapy%22%5BJournal%5D)">field-deployable method for genotyping and discovery of single-nucleotide polymorphisms associated with drug resistance in Plasmodium falciparum.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 56 (6), 2976-2986 (2012).</li>
<li>Olbadia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+outbreak+of+Plasmodium+falciparum+in+eastern+Panama%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Clonal outbreak of Plasmodium falciparum in eastern Panama.</a> The Journal of infectious diseases. , (2014).</li>
<li>Montgomery, J., Wittwer, C. T., Palais, R., Zhou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+mutation+scanning+and+genotyping+by+high-resolution+DNA+melting+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Simultaneous mutation scanning and genotyping by high-resolution DNA melting analysis.</a> Nature protocols. 2 (1), 59-66 (2007).</li>
<li>Mharakurwa, S., Daniels, R., Scott, A., Wirth, D. F., Thuma, P., Volkman, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-amplification+methods+for+tracking+low-grade+Plasmodium+falciparum+populations+during+scaled-up+interventions+in+Southern+Zambia%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Pre-amplification methods for tracking low-grade Plasmodium falciparum populations during scaled-up interventions in Southern Zambia.</a> Malaria Journal. 13, 89(2014).</li>
</ol>

作者无任何披露信息。

连续&#160;HRM 是一种 PCR 后分析步骤；因此，样品和实验体系的设置与标准 PCR 方案类似，但需额外加入一种荧光嵌 intercalating 染料，用于在高分辨率熔解步骤中追踪双链 DNA 向单链 DNA 的转变。成功进行 HRM 分析最关键的要素是获得稳定的 PCR 产物。引物探针设计至关重要，目前已有多种专为 HRM 实验设计优化的工具可供商业化购买或在线使用13。扩增子长度为 80–150 个碱基对，并配合使用约 20 个碱基对、覆盖目标 SNP 或多个 SNP 位点的封闭探针，最有利于区分单个 SNP 以及探针区域内的多个 SNP 单倍型。探针可通过在 3’端添加 C3 间隔基团或引入 2 个碱基对的错配来实现封闭，从而防止在扩增过程中发生延伸。探针可设计为与 Watson 链或 Crick 链模板互补；具体选择需通过实验验证，以确定哪种探针设计可产生理想的熔解峰。使用过量的正向或反向引物可生成单链扩增产物，使其与封闭探针退火结合。若探针序列与正向链一致，则使用过量的反向引物，通常比例为 1:5；反之，若探针匹配反向链，则使用过量的正向引物。
同样，高分辨率熔解曲线分析（HRM）在具有足够且强健的PCR产物时效果最佳。PCR反应的优化需要通过梯度PCR以及琼脂糖凝胶电泳或Bioanalyzer分析，以确定最佳退火温度。模板浓度可通过预扩增等方法提高，例如使用较低的引物浓度和较少的循环次数对所有靶标进行偏向性多重扩增，从而增加模板浓度13。
仅有少数仪器适用于MAAB。这些系统中所用玻璃毛细管的热学特性有利于该方法的实施。毛细管较小的内径以及玻璃材料快速的热传导，相较于标准PCR塑料耗材，能够实现更严格的温度控制；由于塑料具有隔热性能，其在退火和变性循环之间的温度转换速率较慢。采用该方法，可在野生型与突变型等位基因的混合物中将突变等位基因的检测灵敏度从2-5%降低至低于1%10。
高分辨率熔解曲线分析（HRM）是一种简便、高效且经济的单核苷酸多态性（SNP）分型工具，适用于多种场景和广泛应用，从传染病监测到癌症基因变异的筛查均可使用。其他一些仪器，如Roche Nano和LightCycler系统（480和96型）以及Eco实时PCR系统，除了具备标准扩增、实时检测和拷贝数分析功能外，也提供HRM功能。使用高通量设备时，我们实验室测得的HRM条形码检测成本每反应低于0.50美元，包含所有试剂和耗材。
在本文所述背景下，基于现场的应用可实现实时种群监测，以发现与疟疾防控工作相关的种群变化，包括种群多样性下降、输入性寄生虫类型的检出，以及与药物敏感性降低相关的单核苷酸多态性（SNP）的出现和传播。对该方法的优化进一步提高了灵敏度，有助于评估疟疾消除和根除工作的进展。

尽管人们对疟疾防控和根除重新产生了兴趣，但疟疾仍然是全球性的负担，全球近一半人口面临感染风险，每年导致超过55万人死亡，尤其是撒哈拉以南非洲地区的儿童1。
这些新的防控和根除计划得到了基因组学复兴的支持，大量疟原虫已被测序并分析，以寻找与药物敏感性降低、毒力增强以及群体特征相关的突变2,3。单核苷酸多态性（SNPs）是最常被识别出的遗传变异类型之一4-7。
便携式 SNP 分型方法可实现现场和实时的群体监测与追踪8。除了对单个寄生虫进行分子指纹鉴定外，“分子条形码”还可用于检测等位基因频率的显著时间变化，以及有效群体大小和感染复杂性的变化9。
尽管这一组信息性SNP可轻松适配多种基因分型平台，但高分辨率熔解（HRM）分析尤其适用于基于现场的研究，在资源有限的环境中，相较于测序及其他方法，HRM具有高灵敏度、操作简便、检测成本低等优势，适合用于新发突变的检测。
高分辨率熔解曲线分析（HRM）始于标准的聚合酶链式反应（PCR），该反应中加入荧光染料。PCR后的熔解分析可确定扩增产物的峰值熔解温度；在短扩增片段中，单个单核苷酸多态性（SNP）差异即可导致显著的峰值熔解温度（Tm）差异。
该方法的多项改进可提高基因分型分辨率，以区分包括IV类（A-T）在内的单核苷酸多态性（SNPs），并检测在存在多个等位基因（多基因组感染）样本中的低频突变等位基因。首先，检测体系中除正向和反向引物外，还引入了以SNP区域为中心的短探针，且引物浓度设置不同。这些封闭型探针在PCR过程中不会被扩增，但可与因引物浓度不对称而过量产生的DNA链结合，从而增加探针-模板产物的生成。由探针与过量模板链结合形成的独立双链扩增子长度约为20–30 bp，相较于完整的扩增子（80–150 bp）显著缩短，使得单个或多个碱基错配所导致的探针-模板Tm值差异更加明显10。
其次，突变等位基因扩增偏倚（MAAB）通过降低反应的退火温度，使反应偏向于多基因组感染中低比例存在的突变等位基因。退火温度设定在完全匹配（野生型）与不匹配（突变型）探针的 Tm 值之间。在此温度下，野生型等位基因的结合稳定性足以抑制其扩增，而相对于其不匹配的对应物，从而在同一样本中同时存在两种等位基因时，使扩增偏向于突变等位基因10。
通过这些高分辨率熔解曲线（HRM）技术的改进，该方法已能够追踪与南美洲流行性感染相关的寄生虫的来源和身份11，并可检测新突变，区分序列中相邻位置的多个单核苷酸多态性（SNP），以及在多基因组样本中等位基因频率低于1%的突变10。
灵敏度的提高在接近消除疟疾状态的地区以及面临药物耐药性出现风险的地区尤为重要。在现场快速、简便地鉴定输入性寄生虫及与敏感性降低相关的单核苷酸多态性（SNP），有助于监测工作和防控项目评估其实施效果，并识别出需要加强疟疾根除和消除工作的重点区域。本方案描述了基于阻断探针和MAAB方法以提高高分辨率熔解（HRM）基因分型灵敏度的技术流程。

<table><tbody><tr><td>LightScanner 主混合液</td><td>BioFire Defense</td><td>HRLS-ASY-0003</td><td></td></tr><tr><td>轻质矿物油</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td>用于 BioFire Defense 基于板的高分辨率熔解（HRM）系统</td></tr><tr><td>TE</td><td>Teknova</td><td>T0226</td><td></td></tr><tr><td>Te</td><td>Teknova</td><td>T0221</td><td>含低浓度 EDTA 的 TE 缓冲液</td></tr><tr><td>PCR 级水</td><td>Teknova</td><td>W3330</td><td></td></tr><tr><td>恶性疟原虫标准品</td><td>MR4</td><td>MRA-151, 156, 205, 330</td><td>MR4.org 提供免费的基因组 DNA</td></tr><tr><td>Light Scanner 引物设计软件</td><td>BioFire Defense</td><td></td><td>用于 HRM 检测设计的商业软件</td></tr><tr><td>LightCycler 480 高分辨率熔解主混合液</td><td>Roche</td><td>4909631001</td><td>适用于 LightCycler-480、-96 和 nano 仪器，浓度为 2×</td></tr><tr><td>生物分析仪</td><td>Agilent</td><td>G2938A</td><td>Agilent 2100 生物分析仪</td></tr><tr><td>LightCycler 2.0</td><td>Roche</td><td>3531414001</td><td>基于毛细管的 MAAB 系统</td></tr><tr><td>LightCycler Nano</td><td>Roche</td><td>6407773001</td><td>基于条形管的 HRM 和扩增系统</td></tr><tr><td>LightCycler 96</td><td>Roche</td><td>5815916001</td><td>基于条形管和板的 HRM 及扩增系统</td></tr><tr><td>LightCycler 480</td><td>Roche</td><td>5015278001</td><td>基于板的 HRM（96 孔和 384 孔板）及扩增系统</td></tr><tr><td>LightScanner-96</td><td>BioFire Defense</td><td>LSCN-ASY-0011</td><td>基于板的 HRM（96 孔）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LightScanner-384</td><td>BioFire Defense</td><td>LSCN-ASY-0001</td><td>基于板的 HRM（96 孔）</td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Roche</td><td>4729692001</td><td>用于 HRM 的 96 孔板（LightCycler）</td></tr><tr><td>384 孔板</td><td>Roche</td><td>4729749001</td><td>用于 HRM 的 384 孔板（LightCycler）</td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP-9665&amp;nbsp;</td><td>用于 HRM 的 96 孔板（LightScanner）</td></tr><tr><td>384 孔板</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP-3865&amp;nbsp;</td><td>用于 HRM 的 384 孔板（LightScanner）</td></tr><tr><td>LightCycler 8 管联排（透明）</td><td>Roche</td><td>6327672001</td><td>用于 HRM 的联排管（LightCycler 96 和 LightCycler Nano）</td></tr><tr><td>LightCycler 毛细管（20 &amp;mu;l）</td><td>Roche</td><td>4929292001</td><td>用于 HRM 的毛细管</td></tr><tr><td>光学板封膜</td><td>Roche</td><td>4729757001</td><td>其他品牌也可使用</td></tr></tbody></table>

提高疟疾高分辨率熔解单核苷酸多态性分型灵敏度的方法

Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

尽管数十年来一直在努力根除疟疾，但疟疾仍然是全球面临的重大负担。近年来，随着对区域消除和全球根除疟疾的兴趣重新兴起，关于引起疟疾的疟原虫（Plasmodium）物种的基因组信息也日益增多，包括不同地理种群的特征以及与抗疟药物敏感性降低相关的变异。
一种常见的遗传变异——单核苷酸多态性（SNPs）——为寄生虫基因分型提供了理想的靶标。这些标记不仅可用于追踪药物抗性标记，还可利用不受药物或其他选择性压力影响的标记来追踪寄生虫种群。
单核苷酸多态性（SNP）分型方法可用于追踪药物抗性，同时对个体寄生虫进行“指纹”鉴定，以开展种群监测，特别是在接近消除疟疾的地区应对疟疾防控工作时尤为重要。
尽管已鉴定出与特定基因分型技术无关的信息性SNP，但高分辨率熔解（HRM）分析特别适用于基于现场的研究。与标准的基于荧光探针的方法相比，后者需要每个SNP使用单独标记的探针，且在检测含有多个基因组（多基因组）样本中的SNP时灵敏度最多仅为10%，而HRM的灵敏度可达2-5%。通过对HRM进行改进，例如使用封闭探针、不对称引物浓度，以及优化扩增退火温度以使PCR偏向于扩增低频等位基因，可进一步提高HRM的灵敏度。虽然灵敏度的提升程度取决于具体的检测体系，但我们已将检测灵敏度提高至可检测低于1%的低频等位基因水平。
在接近消除疟疾的地区，及早发现新出现或输入性药物耐药性对于及时应对至关重要。同样，检测多基因组感染并区分输入性寄生虫类型与隐蔽的地方性传染源的能力，可为防控项目提供重要信息。
本文描述了对高分辨率熔解技术的改进，这些改进进一步提高了该技术检测患者样本中多基因组感染的灵敏度。

数据可以通过多种方式可视化，具体取决于分析软件和仪器。通常，以温度为横坐标，绘制归一化荧光强度对温度的负导数（–dF/dT）曲线，是观察熔解峰和确定基因型的最直接方法。
完整的熔解曲线窗口（40°C–80°C）将同时显示扩增子和探针的熔解区域。图1展示了这两个区域归一化熔解峰的示例。将分析窗口仅设置为探针区域时，可清晰区分对应于特定SNP的峰（图2）。
基于探针的分析明确显示两个等位基因均存在，表现为独立的熔解峰，其熔解温度与纯合SNP峰相匹配（图3）。
图4显示，在扩增过程中逐步降低退火温度（MAAB）会导致对突变等位基因（左侧峰）的偏好（图4A），从而在混合等位基因群体中提高对突变等位基因的检测灵敏度（图4B）。
<img alt="熔解峰图；荧光强度与温度关系；DNA分析；热稳定性研究。" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1">
图1. 探针和扩增子的熔解区域。 在较宽的熔解温度范围内，绘制归一化荧光强度对温度的负导数曲线，可同时获得探针（较低温度）和扩增子的熔解峰，可用于后续分析。（改编自 Daniels et al. DOI: 10.1128/AAC.05737-11）<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="归一化熔解峰；热分析图；DNA变性；相对信号与温度关系。" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 探针熔解峰。 完全匹配（通常为野生型等位基因）产生较高的熔解峰（红色），而单核苷酸多态性（SNP）错配的熔解温度较低（灰色）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="归一化熔解峰图，DNA熔解分析，温度与荧光关系，科学数据" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 多基因组熔解峰。 当样本中同时存在两个等位基因时，基于探针的高分辨率熔解（HRM）分析会呈现双峰曲线（橙色），其峰形分别与单等位基因样本（红色和灰色）相匹配。（改编自 Daniels 等，DOI: 10.1128/AAC.05737-11）<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="实时PCR曲线；DNA熔解曲线分析；扩增效率；突变等位基因检测。" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 突变等位基因扩增偏倚（MAAB）。 A. 在多基因组或多等位基因样本中，逐步降低扩增退火温度会使熔解峰反应偏向对应于突变型（较低温度）等位基因的峰。B. MAAB使得高分辨率熔解曲线分析（HRM）能够灵敏地检测多基因组或多等位基因样本中低于1%的低频等位基因。（B部分改编自Daniels等，DOI: 10.1128/AAC.05737-11） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1. 基于探针的高分辨率熔解扩增反应的设置。
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>每反应体积（96孔板和毛细管）</td>
			<td>每反应体积（384孔板）</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRM Master Mix</td>
			<td>4–5 µl</td>
			<td>2-2.5 µl</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x 过量引物</td>
			<td>1 µl</td>
			<td>0.5 µl</td>
			<td>0.50 µM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x 另一引物</td>
			<td>1 µl</td>
			<td>0.5µl</td>
			<td>0.1 µM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x 探针</td>
			<td>1 µl</td>
			<td>0.5 µl</td>
			<td>0.40 µM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR级水</td>
			<td>1–2 µl</td>
			<td>0.5-1 µl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>模板DNA</td>
			<td>1 µl</td>
			<td>0.5 µl</td>
			<td>0.01-10 ng/µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>10 µl</td>
			<td>5 µl</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 标准高分辨率熔解扩增条件。
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>温度</td>
			<td>时间</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>预变性</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>120 秒</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">45 个循环</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>30 秒</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>68 °C*</td>
			<td>30 秒</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">1 个循环</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>30 秒</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28 °C</td>
			<td>30 秒</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
* 此温度取决于扩增子
表3. 突变等位基因扩增偏倚的扩增条件。
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>温度</td>
			<td>时间</td>
			<td>循环数</td>
			<td>升温速率</td>
			<td>采集模式</td>
			<td>分析模式</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>变性</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>30 sec</td>
			<td>1</td>
			<td>20</td>
			<td>无</td>
			<td>无</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">循环</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>2 sec</td>
			<td rowspan="2">55</td>
			<td>20</td>
			<td>无</td>
			<td rowspan="2">定量分析</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>56 °C*</td>
			<td>15 sec</td>
			<td>20</td>
			<td>单点</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">熔解</td>
			<td>40 °C</td>
			<td>0 sec</td>
			<td rowspan="3"></td>
			<td rowspan="3">0.3</td>
			<td>无</td>
			<td>无</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>45 °C*</td>
			<td>0 sec</td>
			<td rowspan="2">连续</td>
			<td rowspan="2">熔解曲线分析</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 °C*</td>
			<td>0 sec</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
* 此温度取决于扩增子，在进行 MAAB 时会降低

尽管高分辨率熔解分析能够区分异质群体中的单核苷酸多态性，但突变等位基因的扩增偏好性可增强其检测样本中相对低比例等位基因的能力。本方案描述了提高高分辨率熔解分析灵敏度的改进方法。

尽管数十年来一直在努力根除疟疾，但该疾病仍然是全球的重大负担。近年来，人们对区域消除和全球根除疟疾重新产生了兴趣，这已……

以下高分辨率熔解实验的总体目标是提高对个体样本中低浓度突变等位基因的检测灵敏度。首先通过将提取的DNA模板稀释至所需体积和浓度来完成DNA的制备。第二步是采用不对称比例的正向与反向引物配制检测体系，以增加模板探针产物的生成。在准备反应体系后，退火温度应设定在探针结合野生型或突变型模板时熔解温度之间的范围内。最后一步是在相应的高分辨率熔解（HRM）平台上分析扩增产物。最终，通过突变等位基因扩增偏好性以及基于探针的不对称PCR，可更灵敏地检测样品中低浓度下难以检测的SNP突变。这种提高的灵敏度对于群体中的突变监测非常有用。与现有的标准高分辨率熔解曲线分析或TaqMan基因分型等方法相比，该技术的主要优势在于能够提高对低浓度等位基因的检测灵敏度，同时还可实现对基因组中位置相邻的SNPs进行基因分型。尽管该方法能够为了解疟原虫药物抗性传播情况提供重要信息。它还可应用于其他系统，例如对HIV等其他传染病类型的监测，或在细胞群体中检测罕见的癌症变异类型。演示该实验操作的将是本实验室的技术员Caitlin Durphy。高分辨率熔解（HRM）分析所用的模板可从直接采集自参与野外研究站点患者的恶性疟原虫样本中制备。样本可保存在滤纸上、快速检测试纸上，或作为红细胞沉淀保存；也可将样本进行体外培养适应性扩增。部分用于分析的标准实验室菌株可从疟疾研究与参考试剂资源中心订购。样本可从全血、红细胞或滤纸中提取，也可直接使用红细胞沉淀或培养物进行红细胞沉淀的直接扩增。首先采用美国疾病控制与预防中心（Centers for Disease Control and Prevention）提供的薄涂片显微镜检查法，确定红细胞中的寄生虫比例。当红细胞寄生率超过0.5%时，将其稀释400倍。在TE缓冲液中，每个5至10 µL的反应体系将使用3 µL稀释后的红细胞。由于存在变异，每次高分辨率熔解曲线分析（HRM）均必须包含阳性和阴性对照。使用经序列验证的snip基因型质粒或标准品，配制浓度为每微升10皮克至10纳克的稀释液作为阳性对照。扩增反应中以PCR级水作为空白模板阴性对照。首先配制引物和探针的10倍工作液。相同的方案适用于使用96孔板、384孔板、八联管条或玻璃毛细管的检测。但为了本演示的目的，仅使用96孔板和玻璃毛细管。下表列出了基于封闭探针的HRM基因分型推荐的10×工作液浓度以及最终浓度。为每个反应准备反应混合液。每个反应孔中加入1微升10倍工作浓度的正向引物、反向引物和探针，4至5微升HRM预混液，1微升模板，以及PCR级水，总体积为10微升。对每根玻璃毛细管进行相同操作。盖好培养板和玻璃毛细管。基于培养板的扩增使用光学板封膜，基于毛细管的系统使用塑料帽。确保覆盖完全，培养板和盖子完全密封并固定，以防止蒸发。扩增过程中，离心样品以去除气泡。将样品板在台式离心机中以1,800 × g离心3分钟。将玻璃毛细管在微量离心机中离心10至15秒。将反应板和玻璃毛细管放入热循环仪，运行标准的封闭探针或MAAB扩增程序。PCR扩增完成后，通过系统软件界面进行熔解分析。将反应板从 40 摄氏度加热至 80 摄氏度，以同时获得探针和扩增产物的熔解曲线峰。在 Light Cycler 480 上进行的第一步熔解分析，是通过观察归一化荧光信号对温度的负导数曲线进行归一化处理。移动归一化条，使其包围探针熔解区域。探针熔解区域是两个熔解区域中温度较低的一个。归一化条应位于熔解峰的基部。归一化完成后，如有需要，选择“计算分组”以自动将样本分配至各组，或手动将样本重新分配至特定组别。选择未扩增或熔解峰呈锯齿状的样本。然后进入“新建调用”并选择“阴性”。在选择所有剩余分类错误的样本后，进入“新建调用”，选择相应的分组，然后点击“应用更改”。根据标准为每组分配基因型。在确认计算出的分组正确后，在分组选项卡下选择编辑组名称。将标准品的基因型输入到对应的彩色框中。例如，如果标准品3D七已知为C基因型且位于第一组，则第一组中的所有样本基因型均为C，按下结果按钮后，基因型将显示在样本旁边。最后，将结果导出为 TXT 文件，以便进行进一步的样本群体分析。在 Light Cycler 2.0 运行结束后，记录样本数据下的样本名称和位置。在开始分析前，标记阴性对照以及熔解标准品的基因型。通过选择“分析”，在熔解曲线分析中选择“基因分型”，然后按“确定”开始熔解分析。为提高自动分组的灵敏度，选择所有样本以在熔解曲线图中显示。将归一化滑块移至探针熔解峰的上限位置。通过逐一选择分组名称下方的每个分组，确认样本已正确分组。通过选择所有样本，复制数据并粘贴到工作表中，导出每个样本的基因型。通常，以归一化荧光强度对温度的负导数作图是可视化熔解峰并确定基因型的最直接方法。将分析窗口设置为仅包含探针区域，可清晰区分对应于特定单核苷酸多态性（SNP）的熔解峰。完全匹配会产生红色显示的较高熔解峰。而当样本中同时存在两种等位基因时，单核苷酸多态性（SNP）错配则表现为灰色显示的较低熔解温度。基于探针的高分辨率熔解（HRM）分析将两种等位基因表现为两条橙色的峰曲线，其峰位置分别与红色和灰色显示的单等位基因样本相匹配。在扩增过程中逐步降低退火温度，会导致多基因组或多等位基因样本中突变等位基因的偏好性扩增，表现为左侧的熔解峰。 这种突变等位基因的扩增偏好性使得高分辨率熔解曲线分析（HRM）能够检测多基因组或多等位基因样本中低于1%的低频等位基因。在进行该实验时，需注意样本质量至关重要。缓冲液浓度的微小差异都可能导致HRM曲线发生偏移。使用对照是标准化实验结果的有效方法。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用基于探针的不对称PCR和突变等位基因扩增偏好，从多种样本类型中准确且灵敏地对疟疾SNP进行基因分型。

methods-to-increase-sensitivity-high-resolution-melting-single

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

方法来提高高分辨率的敏感性疟疾熔单核苷酸多态性基因分型

本文介绍了一种快速且经济的方法，用于从蚊虫标本中提取高质量的疟原虫及媒介DNA。该方法利用Chelex树脂的螯合特性，可简便地对蚊虫中肠和唾液腺阶段的疟原虫进行基因分型，同时通过PCR实现对Anopheles复合种的分子鉴定。...

一种简易的Chelex法从按蚊属（Anopheles spp.）中提取DNA

本视频展示了用于优化引物退火温度的梯度聚合酶链式反应，该方法可在各孔中设置梯度退火温度。通过扩增产物的产量来确定不同退火温度的效果，从而优化反应条件。...

梯度聚合酶链式反应确定最佳退火温度

在本视频中，我们介绍一种高分辨率熔解曲线PCR技术，该技术基于熔解温度分析，用于确定不同序列长度的DNA片段的长度多态性。...

高分辨率熔解PCR检测突变DNA序列中的序列变异

聚合酶链式反应（PCR）结合高分辨率熔解分析（HRMA）被证明是一种快速高效鉴定斑马鱼基因型的方法。...

利用高分辨率熔解分析结合PCR进行斑马鱼快速高效基因分型

染色体涂染是研究细胞核结构和核型进化的一种有用方法。本文演示了一种从单条多线染色体中分离并扩增特定目标区域的方法，所获得的材料随后用于二维和三维荧光 原位...

疟疾蚊虫中的二维与三维染色体涂染

传播疟疾的蚊子具有一些重要的流行病学特征，这些特征只能通过分子技术进行检测。我们利用基于 MALDI-TOF 的 SNP...

一种用于检测传播疟疾蚊虫的多指标检测方法

由于啮齿类疟原虫在生命周期和生物学特性上与人类疟原虫具有显著相似性，啮齿类疟疾模型已成为疟疾研究不可或缺的工具。本文中，我们对野生型和转基因啮齿类疟原虫进行表型分析时所使用的一些最重要技术进行了标准化。...

啮齿类疟原虫无性与有性血液阶段及蚊期阶段的表型分析

本文介绍了一种用于检测补体受体1（CR1）长度多态性的创新方法，该方法可应用于多个领域，特别是用于评估阿尔茨海默病（AD）等疾病的易感性。该方法有助于更深入地理解CR1异构体在AD发病机制中的作用。...

用于补体受体1长度多态性基因分型的高分辨率熔解PCR：阿尔茨海默病基因易感性评估的创新工具

本方案提供了从DNA提取到数字液滴PCR（ddPCR）实验建立的完整步骤，包括在gRNA引导的Cas9切割及DNA修复后，对靶位点处非同源末端连接（NHEJ）事件进行鉴定与定量的分析方法。该方法的其他应用还包括多态性检测和基因编辑变异体验证等。...

利用数字液滴PCR检测基因改造按蚊群体中的插入缺失突变

本文详细介绍了一种利用高分辨率熔解分析对埃及伊蚊（Aedes...

利用高分辨率熔解分析在蚊子Aedes aegypti中检测CRISPR/Cas9诱变后的插入缺失

焦磷酸测序分析可实现对异质性细胞或组织中线粒体DNA单核苷酸多态性的稳健且快速的基因分型。...

通过焦磷酸测序对线粒体基因组中的单核苷酸多态性进行基因分型

学习高分辨率熔解曲线分析技术，通过优化DNA制备和不对称引物比例，提高低浓度突变等位基因的检测灵敏度。该方法适用于疟疾SNP基因分型和病原体监测研究。

提高疟疾高分辨率熔解单核苷酸多态性分型灵敏度的方法

探索更多视频