Name: 生物活性，PCL为基础的自我装配形状记忆聚合物支架的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: 学习制备基于PCL的形状记忆聚合物支架的方法，该支架采用熔融盐模板和聚多巴胺涂层技术，可实现自我装配并促进骨整合，适用于颅颌面缺损修复。

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作者感谢德克萨斯农工大学&amp;#38;M大学工程与实验站（TEES）对本研究提供的经费支持。Lindsay Nail 感谢德克萨斯农工大学&amp;#38;M大学路易斯·斯托克斯少数族裔参与联盟（LSAMP）以及美国国家科学基金会（NSF）研究生研究奖学金计划（GRFP）。Dawei Zhang感谢德克萨斯A&amp;#38;M大学博士论文奖学金

1. 合成PCL-DA大分子单体
<ol>
	<li>进行丙烯酰化反应。
	<ol>
		<li>称取20 g PCL-diol（Mn = ~10,000 g/mol）加入至 250 ml&#160;配备聚四氟乙烯包覆磁力搅拌子的圆底烧瓶</li>
		<li>将PCL-二醇溶解于二氯甲烷中。
		<ol>
			<li>向烧瓶中加入120 mL二氯甲烷（DCM）（浓度 = 0.17 g/mL）。</li>
			<li>将橡胶隔垫松松地放入烧瓶口，以避免压力积聚，同时防止二氯甲烷蒸发。</li>
			<li>搅拌溶液约 30 分钟&#160;以约 250 rpm 的转速搅拌，直至聚合物完全溶解。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>加入约 6.6 mg 的 4-二甲氨基吡啶（DMAP），搅拌至溶解。</li>
		<li>将橡胶隔垫牢固地塞入烧瓶口。让溶液继续搅拌。</li>
		<li>通过橡胶隔垫，用 N₂ 轻柔地吹洗烧瓶2 约 3 分钟&#160;通过使用阳性N2 压力针入口和开放针出口。</li>
		<li>去除 N2 进口和出口</li>
		<li>加入 0.56 ml&#160;（4.0 mmol）三乙胺（Et3N）通过插入橡胶隔垫的针头，用玻璃注射器逐滴加入。</li>
		<li>加入 0.65 ml&#160;通过插在橡胶隔膜中的针头，用带针头的玻璃注射器逐滴加入8.0 mmol丙烯酰氯。</li>
		<li>返回 N2 烧瓶入口处通入氮气，并让内容物在正压氮气环境下搅拌2 压力持续约30分钟。</li>
		<li>将油浴预热至 55 ºC。</li>
		<li>在指定的约 30 分钟后，移除 N2 入口处更换隔垫并连接冷凝管。</li>
		<li>将烧瓶浸入预热的油浴中。</li>
		<li>让烧瓶中的内容物搅拌20小时。</li>
		<li>20小时后，将烧瓶从油浴中取出，让内容物冷却至室温。</li>
		<li>使用旋转蒸发仪从烧瓶中除去二氯甲烷溶剂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>纯化粗产物PCL-DA。
	<ol>
		<li>向烧瓶中加入约 135 ml&#160;乙酸乙酯中溶解粗产物PCL-DA。</li>
		<li>通过滤纸将溶液重力过滤至洁净的 250 ml 容器中&#160;圆底烧瓶。（注意：溶液可能在滤纸上变稠，不易通过。若出现此情况，可小心使用加热枪轻微加热。）</li>
		<li>使用旋转蒸发仪从烧瓶中除去乙酸乙酯溶剂。</li>
		<li>向烧瓶中加入约 140 ml&#160;将DCM加入粗产物PCL-DA中并使其溶解。</li>
		<li>将内容转移至 500 ml&#160;分液漏斗</li>
		<li>向漏斗中加入 13.5 ml&#160;2 M 碳酸钾（K2CO3).</li>
		<li>盖上漏斗塞。将漏斗倒置，轻轻旋转一至两次，使两相充分混合，注意通过活塞释放压力。重复操作3次。</li>
		<li>用一层Parafilm封口，静置过夜（约12小时）使混合物分层。</li>
		<li>收集底部的有机相至250 ml&#160;锥形瓶</li>
		<li>加入约 5 g 无水硫酸镁（MgSO₄）4) 加入烧瓶并轻轻摇动。</li>
		<li>通过定性滤纸将混合物重力过滤至洁净的 250 ml 容器中&#160;圆底烧瓶</li>
		<li>使用旋转蒸发仪从烧瓶中除去二氯甲烷溶剂。</li>
		<li>在高真空下干燥以除去残留的二氯甲烷。（注意：PCL-DA 应避光保存。）</li>
		<li>通过以下方法确认丙烯酰化： 1H NMR22,23.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 准备SMP支架（图1）
<ol>
	<li>制备熔融盐模板。
	<ol>
		<li>使用425 µm筛网筛选氯化钠（NaCl），获得直径约为460 ± 70 µm的颗粒。（注：平均粒径可通过ImageJ软件分析扫描电子显微镜[SEM]图像确认。）14</li>
		<li>向一个3 ml&#160;玻璃小瓶（内径 = 12.9 mm）中加入1.8 g预先筛分好的NaCl。</li>
		<li>将去离子水（DI水）分四次缓慢加入小瓶中，每次加入量为盐质量的7.5 wt%（共0.146 g）。每次加水后均用金属刮刀充分混合。</li>
		<li>盖上瓶盖，用纸巾包裹后垂直放入离心管中，在3,220 × g条件下离心15 min&#160;。</li>
		<li>打开瓶盖，室温下过夜干燥（约12小时）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在新的玻璃小瓶中，将每毫升&#160;二氯甲烷（DCM）中加入0.15 g PCL-DA，配制“大分子单体溶液”。（注：制备一个支架约需1 ml&#160;溶液。）盖上瓶盖，在涡旋振荡器上高速混合约1分钟。</li>
	<li>在另一个3 ml&#160;玻璃小瓶中，配制“光引发剂溶液”，组成为10 wt%的2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮（DMP）溶于1-乙烯基-2-吡咯烷酮（NVP）中。将0.115 g DMP溶于1 ml&#160;NVP中。（注：每个支架约需180 µl。）盖上瓶盖，用铝箔包裹（避光），在涡旋振荡器上高速混合约1分钟。（注：若提前配制，应冷藏并避光保存。）</li>
	<li>将装有大分子单体溶液的小瓶（不包括瓶盖）用铝箔包裹（避光），用移液枪加入光引发剂溶液，添加量为大分子单体溶液总体积的15 vol%。盖上瓶盖，在涡旋振荡器上高速混合约1分钟。</li>
	<li>将装有熔融盐模板的小瓶（不包括瓶盖）用铝箔包裹（避光），用移液枪加入先前配制的大分子单体/光引发剂混合溶液（约0.6 ml&#160;，或直至完全覆盖模板）。</li>
	<li>盖上瓶盖，用纸巾包裹后垂直放入离心管中，在1,260 × g条件下离心10 min&#160;，使大分子单体溶液充分渗透整个模板。</li>
	<li>移除铝箔，打开瓶盖，置于365 nm、25 W的紫外光下照射3分钟，随后过夜干燥。</li>
	<li>用镊子从玻璃小瓶中取出“含盐支架”，可先在瓶口划痕并敲碎瓶顶以便取出。</li>
	<li>在400 ml&#160;烧杯中，配制约200 ml&#160;水/乙醇溶剂（体积比1:1）。</li>
	<li>将支架完全浸没于水/乙醇溶剂中，持续4天，每天更换新鲜溶剂。</li>
	<li>从溶剂中取出支架，过夜干燥。</li>
</ol>
3. 对SMP支架应用聚多巴胺涂层（图1）
<ol>
	<li>在装有聚四氟乙烯包裹搅拌子的 400 ml&#160;烧杯中，配制约 200 ml&#160;盐酸多巴胺溶液（2 mg/ml&#160;，溶于 10 mM Tris 缓冲液，pH = 8.5，25 ºC）。以约 150 rpm 的速度搅拌。</li>
	<li>将一次性针头（长度 = 40 mm；规格 = 20）插入支架中，深度约为支架的一半。将一根导线缠绕在针座上。</li>
	<li>通过将导线固定在烧杯边缘，使支架浸入搅拌中的多巴胺溶液中（针座位于液面以上）。</li>
	<li>将注射器插入针座，抽出支架中的空气，以对支架进行脱气处理。（注意：当无法再抽出空气且溶液已完全浸润支架时，脱气完成。）</li>
	<li>将支架保持浸没在搅拌的多巴胺溶液中 16 小时。</li>
	<li>从溶液中取出支架，并移除针头。用去离子水冲洗，并在室温下的真空烘箱中干燥 24 小时。</li>
	<li>将支架置于 85 ºC 烘箱中加热 1 小时。</li>
	<li>让支架冷却至室温。最终的圆柱形支架尺寸约为 6 mm 直径 × 5 mm 高度。</li>
</ol>
4. 评估“自适配”行为
<ol>
	<li>使用厚度约为 5 mm 的硬质塑料片制备“不规则 CMF 缺损模型”。用钻头在塑料片上钻出一个空腔，其平均直径略小于约 6 mm，如图 2A所示。</li>
	<li>在烧杯中将去离子水（代表临床上使用的生理盐水）加热至约 60 ºC 的温度。</li>
	<li>将支架放入约 60 ºC 的水中。使用镊子将支架压入水面以下，使所有区域均暴露于水中。持续约 2 分钟，或直至支架明显软化（图 2B）。</li>
	<li>从烧杯中取出支架，并立即用手将其压入缺损模型中。</li>
	<li>使其冷却至室温（约 5–10 分钟）（图 2C）。</li>
	<li>从缺损模型中取出支架，观察其形成的新固定临时形状以及恢复相对更刚性的状态（图 2D）。</li>
</ol>
5. 测试形状记忆行为
<ol>
	<li>使用动态机械分析仪（DMA； 例如 使用TA Instruments Q800（如本文所述），对支架材料进行两循环（N）应变控制的循环热机械压缩测试，以测定其形状固定率（R）f）和形状恢复（Rr) (图3).
	<ol>
		<li>平衡至 60 °C（T高5 分钟</li>
		<li>压缩至最大应变（εm = 50% 时以 50%/分钟的速率</li>
		<li>保持在 εm （5 分钟）。</li>
		<li>冷却至 25 °C（T低）并保持10分钟以固定临时形状。</li>
		<li>移除载荷。</li>
		<li>在无应力状态下测量极限应变（εu).</li>
		<li>重新加热至 60 °C（T高）并保持10分钟，以恢复其永久形状。</li>
		<li>测量回收的应变（εp).</li>
		<li>尽管仍处于 60 °C（T高），开始第2个nd 循环（N = 2）通过将支架压缩至第1次循环后恢复高度的50%st 循环（N = 1）。</li>
		<li>重复步骤 5.1.3–5.1.8，共进行 2 次。</li>
		<li>计算 Rf 和 Rr 当 N = 1 和 2 时，使用以下公式： 
		Rf(N) = [εu(N)/ εm]Rr(N) = [εm - εp(N)]/[εm- εp(N-1)]</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 观察孔径大小与孔隙连通性
<ol>
	<li>使用扫描电子显微镜（SEM； 例如 使用FEI Quanta扫描电镜（SEM）观察孔径大小及孔隙连通性。
	<ol>
		<li>使用镊子夹住SMP支架，浸入液氮中2 1 分钟。</li>
		<li>从液氮中取出2 用干净的剃刀刀片沿支架中部切开并使其断裂。</li>
		<li>使用碳导电胶带将形状记忆聚合物支架的一半固定在样品台上，使断裂面朝上。</li>
		<li>溅射镀金-铂（约4 nm）。</li>
		<li>在推荐的10–15 kV加速电压下采集扫描电镜图像（ 图 4A).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 测试 体外 生物活性
<ol>
	<li>取一个50 ml&#160;离心管，加入约30 ml&#160;的1X SBF24。</li>
	<li>取一个处于原始圆柱形永久形状的支架，使用洁净刀片沿圆形边缘将其切成两半。</li>
	<li>将其中一半支架放入已准备好的离心管中，并盖上管盖。</li>
	<li>将离心管置于37 °C水浴中，在静态条件下孵育，期间不更换SBF溶液。</li>
	<li>14天后，从SBF溶液中取出支架，在空气中干燥24小时。</li>
	<li>使用导电碳胶带将支架固定在样品台上，使断裂面朝上。</li>
	<li>用Au-Pt进行溅射镀膜（厚度约4 nm）。</li>
	<li>在推荐的10–15 kV加速电压下采集SEM图像（图4B）。</li>
</ol>

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<li>Lendlein, A., Schmidt, A. M., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AB-polymer+networks+based+on+oligo%28%C9%9B-caprolactone%29+segments+showing+shape-memory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">AB-polymer networks based on oligo(ɛ-caprolactone) segments showing shape-memory properties.</a> Proc Natl Acad Sci. 98, 842-847 (2001).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了一种聚多巴胺包覆的聚己内酯（PCL）基支架的制备方法，该支架具有自适配性以及成骨诱导性和生物活性，因此在不规则颅颌面骨缺损的治疗中具有应用前景。本方案中的部分步骤可根据需要进行调整，以改变支架的多种特性。
该方案首先对PCL二醇进行丙烯酸酯化处理，以实现紫外光固化。在所报道的示例中，所用PCL二醇的分子量为n 约为 10,000 g/mol。然而，通过适当调整丙烯酰氯和 Et 的用量3N 在 PCL-DA 合成过程中使用，PCL-DA 是一种具有较高或较低 M 的 PCL 二醇n 可用于分别降低或增加交联密度。
融合盐模板是本实验方案中的一个重要组成部分（图1）。盐颗粒的平均尺寸决定了最终支架的孔径大小。在本示例中，盐的平均粒径为 ~460 ± 70 µm。虽然可以使用更小粒径的盐，但需注意，支架在最终热处理步骤中会发生收缩，从而导致孔径减小。通过筛分盐颗粒可减小盐粒径分布范围，进而降低孔径分布范围。为了制备具有高度...

目前被认为是颅颌面（CMF）骨缺损治疗的金标准，自体移植骨的移植受到复杂移植操作、供区并发症以及材料来源有限的限制1。其中一个特别困难的问题是，如何将坚硬的自体移植物精确塑形并牢固固定于缺损部位，以实现骨整合并防止移植物被吸收。组织工程已被研究作为自体移植和合成骨替代材料（例如骨水泥）的一种替代策略2,3。组织工程方法成功的关键在于支架材料需具备一系列特定性能。首先，为实现骨整合，支架必须与邻近骨组织形成紧密接触4。支架还应具备骨传导性，允许细胞迁移、营养物质扩散以及新生组织沉积4,5。这一特性通常通过具有高度相互连通孔隙结构的可生物降解支架来实现。最后，支架应具备生物活性，以促进与周围骨组织的整合和结合5。
在此，我们介绍一种具有上述特性的组织工程支架制备方案。重要的是，由于该支架具有形状记忆特性，能够“自行贴合”不规则的颅颌面缺损。6热响应性形状记忆聚合物（SMPs）在受热时会发生形状变化7,8.SMPs 由“网络点”（netpoints）组成（即 化学或物理交联点）以决定其永久形状，以及“开关链段”，用于维持临时形状并恢复永久形状。这些开关链段具有一个热转变温度（T转）对应于玻璃化转变（Tg）或熔融转变（Tm聚合物）的。因此，SMPs 可在温度 T 下依次变形为临时形状 &#62; T转，在临时形状下于 T 固定 &#60; T转，并在温度 T 下恢复至永久形状 &#62; T转因此，SMP支架可通过以下方式在颅颌面缺损中实现“自适应贴合”6. 经温盐水（T &#62; T转），SMP支架将变得可塑，允许预先制备的圆柱形支架被手动按压至不规则缺损处，并通过形状恢复促进支架扩张至缺损边界。冷却后（T &#60; T转），支架将恢复到相对更刚性的状态，形状固定性使其在缺损内保持新的临时形状。在本方案中，形状记忆聚合物（SMP）支架由聚己内酯（PCL）制备而成，PCL 是一种可生物降解的聚合物，已在组织再生及其他生物医学应用中得到广泛研究。9-11对于形状记忆，Tm PCL 的作用是作为 T转 并且根据PCL的分子量不同，其范围在43至60 °C之间变化12在此方案中，T转 (即 Tm支架的温度为56.6±0.3 ºC6.
为了实现骨传导性，开发了一种基于溶剂浇铸-颗粒沥出（SCPL）方法的工艺，用于制备具有高度相互连通孔隙的聚己内酯（PCL）基形状记忆聚合物支架6,13,14。采用双丙烯酸酯封端的聚己内酯（PCL-DA）（Mn = ~10,000 g/mol），以实现快速的光化学交联，并将其溶解于二氯甲烷（DCM）中，以便在盐模板上进行溶剂浇铸。在完成光化学固化和溶剂蒸发后，通过将盐模板浸入水中沥出除去。盐粒的平均尺寸决定了支架的孔径。重要的是，在溶剂浇铸前需用水将盐模板部分熔结，以实现孔隙之间的相互连通。
通过向SMP支架赋予生物活性 原位 在孔壁上形成聚多巴胺涂层6通过引入玻璃或玻璃陶瓷填料，常可使支架具备生物活性。15然而，这些材料可能导致不理想的脆性机械性能。多巴胺已被证明可在多种底材上形成一层具有黏附性的薄聚多巴胺层。16-19在本方案中，将SMP支架置于轻度碱性溶液（pH = 8.5）的多巴胺中，以在所有孔壁表面形成一层纳米级厚度的聚多巴胺涂层6除了增强表面亲水性以促进细胞黏附和铺展外，聚多巴胺在接触模拟体液（SBF）后还表现出诱导羟基磷灰石（HAp）形成的能力。18,20,21最后一步，将涂覆的支架在85 ºC下进行热处理（T &#62; T转）从而导致支架致密化。先前研究指出，热处理对于支架的形状记忆行为至关重要，这可能归因于PCL结晶区域重新排列并彼此靠近14.
我们还描述了在不规则模型缺损中表征自适应贴合行为的方法，以及通过应变控制的循环热-机械压缩试验表征形状记忆行为的方法即 形状恢复与形状固定、孔隙形貌、以及 体外 生物活性。同时还介绍了调控支架特性的策略。

<table><tbody><tr><td>聚己内酯二醇（Mn ~ 10,000 g/mol）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440752</td><td></td></tr><tr><td>二氯甲烷（DCM）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D65100</td><td>经4A分子筛干燥</td></tr><tr><td>4-二甲氨基吡啶（DMAP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5640</td><td></td></tr><tr><td>三乙胺（Et3N）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰氯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A24109</td><td></td></tr><tr><td>乙酸乙酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319902</td><td></td></tr><tr><td>碳酸钾（K2CO3）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>209619</td><td></td></tr><tr><td>无水硫酸镁（MgSO4）</td><td>Fisher</td><td>M65</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮（DMP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>196118</td><td></td></tr><tr><td>1-乙烯基-2-吡咯烷酮（NVP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V3409</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>盐酸多巴胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8502</td><td></td></tr><tr><td>Tris缓冲液（2 mol/L）</td><td>Fisher</td><td>BP1759</td><td>使用浓度为10 mM，pH = 8.5</td></tr><tr><td>筛网</td><td>VWR</td><td>47729-972</td><td></td></tr><tr><td>紫外透射仪（365 nm，25 W）</td><td>UVP</td><td>95-0426-02</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>动态力学分析仪（DMA）</td><td>TA Instruments</td><td>Q800</td><td></td></tr><tr><td>高分辨率溅射镀膜仪</td><td>Cressington</td><td>208HR</td><td></td></tr><tr><td>扫描电子显微镜（SEM）</td><td>FEI</td><td>Quanta 600</td><td></td></tr></tbody></table>

一种生物活性pcl基“自适配”形状记忆聚合物支架的制备

Fabrication of a Bioactive, PCL-based "Self-fitting" Shape Memory Polymer Scaffold

组织工程已被探索作为治疗临界尺寸颅颌面（CMF）骨缺损的一种替代策略。该方法成功的关键在于支架材料，其必须能够顺应性地贴合不规则缺损区域，同时具备必要的生物降解性、孔隙连通性以及生物活性。凭借其形状恢复和固定特性，形状记忆聚合物（SMP）支架可实现缺损的“自适配”。因此，在暴露于温热生理盐水（~60 °C）后，预压缩的多孔SMP支架可迅速恢复至其原始形状，从而紧密贴合缺损轮廓。 &#186;C），SMP支架将变得可塑，可手动按压至不规则缺损处。随后冷却（约37 &#186;C）可使支架在缺损处恢复至相对刚性的状态。为满足这些要求，本方案描述了通过光化学固化可生物降解的聚己内酯二丙烯酸酯（PCL-DA）并结合溶剂浇铸-颗粒沥出法（SCPL）制备形状记忆聚合物（SMP）支架的方法。采用熔融盐模板以实现孔隙的相互连通。为赋予支架生物活性，对其孔壁表面施加聚多巴胺涂层。对自适配性与形状记忆行为、孔隙连通性及 体外 还描述了生物活性。

所得的基于PCL的形状记忆多孔支架能够自适应贴合模型颅颌面缺损（图2）。经短暂温热盐水处理（约60 °C）后，圆柱形支架软化，可手动按压并扩张嵌入模型缺损中。冷却至室温后，支架固定于新的临时形状，并在从缺损中取出后仍保持该形态。
通过应变控制的循环-热机械压缩测试，以形状固定率（Rf）和形状回复率（Rr）来量化SMP支架的形状记忆行为（图3）。对于该基于PCL的SMP支架，在第1和第2次循环（N = 1和2）中的数值（%）分别为：Rf (1) = 102.5 ± 0.7，Rf (2) = 101.8 ± 0.3，Rr (1) = 95.3 ± 0.9，以及 Rr (2) = 99.8 ± 0.26。
通过扫描电镜成像观察，SMP支架呈现出高度相互连通的孔隙结构（图4A）。该结...

能够适配颅颌面（CMF）骨缺损并具有骨传导性和生物活性的支架材料备受关注。本实验方案描述了一种基于聚己内酯二丙烯酸酯（PCL-DA）的形状记忆支架的制备方法，该方法采用融合盐模板的溶剂浇铸-颗粒沥滤（SCPL）技术，并施加具有生物活性的聚多巴胺涂层。

一种生物活性PCL基“自适配”形状记忆聚合物支架的制备

组织工程已被探索作为治疗临界尺寸颅颌面（CMF）骨缺损的一种替代策略。其关键在于……

以下实验的总体目标是制备一种形状记忆聚合物（SMP）支架，该支架能够自行贴合不规则的颅颌面缺损，以促进骨整合（osteointegration）与愈合。该目标通过首先采用溶剂浇铸法并结合聚己内酯二丙烯酸酯的光化学固化，制备融合盐模板来实现。在此盐模板上形成的支架具有骨传导所必需的高度相互连通的孔隙结构。第二步，将支架涂覆多巴胺聚合物，以提供生物活性。接着，用温热的生理盐水处理支架，使其能够压配植入不规则模型中。通过压配结果、扫描电子显微镜成像以及体外羟基磷灰石形成情况评估缺陷修复效果，结果显示存在自适配性差、孔隙连通性不足及生物活性较低等问题。与现有方法（如自体移植）相比，该技术的主要优势在于其良好的贴合性可有效促进骨整合与骨愈合。本实验操作由本实验室的博士研究生 Lindsey Nail 演示。开始制备支架时，先将氯化钠通过 425 微米筛网过筛，然后分四次将 1.8 克氯化钠转移至一个 3 升的玻璃瓶中，缓慢加入 146 毫克去离子水，并用金属刮刀搅拌混合。每次添加后，盖上小瓶盖，用纸巾包裹，并将其垂直放入离心管中。离心15分钟后，打开瓶盖，让溶液过夜自然干燥。按照文本方案合成P-C-L-D-A后，在玻璃小瓶中配制含有每毫升氯甲烷含150毫克P-C-L-D-A的胶溶液，盖上小瓶盖，用铝箔包裹，涡旋混合1分钟。接下来，准备光引发剂溶液：在玻璃小瓶中加入115毫克DMP和1毫升乙烯基、2份Perone，盖紧瓶盖，用铝箔包裹，并涡旋震荡1分钟。用移液器将光引发剂溶液加入到组织消化液中，配制成体积分数为15%的混合液，再将小瓶涡旋震荡1分钟。接下来，用铝箔包裹装有盐模板的离心管，加入光引发剂研磨混合物直至完全覆盖盐模板。盖紧管盖，用纸巾包裹后垂直放入离心管中。离心10分钟。接下来，去除锡箔，打开小瓶盖，将溶液暴露于紫外光下照射三分钟。随后让溶液在空气中干燥过夜，用镊子划痕并折断玻璃，以去除小瓶顶部。将支架转移至等体积的水-乙醇溶液中，浸泡四天，每天更换溶液。最后，取出 SMP 支架并风干过夜。首先施加聚多巴胺涂层时，将一根 20 号针头插入 SMP 支架一半深度，然后将导线缠绕在针头的针座上。将支架浸入 200 毫升搅拌中的多巴胺溶液中，并通过将导线固定在烧杯边缘，使针座保持在液面以上。接下来，将注射器插入针座中，拉动活塞以去除支架中的空气。待完全脱气后，将支架浸没在溶液中静置16小时。从溶液中取出支架，并拔出针头。然后用去离子水冲洗支架，并在室温下真空烘箱中干燥24小时。将支架置于85摄氏度的干燥烘箱中加热一小时。最后，取出支架并使其冷却至室温。首先，通过在厚度为五毫米的刚性塑料板上钻出一个平均直径约为六毫米的不规则孔洞，制备缺损模型。然后将形状记忆聚合物（SMP）支架浸入盛有去离子水的烧杯中，于约60摄氏度下持续两分钟。使用镊子 manipulating 支架形状，以检测其是否明显软化。用镊子将软化后的支架从水中取出，并用手将其压入缺损模型中。让支架冷却至室温，然后从缺损模型中取出。观察新固定的临时形状，以评估其浇注情况、相互连通性及尺寸。首先，用镊子将 SMP 支架浸入液氮中一分钟。然后用干净的剃刀刀片沿支架中部将其切开。接着，将其中一半支架的断裂面朝上固定在样品台。 使用导电胶带将支架用金和铂合金喷镀，镀层深度约为4纳米。将样品载入扫描电镜（SEM），在10至15千伏的加速电压下采集图像，以表征其体外生物活性。首先使用洁净的刀片沿圆柱形 SMP 支架的圆形边缘将其切成两半。将其中一半支架放入含有 30 毫升模拟体液的试管中，14 天后将试管置于 37 摄氏度的静止水浴中。从试管中取出支架，并使其在空气中干燥 24 小时。接下来，使用碳导电胶带将支架的切割面朝上固定在电子显微镜的样品台上。然后，用金和铂合金对支架表面进行溅射镀膜，镀层深度约为4纳米。同前，将样品装入扫描电镜中，并在10至15千伏的加速电压下采集图像。在60摄氏度加热时，SMP支架会变得可塑形，并可适配于缺损模型中。冷却至室温后，取出SMP支架，其可保持新的临时固定形状。扫描电镜图像显示了未涂层SMP支架的孔隙结构以及高度相互连通的形貌。聚多巴胺涂层SMP支架的生物活性通过其孔隙中形成羟基磷灰石得以证实，如扫描电子显微镜图像所示。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用溶剂浇铸结合盐模板颗粒沥滤工艺制备具有生物活性的自适配形状记忆聚合物支架，并掌握聚多巴胺涂层的应用方法。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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学习制备基于PCL的形状记忆聚合物支架的方法，该支架采用熔融盐模板和聚多巴胺涂层技术，可实现自我装配并促进骨整合，适用于颅颌面缺损修复。

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