使用聚己内酯支架和 hiPSC 衍生的心肌细胞的熔融静电纺丝写入生成 3D 人体心肌组织

提出了一种可重复的方法，将熔融静电纺丝书写 （MEW） 聚己内酯 （PCL） 支架和纤维蛋白水凝胶与 hiPSC 衍生的心肌细胞和成纤维细胞相结合来生成 3D 心肌组织。该技术提供了对支架结构的精确控制，可应用于临床前药物检测和心脏病建模。

本研究旨在使用熔融电支架和人类 iPSC 衍生的心脏细胞开发生物识别 3D 心脏组织，以改进疾病建模、药物检测和再生医学应用。干细胞心肌细胞中的人为诱导报告仍不成熟，限制了它们的功能。此外，重现 3D 心脏组织建模所需的严重复杂性也是一项挑战。

该模型更好地模拟了天然心肌，为疾病建模、药物检测和患者特定应用提供了复杂的 3D 细胞外基质相互作用。它为 2D 培养和动物模型提供了更相关的替代方案。展望未来，我们的研究将侧重于研究心动真菌学模型，增强 3D 组织成熟方案，以及为大型动物模型（如猪）的临床前心肌梗死治疗开发更大的结构。

首先，将注射器连接到加压氮气供应管，并将其引入加热室内。打开熔融静电纺丝书写设备，将腔室的温度调节器设置为 80 摄氏度，将喷嘴设置为 65 摄氏度。30 分钟后，移动收集板，直到打印头位于收集板的一个边缘或任何所需位置。

在 z 平面上手动将加热室和收集板之间的距离调整为 10 毫米。关闭设备门，它会自动连接电场电源。将氮气压力设置为 7 千伏，电压为 2 巴，以便通过 23 号尖端挤出。

在软件中加载设计 G 代码以打印具有方形图案几何形状的脚手架。将除尘器速度调整为每分钟 1080 毫米。然后按 Cycle Start（循环启动）按钮开始打印。

打印完成后，小心地从收集器中取出基架。使用直径为 6 毫米的冲头切割打印的网眼，以获得用于组织制造的最终支架。用氧等离子体处理支架 5 分钟。

将网片浸入 70% 乙醇中 30 分钟，对网片进行消毒。用无菌蒸馏水充分洗涤 30 分钟，然后晾干。分离人 iPSC 心肌细胞后，将细胞沉淀重悬于组织生成培养基中，并使用 Neubauer 室对细胞进行计数。

同样，分离人 iPSC 心脏成纤维细胞后，将细胞沉淀重悬于组织生成培养基中并对细胞进行计数。在新试管中混合所需的总细胞，并将内容物称为 Cell Mix。并在室温下以 300G 离心 5 分钟。

然后将细胞混合物重悬于所需体积的组织生成培养基中。要生成水凝胶混合物，请在室温下将所需体积的纤维蛋白原添加到试管中并小心混合。将水凝胶混合物接种到聚四氟乙烯表面，以防止纤维蛋白粘附到板上。

移液取一半体积的组织，将其滴成一滴。在每滴的顶部放置一个聚己内酯或 PCL 支架，并将剩余的体积添加到支架上。现在，加入所需量的凝血酶并快速混合水凝胶，小心避免气泡。

将组织在 37 摄氏度下孵育 1 小时以完成纤维蛋白聚合。使用无菌镊子轻轻地拾取每个组织的边缘，并将它们转移到含有补充有抑肽酶的组织生成培养基的 12 孔板中。将组织在 37 摄氏度下孵育 24 小时。

第二天，用 2 毫升组织维持培养基刷新培养基，去除 KSR 和 Y-27 残留物。将人 iPSC 心肌细胞和人 iPSC 心脏成纤维细胞的 8 比 2 混合物接种到纤维蛋白水凝胶中，可在聚合后 1 小时内在支架孔中形成均匀的细胞分布。共聚焦免疫荧光图像显示细胞通过 3D 组织与 PCL 支架相互作用的混合细胞分布，大多数人 iPSC 心肌细胞与波形蛋白标记的人 iPSC 心脏成纤维细胞交错进行肌节肌动蛋白染色。

人 iPSC 心肌细胞通过规则间隔的肌节肌动蛋白表现出组织良好的肌节结构。细胞在第 2 天开始自发跳动，第 7 天的平均跳动频率为每分钟 30 次，在整个网片中显示出稳定的收缩。随着时间的推移，观察到逐渐下降，到第 14 天达到 17 BPM。

尽管如此，代谢活性在第 7 天和第 14 天之间保持稳定，证实了持续的细胞活力。最后，对跳动组织的跟踪点分析显示收缩速度为每秒 38 微米，收缩幅度为 29 微米。