Name: 快速，高效的斑马鱼基因分型采用PCR与高分辨率熔体分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-05T17:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: 学习使用PCR结合高分辨率熔解曲线分析（HRMA）对斑马鱼进行快速基因分型。该方法灵敏度高，可检测单核苷酸变异和小片段插入缺失，适用于大规模遗传筛选。

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感谢 Blaschke、Grunwald 和 Wittwer 实验室的成员提供的建议和技术支持。本工作由 PCMC 基金会、美国国立卫生研究院（NIH）R01 MH092256 和 DP2 MH100008 项目以及美国出生缺陷基金会研究基金 #1-FY13-425 资助，资助对象为 JLB。

1. DNA 制备
<ol>
	<li>制备DNA裂解缓冲液：50 mM KCl、10 mM Tris-HCl（pH 8.3）、0.3% Tween 20、0.3% NP40。在使用当天，加入新鲜的蛋白酶K，使其终浓度为1 mg/ml12。</li>
	<li>组织采集：
	<ol>
		<li>成年鱼尾鳍取样：
		<ol>
			<li>麻醉鱼类：将鱼放入0.004% MS-222（三卡因）溶液中，等待鳃部运动减缓。</li>
			<li>将鱼置于5–10层Kimwipe纸巾上，用无菌剃须刀片切割尾鳍一小段，约2–3 mm。</li>
			<li>迅速将鱼转移至标记好的盛有新鲜水的水族箱中恢复；同时仔细标记水族箱及对应含有尾鳍组织的离心管。每隔一天更换水并喂食。</li>
			<li>用无菌移液器吸头拾取尾鳍组织，转移至含有100 μl DNA裂解缓冲液的离心管中。</li>
			<li>丢弃移液器吸头，并将剃须刀片弃入锐器容器中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>胚胎尾部取样：
		<ol>
			<li>将胚胎放入0.004% MS-222（三卡因）溶液中，静置2分钟。</li>
			<li>在解剖显微镜下用镊子剪取尾部组织片段。</li>
			<li>将尾部组织放入含有30 μl DNA裂解缓冲液的标记离心管中。</li>
			<li>迅速将胚胎放入含有100 μl 4%多聚甲醛的离心管中。</li>
			<li>标记含有胚胎的离心管及其对应的尾部组织管。</li>
			<li>将含有胚胎的离心管在4 °C下过夜保存以完成固定。</li>
			<li>每处理一个胚胎后，使用Milli-Q水和Kimwipe纸巾清洁镊子，以最大限度减少交叉污染。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>整胚取样：
		<ol>
			<li>将胚胎放入0.004% MS-222（三卡因）溶液中，静置2分钟。</li>
			<li>将1–5个胚胎放入含有100 μl DNA裂解缓冲液的离心管中。无需去壳。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA消化 
	将含有组织（尾鳍、尾部片段或胚胎）的离心管在55 °C孵育4小时至过夜12。</li>
	<li>灭活蛋白酶K 
	将离心管在95 °C加热15分钟12。所得DNA应立即用于PCR，或在-20 °C保存不超过3个月。</li>
</ol>
2. PCR
<ol>
	<li>使用引物设计软件或手动设计引物（例如 Lightscanner引物设计软件 - Biofire。用于高分辨率熔解曲线分析（HRMA）的PCR产物通常为50-200 bp；用于SNP检测的PCR产物应更小，通常为50-80 bp。</li>
	<li>PCR
	<ol>
		<li>在96孔或384孔板中进行PCR反应。</li>
		<li>使用10 μl总体积：4 μl LightScanner预混液（含0.1 U热启动Taq-AB聚合酶、缓冲液、0.2 mM dNTPs、2 mM氯化镁和1×荧光双链DNA结合染料）；各5 pmol引物，以及来自成体尾鳍的1 μl基因组DNA模板或来自胚胎尾部的3 μl基因组DNA13.</li>
		<li>用 30 μl 矿物油覆盖样品。</li>
		<li>用光学透明的粘性封膜覆盖平板。</li>
		<li>优化PCR扩增循环条件——典型条件为：95 °C预变性5 min，随后进行30个循环（95 °C变性10 sec，60 °C退火25 sec，72 °C延伸30 sec），最后在95 °C维持30 sec，然后冷却至15 °C。</li>
		<li>将PCR板保存在4 °C，或直接进行高分辨率熔解曲线分析（HRMA）。</li>
		<li>通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物大小，以确认PCR扩增结果，此步骤应在PCR初始优化过程中进行；必要时，还需对PCR产物进行测序验证。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 高分辨率熔解曲线分析（HRMA）
<ol>
	<li>加热板
	<ol>
		<li>将板放入熔解分析系统中。</li>
		<li>打开软件（LightScanner Software Call-IT 2.0）。</li>
		<li>将板从 60–95 °C 加热。</li>
		<li>创建新的数据存储文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析 HRMA 数据（图 2）。 
	可进行多个分析步骤。我们展示最常用的一组数据处理方法。
	<ol>
		<li>子集设置 
		单击“子集”选项卡。选择含有样品的孔。</li>
		<li>归一化
		<ol>
			<li>在左侧面板中选择归一化选项卡。为消除荧光差异，手动将平行双线分别置于熔解前（初始）和熔解后（最终）区域，如图所示（图 2C，箭头），并将所有样品的熔解前和熔解后荧光信号分别归一化为 1 和 014。</li>
			<li>调整双线位置，使熔解区域位于熔解前与熔解后双线之间但不被选中。通常，Lower Min 与 Lower Max（以及 Upper Min 与 Upper Max）温度线应相距约 1 °C。</li>
			<li>选择用于归一化的温度点，使所有样品在熔解前区域达到最大或完全（100%）荧光&#160;，在熔解后区域达到最小或无（0%）荧光（尽可能接近理想状态）。&#160;归一化后应呈现一条接近水平的线，在达到熔解点前保持在最大荧光值 1，之后从熔解点起保持在最小荧光值 0 的接近水平线；不应出现高于 1 或低于 0 的荧光水平。&#160;例如，在图 2C中，使用 79–80 °C 的温度范围对熔解前曲线进行归一化。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>分组/聚类 
		根据熔解温度区分基因型（图 2C，绿色框）。选择分组。
		<ol>
			<li>在分组部分的标准下拉列表中选择自动分组。</li>
			<li>在分组部分的灵敏度下拉列表中，针对具有单一转变或多个转变的熔解曲线分别选择正常或高。</li>
			<li>在分组部分点击计算分组。</li>
			<li>转至文件菜单并点击保存以保存结果。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kawakami, K., Takeda, H., Kawakami, N., Kobayashi, M., Matsuda, N., Mishina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li>
<li>Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev. Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li>
<li>Sander, J. D., Cade, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+disruption+in+somatic+zebrafish+cells+using+engineered+TALENs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs.</a> Nat. Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).</li>
<li>Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+gene+targeting+in+zebrafish+using+customized+TALENs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs.</a> Nat. Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).</li>
<li>Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+melting+analysis+%28HRMA%29%3A+more+than+just+sequence+variant+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mutation%22%5BJournal%5D)">High-resolution melting analysis (HRMA): more than just sequence variant screening.</a> Hum. Mutation. 30 (6), 860-866 (2009).</li>
<li>Dahlem, T. J., Hoshijima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+methods+for+generating+and+detecting+locus-specific+mutations+induced+with+TALENs+in+the+zebrafish+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome.</a> PLoS Genet. 8 (8), (2012).</li>
<li>Liew, M., Pryor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+of+single-nucleotide+polymorphisms+by+high-resolution+melting+of+small+amplicons%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons.</a> Clin. Chem. 50 (7), 1156-1164 (2004).</li>
<li>Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Bromley, L. K., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V+Amplicon+DNA+melting+analysis+for+mutation+scanning+and+genotyping%3A+cross-platform+comparison+of+instruments+and+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">V Amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping: cross-platform comparison of instruments and dyes.</a> Clin. Chem. 52 (3), 494-503 (2006).</li>
<li>Carrillo, J., Martínez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+melting+analysis+for+the+identification+of+novel+mutations+in+DKC1+and+TERT+genes+in+patients+with+dyskeratosis+congenita%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cell.+Mol.+Dis.%22%5BJournal%5D)">High resolution melting analysis for the identification of novel mutations in DKC1 and TERT genes in patients with dyskeratosis congenita.</a> Blood Cell. Mol. Dis.. 49 (3-4), 140-146 (2012).</li>
<li>Thomsen, N., Ali, R. G., Ahmed, J. N., Arkell, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+melt+analysis+%28HRMA%29%3B+a+viable+alternative+to+agarose+gel+electrophoresis+for+mouse+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High resolution melt analysis (HRMA); a viable alternative to agarose gel electrophoresis for mouse genotyping.</a> PloS one. 7 (9), (2012).</li>
<li>Vorkas, P. A., Poumpouridou, N., Agelaki, S., Kroupis, C., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIK3CA+hotspot+mutation+scanning+by+a+novel+and+highly+sensitive+high-resolution+small+amplicon+melting+analysis+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">PIK3CA hotspot mutation scanning by a novel and highly sensitive high-resolution small amplicon melting analysis method.</a> J. Mol. Diagn. 12 (5), 697-704 (2010).</li>
<li>Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+of+genotyping+zebrafish+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants.</a> Dev. Dyn. 238 (12), 3168-3174 (2009).</li>
<li>Xing, L., Hoshijima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+foxP2+zinc+finger+nuclease+mutant+has+normal+axon+pathfinding%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Zebrafish foxP2 zinc finger nuclease mutant has normal axon pathfinding.</a> PloS one. 7 (8), (2012).</li>
<li>Raghavendra, A., Siji, A., Sridhar, T. S., Phadke, K., Vasudevan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+High+Resolution+Melting+analysis+as+an+alternate+tool+to+screen+for+risk+alleles+associated+with+small+kidneys+in+Indian+newborns%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of High Resolution Melting analysis as an alternate tool to screen for risk alleles associated with small kidneys in Indian newborns.</a> BMC Nephrol. 12 (1), 60 (2011).</li>
<li>Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V+Expanded+instrument+comparison+of+amplicon+DNA+melting+analysis+for+mutation+scanning+and+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">V Expanded instrument comparison of amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping.</a> Clin. Chem. 53 (8), 1544-1548 (2007).</li>
<li>Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Genotyping+by+Amplicon+Melting+Analysis+Using+LCGreen%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Genotyping by Amplicon Melting Analysis Using LCGreen.</a> Clin. Chem. 49 (6), 853-860 (2003).</li>
<li>Dimitrakopoulos, L., Vorkas, P. A., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+closed-tube+methylation-sensitive+high+resolution+melting+assay+%28MS-HRMA%29+for+the+semi-quantitative+determination+of+CST6+promoter+methylation+in+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">A closed-tube methylation-sensitive high resolution melting assay (MS-HRMA) for the semi-quantitative determination of CST6 promoter methylation in clinical samples.</a> BMC Cancer. 12, 486-48 (2012).</li>
<li>Jeng, K., Gaydos, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+two+broad-range+PCR+assays+for+pathogen+detection+in+positive-blood-culture+bottles%3A+PCR-high-resolution+melting+analysis+versus+PCR-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of two broad-range PCR assays for pathogen detection in positive-blood-culture bottles: PCR-high-resolution melting analysis versus PCR-mass spectrometry.</a> J. Clin. Microbiol. 50 (10), 3287-3292 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

PCR 结合高分辨率熔解曲线分析（HRMA）是一种高效的斑马鱼基因分型技术。该方法具有快速、稳健以及高灵敏度等优点，甚至可检测到单个碱基突变。整个实验流程，从剪取鳍组织到完成熔解曲线分析，可由单人操作并在八小时内完成。此外，该技术适用于高通量筛选，无需使用溴化乙锭，且在所有 PCR 及分析步骤中均采用封闭体系，有助于最大限度减少污染问题。
该技术的关键步骤是PCR扩增子和引物的设计。在高分辨率熔解曲线分析（HRMA）中，PCR产物的典型长度为50-200 bp。较短的扩增子可提高检测灵敏度，非常适合检测单核苷酸变化。如果难以区分密切相关PCR产物的熔解曲线，可在PCR反应中加入一段与SNP互补且在3’端阻断的小寡核苷酸（Lunaprobes；探针）。这些探针通过不对称PCR生成，使用不同浓度的正向和反向引物，并在3’端添加C3阻断剂，以防止探针在后续HRMA PCR中延伸。然后将该探针加入HRMA PCR反应中。&#160;随后在探针存在下进行HRMA，此时不对称探针与PCR产物结合，形成具有不同熔解曲线的探针-靶标双链体，从而可用于区分等位基因。
<p class="jo...

斑马鱼（Danio rerio）是一种广泛用于发育研究和疾病建模的脊椎动物模型系统。近年来，已开发出多种针对斑马鱼的转基因和突变技术。&#160;快速转基因技术通常基于Tol2转座子系统1，并结合了多种DNA片段组装的改进型克隆方法2。锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）已被用于靶向斑马鱼体细胞和生殖细胞中的特定基因位点3,4。这些技术能够高效地产生基因修饰动物，实现高频突变生成和生殖系传递3,4。
尽管取得了这些进展，传统的斑马鱼基因分型技术仍限制了诱变和转基因工具的充分发挥。&#160;聚合酶链式反应（PCR）结合凝胶电泳是检测基因组修饰的常用方法，有时还需联合限制性内切酶消化，但该方法耗时较长，且对小片段插入或缺失的检测灵敏度较低。TaqMan探针检测法初始成本较高，且需要精细的优化。PCR产物测序可能需要数天时间，不适合大规模筛选。&#160;限制性片段长度多态性（RFLP）分析仅能区分影响有限数量限制性内切酶识别位点的单核苷酸多态性（SNP）。

高分辨率熔解分析（HRMA）是一种封闭管式PCR后分析方法，是近年来发展起来的一种快速、灵敏、成本低廉且适用于大规模样本筛查的技术。&#160;HRMA可用于检测单核苷酸多态性（SNPs）、突变和转基因序列5-7。该技术基于双链DNA的热变性原理，每个PCR扩增产物都具有独特的解链（熔解）特征5。由于不同样本的核苷酸组成、GC含量或长度存在差异，通常结合使用仅与双链DNA结合的荧光染料，即可实现样本间的区分8。因此，HRMA可根据不同的熔解曲线特征来区分不同基因型。由于HRMA使用低成本试剂，并且为一步式PCR后处理流程，因此适用于高通量分析策略。&#160;HRMA具有非破坏性特点，分析完成后PCR扩增产物仍可用于其他后续应用。&#160;HRMA已广泛应用于多种生物体和系统中，包括细胞系、小鼠和人类9-11。近年来，该技术也被用于斑马鱼中，以检测由锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）诱导的突变6,12,13。

本文介绍了如何在胚胎期和成年斑马鱼中进行基于 PCR 的高分辨率熔解曲线分析（HRMA）（图1）。该实验方案适用于检测单核苷酸多态性（SNPs）、转基因序列以及突变，包括单碱基对的替换、插入或缺失。

<table><tbody><tr><td>100次反应 LightScanner 预混液</td><td>BioFire</td><td>HRLS-ASY-0002</td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>硬壳PCR 96孔黑白板</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>HSP9665</td><td>www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>Microseal 'B' 压敏封膜</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>MSB1001</td><td>www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>96孔 LightScanner 仪器</td><td>BioFire</td><td>LSCN-ASY-0040</td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>含 Call-IT 2.0 的 LightScanner 软件</td><td>BioFire</td><td></td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>高分辨率熔解曲线分析 2.0</td><td>BioFire</td><td></td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>LightScanner 引物设计软件</td><td>BioFire</td><td></td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>Vector NTI 软件</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>www.invitrogen.com</td></tr><tr><td>三卡因</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用高分辨率熔解分析结合pcr进行斑马鱼快速高效基因分型

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

斑马鱼是研究发育、疾病建模和药物筛选的强有力脊椎动物模型系统。近年来已引入多种遗传工具，包括多种诱导突变和建立转基因品系的策略。然而，大规模筛选受到传统基因分型方法的限制，这些方法耗时且劳动密集。本文介绍一种通过PCR结合高分辨率熔解分析（HRMA）来分析斑马鱼基因型的技术。&#160;该方法快速、灵敏、成本低廉，且污染风险较低。&#160;通过PCR结合HRMA进行基因分型可用于胚胎或成年鱼，适用于高通量筛选方案。

该实验方案可在一天内完成，也可分步在数天内进行（工作流程图见图1）。DNA提取后，进行PCR扩增产物的熔解与分析。扩增产物的熔解温度取决于其大小和GC含量，但起始和终止温度通常设置为50 °C和95 °C较为合适（图2A和图2B）。完成熔解后，对荧光熔解曲线的分析通常需要使用熔解前和熔解后区域作为标准，对不同样本曲线间的荧光差异进行归一化处理（图2C），以提高来自不同样本结果之间的可比性，这些样本的荧光差异可能源于微小的实验波动。用于归一化的每对温度线应相距约1 °C（图2C，箭头所示）。数据结果的分组以两种方式呈现：上方的图表显示熔解曲线轮廓，下方的图表则显示相对于参考样本的减法差值图（图2D）。
高分辨率熔解曲线分析（HRMA）可用于检测突变（图3A和3B）或转基因（图3C）。...

聚合酶链式反应（PCR）结合高分辨率熔解分析（HRMA）被证明是一种快速高效鉴定斑马鱼基因型的方法。

利用高分辨率熔解分析结合PCR进行斑马鱼快速高效基因分型

斑马鱼是研究发育、疾病建模和药物筛选的强有力脊椎动物模型系统。近年来，多种遗传学……

本实验的总体目标是快速筛选斑马鱼中的不同基因型、突变或转基因。首先从少量组织中提取DNA，然后通过PCR扩增目标DNA片段。接下来，对PCR扩增产物进行变性，同时记录熔解曲线，并利用软件对曲线结果进行分析。最终，结果显示不同基因型具有可区分的熔解曲线。与现有的凝胶电泳体积PCR等方法相比，该技术的主要优势在于能够灵敏地检测单核苷酸变化、小片段插入及所有类型的缺失，且该技术快速可靠。尽管该技术可用于快速、有效地对斑马鱼进行基因分型，但它也可应用于其他系统和模式生物，包括细胞系、小鼠及其他动物。在进行DNA提取的当天，将新鲜的蛋白酶K以每毫升1毫克的浓度加入裂解缓冲液中。组织样本可从成年鱼身上用细小的剪取工具采集，也可从胚胎鱼中获取。首先将鱼置于Trica溶液中进行麻醉。等待鳃部运动变慢后，将鱼放在一叠纸巾上，用无菌剃刀片切下尾鳍约两到三毫米长的一小段。迅速将鱼放入贴有标签并盛有新鲜水的水族箱中，使其恢复。用无菌的移液器吸头夹取鳍条组织，转移至含有100 µL DNA裂解缓冲液的离心管中。务必标记动物所在的水箱及离心管，将所有采集的组织在55 °C下孵育至少4小时，最长可过夜。孵育结束后，将离心管在95 °C加热15分钟，以灭活蛋白酶K。这些样品应立即用于PCR，但也可在零下20摄氏度保存长达三个月。每个反应在96孔或384孔板中进行PCR。将不超过1 µL的成年个体DNA与4 µL的light scanner混合。反应体系中包含荧光探针以及引物，终浓度均为五皮摩尔。若DNA来源于胚胎，则使用最多三微升。用三十微升矿物油覆盖反应液，然后盖紧管盖。接下来，用光学透明的粘性封膜覆盖已加样的 PCR 板。现在优化 PCR 循环条件。典型的条件设置以 5 分钟的变性时间开始。随后进行30个PCR循环，包括10秒的变性、25秒的退火时间和30秒的延伸。反应最后应增加一个第32个变性步骤，然后冷却至15摄氏度。通过将PCR板放入软件中的熔解分析系统来分析PCR结果。设置温度并创建新的数据存储文件。设置子集。在屏幕左下角选择含有样品的孔。选择归一化标签以消除荧光变异。手动将平行双线置于预熔解、熔解和熔解后区域，并将所有样本的预熔解和熔解后荧光信号分别归一化为1和0。接下来，首先选择分组，然后根据各样本的熔解温度区分其基因型。然后从标准选择列表中选择自动分组。在分组部分，针对具有单一转变或多个转变的熔解曲线，分别在分组部分的灵敏度选择列表中选择“正常”或“高”。现在，在分组部分选择计算组，然后进入文件菜单并点击保存以保存结果。该实验方案可在一天内完成，也可分步骤在数天内完成。进行PCR时，扩增片段的熔解温度取决于其大小和GC含量，但通常熔解过程的起始温度和终止温度分别设为60摄氏度和95摄氏度较为合适。对荧光熔解曲线的分析通常需要使用熔解前和熔解后区域作为标准，对不同样本曲线的差异进行归一化处理。这有助于改进来自不同样本结果之间的比较，其中荧光的变化与微小的实验差异相关。每一对用于归一化的温度线应相距约1摄氏度。数据可以通过两种方式呈现：一种是显示熔解曲线图谱文件的图表，另一种是高分辨率熔解分析（HRMA）后与参考样本相比的减法差值图。通过这些图表可检测突变或转基因。EIF2B5基因中的两种不同突变分别由红色和蓝色曲线标示。这些突变样本与其熔解曲线形状的显著差异或相较于标准野生型曲线的荧光变化而被识别。这一包含四种不同基因型的胚胎样本示例展示了该方法的强大功能与高灵敏度。熟练掌握后，该技术可在八小时之内完成。观看本视频后，您应能够充分理解如何开展高分辨率熔解曲线分析（HRMA），以高效地对斑马鱼基因型进行大规模筛选。

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科研

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生物学

快速，高效的斑马鱼基因分型采用PCR与高分辨率熔体分析

本文介绍了从斑马鱼尾鳍组织中提取DNA的方法。该方案展示了一种快速且高效的斑马鱼基因型分析技术。...

从尾鳍组织提取DNA：斑马鱼基因分型中常用的方法

在本视频中，我们介绍一种高分辨率熔解曲线PCR技术，该技术基于熔解温度分析，用于确定不同序列长度的DNA片段的长度多态性。...

高分辨率熔解PCR检测突变DNA序列中的序列变异

尽管高分辨率熔解分析能够区分异质群体中的单核苷酸多态性，但突变等位基因的扩增偏好性可增强其检测样本中相对低比例等位基因的能力。本方案描述了提高高分辨率熔解分析灵敏度的改进方法。...

提高疟疾高分辨率熔解单核苷酸多态性分型灵敏度的方法

本文所述的基因分型技术将荧光聚合酶链式反应（PCR）与毛细管凝胶电泳相结合，可实现对核酸酶介导的基因敲除克隆进行高通量基因分型。该方法克服了其他基因分型技术所面临的局限性，且比测序方法更具成本效益。...

使用荧光PCR-毛细管凝胶电泳技术高通量基因分型CRISPR/Cas9介导的敲除突变体

高效构建与鉴定模式生物Danio rerio中CRISPR/Cas9介导的基因敲除

使用斑马鱼进行DNA复制时间分析 在体 内 模型系统

斑马鱼已被广泛用作生物医学研究中可靠的遗传学模式生物，尤其是在基因编辑技术出现之后。当预期出现幼体表型时，DNA 提取和基因型鉴定可能具有挑战性。本文介绍了一种高效的斑马鱼幼体基因分型方法，可在受精后 72...

高通量DNA提取与基于鳍剪法的3日龄斑马鱼幼鱼基因分型

基因编辑技术使研究人员能够相对容易地构建斑马鱼突变体，以研究基因功能。本文提供了一种在斑马鱼中并行进行胚胎基因分型和原位杂交信号定量分析的方法指南。这种无偏倚的方法可提高基于原位杂交的表型分析的准确性。...

斑马鱼原位杂交染色的基因分型与定量分析

骨骼肌再生由组织驻留的肌肉干细胞驱动，这些细胞在多种肌肉疾病（如肌营养不良症）中功能受损，导致肌肉无法再生。本文介绍了一种可在斑马鱼肌肉疾病模型中研究肌肉再生的实验方案。...

研究肌肉疾病斑马鱼模型中的肌肉再生

CRISPR-Cas 技术已彻底改变了基因组编辑领域。然而，发现并分离出理想的种系编辑仍是一个主要瓶颈。因此，本实验方案描述了一种可靠的方法，利用标准的 PCR、限制性酶切和凝胶电泳技术，快速筛选经 CRISPR 注射的 F0...

斑马鱼生殖系编辑的精子筛选快速分离方法

在此，我们介绍一种在斑马鱼幼鱼中用荧光蛋白标签标记蛋白质的实验方案，该方案为新近开发并经过改进的方法 体内...

荧光标记法用于可视化斑马鱼中低表达蛋白

学习使用PCR结合高分辨率熔解曲线分析（HRMA）对斑马鱼进行快速基因分型。该方法灵敏度高，可检测单核苷酸变异和小片段插入缺失，适用于大规模遗传筛选。

利用高分辨率熔解分析结合PCR进行斑马鱼快速高效基因分型

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