利用高分辨率熔解分析结合PCR进行斑马鱼快速高效基因分型

本实验的总体目标是快速筛选斑马鱼中的不同基因型、突变或转基因。首先从少量组织中提取DNA，然后通过PCR扩增目标DNA片段。接下来，对PCR扩增产物进行变性，同时记录熔解曲线，并利用软件对曲线结果进行分析。

最终，结果显示不同基因型具有可区分的熔解曲线。与现有的凝胶电泳体积PCR等方法相比，该技术的主要优势在于能够灵敏地检测单核苷酸变化、小片段插入及所有类型的缺失，且该技术快速可靠。尽管该技术可用于快速、有效地对斑马鱼进行基因分型，但它也可应用于其他系统和模式生物，包括细胞系、小鼠及其他动物。

在进行DNA提取的当天，将新鲜的蛋白酶K以每毫升1毫克的浓度加入裂解缓冲液中。组织样本可从成年鱼身上用细小的剪取工具采集，也可从胚胎鱼中获取。首先将鱼置于Trica溶液中进行麻醉。

等待鳃部运动变慢后，将鱼放在一叠纸巾上，用无菌剃刀片切下尾鳍约两到三毫米长的一小段。迅速将鱼放入贴有标签并盛有新鲜水的水族箱中，使其恢复。

用无菌的移液器吸头夹取鳍条组织，转移至含有100 µL DNA裂解缓冲液的离心管中。务必标记动物所在的水箱及离心管，将所有采集的组织在55 °C下孵育至少4小时，最长可过夜。孵育结束后，将离心管在95 °C加热15分钟，以灭活蛋白酶K。

这些样品应立即用于PCR，但也可在零下20摄氏度保存长达三个月。每个反应在96孔或384孔板中进行PCR。将不超过1 µL的成年个体DNA与4 µL的light scanner混合。

反应体系中包含荧光探针以及引物，终浓度均为五皮摩尔。若DNA来源于胚胎，则使用最多三微升。用三十微升矿物油覆盖反应液，然后盖紧管盖。

接下来，用光学透明的粘性封膜覆盖已加样的 PCR 板。现在优化 PCR 循环条件。典型的条件设置以 5 分钟的变性时间开始。

随后进行30个PCR循环，包括10秒的变性、25秒的退火时间和30秒的延伸。反应最后应增加一个第32个变性步骤，然后冷却至15摄氏度。通过将PCR板放入软件中的熔解分析系统来分析PCR结果。

设置温度并创建新的数据存储文件。设置子集。在屏幕左下角选择含有样品的孔。

选择归一化标签以消除荧光变异。手动将平行双线置于预熔解、熔解和熔解后区域，并将所有样本的预熔解和熔解后荧光信号分别归一化为1和0。接下来，首先选择分组，然后根据各样本的熔解温度区分其基因型。

然后从标准选择列表中选择自动分组。在分组部分，针对具有单一转变或多个转变的熔解曲线，分别在分组部分的灵敏度选择列表中选择“正常”或“高”。

现在，在分组部分选择计算组，然后进入文件菜单并点击保存以保存结果。该实验方案可在一天内完成，也可分步骤在数天内完成。进行PCR时，扩增片段的熔解温度取决于其大小和GC含量，但通常熔解过程的起始温度和终止温度分别设为60摄氏度和95摄氏度较为合适。

对荧光熔解曲线的分析通常需要使用熔解前和熔解后区域作为标准，对不同样本曲线的差异进行归一化处理。这有助于改进来自不同样本结果之间的比较，其中荧光的变化与微小的实验差异相关。每一对用于归一化的温度线应相距约1摄氏度。

数据可以通过两种方式呈现：一种是显示熔解曲线图谱文件的图表，另一种是高分辨率熔解分析（HRMA）后与参考样本相比的减法差值图。通过这些图表可检测突变或转基因。EIF2B5基因中的两种不同突变分别由红色和蓝色曲线标示。这些突变样本与其熔解曲线形状的显著差异或相较于标准野生型曲线的荧光变化而被识别。

这一包含四种不同基因型的胚胎样本示例展示了该方法的强大功能与高灵敏度。熟练掌握后，该技术可在八小时之内完成。观看本视频后，您应能够充分理解如何开展高分辨率熔解曲线分析（HRMA），以高效地对斑马鱼基因型进行大规模筛选。