快速，高效的斑马鱼基因分型采用PCR与高分辨率熔体分析

该程序的总体目标是快速筛选斑马鱼中的不同基因型、突变或转基因。这是通过首先从薄片段中提取 DNA，然后通过 PCR 扩增 DNA 来实现的。下一步是使 PCR 扩增子变性，同时记录熔解曲线，然后通过软件进行分析。

最终，结果显示了不同基因型的可区分熔解曲线。与现有方法（如凝胶电泳体积 PCR）相比，该技术的主要优点是对单核苷酸变化、小插入、所有缺失敏感，并且该技术快速可靠。虽然这项技术可用于快速、有效地对斑马鱼进行基因分型，但它也可以应用于其他系统和模式生物，包括细胞系、小鼠和其他动物。

在 DNA 制备当天，将新鲜蛋白酶 K 以 1 毫克/毫升的浓度添加到裂解缓冲液中。可以使用薄夹从成年鱼或胚胎鱼中收集组织。首先在 Trica 溶液中麻醉鱼。

等到鳃运动减慢。然后将鱼放在一叠纸巾上，用无菌剃须刀片切下一小块长约 2 到 3 毫米的尾鳍。快速将鱼放入有淡水的贴有标签的水箱中进行回收。

用无菌移液器吸头拿起鳍夹，并将其转移到装有 100 微升 DNA 裂解缓冲液的试管中。请务必标记动物的水箱和试管，将所有收集的组织孵育至少四个小时，并在孵育后在 55 摄氏度下过夜。通过在 95 摄氏度下加热试管 15 分钟来灭活蛋白质 ACE K。

这些样品应立即用于 PCR，但也可在零下 20 摄氏度下储存长达三个月。在 96 或 384 孔板中对每个反应进行 PCR。将不超过 1 μL 的成体 DNA 与 4 μL 的光扫描仪混合。

包含荧光探针和引物的主混合物，终浓度各为 5 皮摩尔。如果 DNA 来自胚胎，则最多使用 3 微升。用 30 微升矿物油覆盖反应物，然后盖上盖子。

接下来，用光学透明的粘性密封件覆盖加载的 PCR 板。现在优化 PCR 循环条件。典型的条件集从 5 分钟的熔化时间开始。

接下来是 30 个 PCR 循环，熔解 10 秒，跪姿 25 秒，伸长 30 秒。反应应以添加第 32 次熔体结束，然后冷却至 15 摄氏度。通过将 PCR 板放入软件中的熔解分析系统中来分析 PCR 板。

设置温度并创建新的数据存储文件。设置子集。选择屏幕左下角带有样品的孔。

选择标准化选项卡以消除荧光变体。在 prem、melt 和 post-melt 区域手动定位平行双线，并将所有样品的 premel 和 post-melt 荧光信号分别归一化为 1 和 0。接下来，首先选择分组，根据它们的熔解温度来区分基因型。

然后从标准选择列表中选择 auto group。在分组部分下，分别为具有单个过渡或多个过渡的熔融曲线选择 normal（正常）或 High（高）。它们位于分组部分下的敏感度选择列表中。

现在，在分组部分下选择计算组，然后转到文件菜单并单击 Save 以保存结果。该方案可以在一天内进行，也可以在几天内分阶段进行。进行 PCR 时，扩增子熔解的温度取决于大小和 GC 含量，但通常熔解后 60 摄氏度和 95 摄氏度的开始和结束温度是合适的。

荧光熔解曲线的分析通常需要使用熔解前和熔解后区域作为标准，对不同样品曲线的变化进行归一化。这改善了不同样品结果的比较，其中荧光变化与微小的实验变化有关。每对用于归一化的温度线应相距约 1 摄氏度。

数据可以通过两种方式表示，即显示熔解曲线剖面文件的图表，或者通过显示 HRMA 分析突变或转基因后与参考样品相比的减法差异图的图表。EIF two B five 基因中的两种不同突变由红色和蓝色曲线表示。与标准野生型曲线相比，这些突变样品的熔解曲线、形状或荧光变化的显著差异来识别。

这个在单个胚胎集合中具有四种不同基因型的示例说明了该方法的强大功能和灵敏度。一旦掌握，这项技术可以在不到 8 小时内完成。观看本视频后，您应该对如何执行 HRMA 以高效、大规模地筛查斑马鱼基因型有一个很好的了解。