Name: 使用聚己内酯支架和 hiPSC 衍生的心肌细胞的熔融静电纺丝写入生成 3D 人体心肌组织 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: 学习熔融静电纺丝写入技术构建三维心肌组织模型，结合聚己内酯支架与人诱导多能干细胞衍生心肌细胞。该方法可精确控制支架结构，模拟天然心肌微环境，为心脏疾病建模、药物筛选及再生医学研究提供更相关的体外平台。

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本研究由H2020研究与创新计划资助，资助协议编号为874827（BRAV<img alt="方程1" src="/files/ftp_upload/67847/67847eq01.jpg" style="margin: auto;" />）；西班牙科学与大学部通过以下项目提供资助：PLEC2021-008127（CARDIOPRINT）、PID2022-142562OB-I00（VOLVAD）和PID2022-142807OA-I00（INVESTTRA），上述项目由MICIU/AEI /10.13039/501100011033以及欧洲联盟NextGenerationEU/PRTR资助；纳瓦拉政府战略项目IMPRIMED（0011-1411-2021-000096）和BIOHEART（0011-1411-2022-000071）；纳瓦拉政府合作项目BIOGEN（PC020-021-022）以及纳瓦拉政府卫生项目GN32/2023。图1A、图2A和图4A使用BioRender.com制作。

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</ol>

作者无利益冲突。

为了构建能够模拟人心肌天然特性的三维复合心脏微组织模型，必须考虑若干关键因素。这些因素可归纳为三个主要方面：（1）优化用于组织构建的细胞产量与纯度；（2）打印纤维状支架以模拟三维力学微环境；（3）在构建过程中整合纤维蛋白水凝胶。
确保分化过程成功的一些关键步骤包括：通过防止细胞融合度超过90%来维持hiPSCs的多能性特征；在传代时优化hiPSC的稀释比例，以在CM或CF分化开始时达到适当的融合度；并针对每种细胞系精细调整CHIR的浓度，以确保高效的中胚层诱导4,15。必须确保细胞培养物纯度超过90%，并能够分别生成不同类型的心脏细胞。这有助于形成功能性组织，使每种细胞类型的特定功能得以充分研究，尤其是在用于疾病建模或药理学测试时。为维持高水平的细胞纯度，必须严格在葡萄糖限制性培养基中进行心肌细胞的代谢筛选。另一方面，在获取健康的心脏成纤维细胞时，利用TGF-β通路调控其表型并促使其转化为肌成纤维细胞的能力，为模拟心肌纤维化等病理状态提供了可能，相关内容已在其他文献...

构建功能性人类心脏工程组织在高影响力应用方面具有广阔前景，其应用范围涵盖药物心脏毒性与人类心脏疾病模型的开发，以及具有相关尺寸的治疗性组织的生成1。尽管过去15年中该领域已取得显著进展，但目前构建高度仿生的人类心肌仍受限于难以重现天然心肌复杂的结构与力学组织特性2。
在生物学方面，革命性的细胞重编程技术为开发患者特异性的治疗细胞提供了可能。目前，在个体化背景下，人诱导性多能干细胞（hiPSCs）是获取人心肌细胞的唯一来源。通过稳健的分化方案，可获得高产量的心肌细胞3,4。一个关键问题是细胞的成熟度，因为目前在常规二维（2D）分化条件下使用的人hiPSC来源心肌细胞（hiPSC-CMs）表现出未成熟的表型5。这一问题与心脏组织复杂的结构构象密切相关，后者与常规的二维培养体系完全不同。此外，心肌组织由多种心血管细胞有序组成，包括心脏成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞等非肌细胞，这些细胞通过特定的三维（3D）结构排列，实现高效的血液泵送功能6,7。因此，需要构建包含所有主要细胞类型的高结构化人源心脏微组织，以生成具有生理相关性的仿生组织。
采用新型生物制造方法有望打破这一僵局。其中，熔融静电纺丝书写技术（melt electrospinning writing, MEW）作为一种先进的3D打印技术，能够实现高精度和高分辨率。在MEW中，利用电场将熔融聚合物以纤维形式沉积，纤维尺寸与细胞尺寸相当，比传统的熔融沉积成型（fused deposition modeling, FDM）3D打印小一个数量级，从而形成高度有序的支架结构8,9。研究表明，MEW能够将复杂的in silico设计转化为实际打印的基质，并在三维空间中调控物理特性以匹配心肌组织的特性10。利用MEW技术，可以打印出具有不同形状和结构的聚合物网格，结合柔软且利于细胞生长的水凝胶，构建出模拟天然成年心肌组织微观与宏观力学环境的复合组织11,12。研究已证实，改变MEW 3D支架的设计可影响其最终功能（如钙瞬变）10，这为理解这一有前景的3D工程化系统中的结构-功能关系奠定了基础。
本文提供了一种详细的实验方案，用于利用人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）和人诱导多能干细胞来源的心脏成纤维细胞（hiPSC-CFs）构建具有收缩功能的人类心脏微组织，并将其与通过熔融电写技术（3D MEW）打印的三维结构增强的纤维蛋白水凝胶相结合。在多种三维工程化系统中，添加成纤维细胞已被广泛用于提高hiPSC-CMs的存活率并维持组织结构，但其在3D-MEW系统中的应用尚未被探索13。本文所述技术为研究人员提供了一个多功能平台，可用于构建精确的心脏组织模型，应用于疾病机制研究、临床前毒理学评估和药物筛选等领域。该模型适用于评估已知药物（如蒽环类药物（例如多柔比星）、酪氨酸激酶抑制剂）以及新兴疗法（如嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞）引起的心脏毒性，这些疗法已被证实与心脏功能障碍相关14。此外，该模型在推动再生医学发展方面具有重要意义，可通过测试生物材料、生物墨水及基于细胞的治疗方法，促进心肌功能改善和心肌梗死等疾病状态下的心肌组织修复。

<table><tbody><tr><td>&amp;micro;-Slide 8 孔腔室载玻片（IbiTreat）</td><td>IBIDI</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>0.1% 明胶溶液（Embryomax）</td><td>Merck Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>10% 甲醛</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>12 孔板</td><td>Costar/Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Costar/Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>高级 DMEM 1x（ADMEM）</td><td>Gibco</td><td>12491015</td><td></td></tr><tr><td>牛肺来源抑肽酶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>B-27 补充剂，含胰岛素（50x）&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A317504044</td><td></td></tr><tr><td>B27 补充剂，不含胰岛素（50x）</td><td>Life Technologies</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>活检打孔器（6 mm 直径）</td><td>Medical</td><td>BP-60F</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021&amp;nbsp;</td><td>AXON MEDCHEM</td><td>AXON1386</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Zeiss</td><td>LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>培养瓶 175 cm²</td><td>Greiner Bio-One</td><td>660175</td><td></td></tr><tr><td>培养瓶 75 cm²</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>Beckman Coulter</td><td>CytoFlex&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>驴抗小鼠 IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21202&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>驴抗兔 IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-21207&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DPBS（无 Mg²⁺、Ca²⁺）</td><td>Gibco</td><td>A314190094</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M，pH 8.0</td><td>Life Technologies</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>ESSENTIAL 8 培养基试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>FGF2（重组人碱性 FGF 154 个氨基酸）</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>牛血浆来源纤维蛋白原</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>成纤维细胞生长培养基 3 试剂盒（FGM3）</td><td>PromoCell</td><td>C-23130</td><td></td></tr><tr><td>无血清替代物（KSR）</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>乳酸钠（L-乳酸钠）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71718</td><td></td></tr><tr><td>生长因子减少型 Matrigel（MGFR）基底膜基质，无 LDEV</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>MEW 23-G 针头</td><td>Nordson</td><td>7018302</td><td></td></tr><tr><td>MEW 打印机</td><td>QUT，昆士兰科技大学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEW 注射器</td><td>Nordson</td><td>7012072</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗心肌肌钙蛋白 T 单克隆抗体</td><td>Invitrogen</td><td>MA5-12960&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗 DDR2 单克隆抗体</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SAB5300116</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗&amp;alpha;-肌动蛋白（肌节型）单克隆抗体</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7811&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>聚&amp;epsilon;-己内酯（PCL），医用级</td><td>Corbion</td><td>PURASORB&amp;reg; PC 12</td><td></td></tr><tr><td>兔抗波形蛋白重组单克隆抗体 [EPR3776] - 细胞骨架标志物</td><td>Abcam</td><td>Ab29547&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>视黄酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 抑制剂 Y-27632（10 mg）</td><td>Fisher Scientific</td><td>HB2297</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640（含 L-谷氨酰胺）</td><td>Gibco</td><td>21875034</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640（无酚红）</td><td>Gibco</td><td>32404014</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 无葡萄糖</td><td>Gibco</td><td>11879020</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>SELLECK CHEMICALS</td><td>S1067</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计&amp;nbsp;</td><td>BMG Labtech&amp;nbsp;</td><td>SPECTROstar Nano</td><td></td></tr><tr><td>凝血酶（人 α 凝血酶，凝血因子 IIa）</td><td>Enzyme Research Lab</td><td>HT 1002a</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Life Technologies</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>吐温 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Wnt-C59</td><td>AXON MEDCHEM</td><td>AXON2287</td><td></td></tr></tbody></table>

利用聚己内酯支架的熔融静电纺丝书写技术与人诱导多能干细胞来源的心脏细胞生成三维人心肌组织

3D Human Myocardial Tissue Generation Using Melt Electrospinning Writing of Polycaprolactone Scaffolds and hiPSC-Derived Cardiac Cells

功能性人类心肌组织的开发在药物筛选、疾病建模和再生医学的应用方面具有重要意义。本方案描述了一种逐步构建三维心肌组织的方法，通过将熔融电纺写入（melt electrospinning writing, MEW）技术制备的聚己内酯（polycaprolactone, PCL）支架与纤维蛋白水凝胶及人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的心脏细胞相结合，实现对天然心肌结构的高度模拟。该过程包括将心肌细胞（hiPSC-CMs）与心脏成纤维细胞（hiPSC-CFs）混合后包埋于纤维蛋白基质中，形成微型组织，并由MEW生成的支架提供结构支撑。这些纤维状支架在微米至纳米尺度上构建，可精确调控纤维结构，从而在细胞分布与取向排列中发挥关键作用。同时，纤维蛋白基质有助于维持细胞活力并模拟细胞外环境。对所生成组织的表征显示，hiPSC-CMs中形成了结构良好的肌节，并表现出稳定的收缩活性。组织在接种后最早两天即出现持续的自发搏动，且功能可长期维持。hiPSC-CFs与hiPSC-CMs的共培养增强了组织的结构完整性，同时支持细胞的长期存活。该方法提供了一种可重复、可调节且可放大的生物模拟心脏组织构建策略，为临床前药物测试、心脏疾病的机制研究以及潜在的再生治疗提供了多功能平台。

二维 hiPSC 来源心肌细胞的表征 
为了生成多表型的心脏组织，需对hiPSC-CMs和hiPSC-CFs进行独立分化与表征 体外通过适当的优化和严格的操作维护，本方案可在分化第9天获得超过80%的hiPSC-CMs，产生自发性搏动的细胞（图1A）。此外，通过代谢筛选进行纯度富集可大幅去除非hiPSC-CMs，从而获得由超过90%表达心肌肌钙蛋白（cTNT）的细胞组成的培养物+第21天（图1B）。这些稳定搏动的单层细胞通过免疫荧光染色显示表达收缩性肌节α-辅肌动蛋白（ACTN）。图1C，D).
另一方面，该方案的成功依赖于通过中间心外膜状态的诱导来生成心脏特异性成纤维细胞。在此过程中，使用CHIR重新激活Wnt信号通路后，可在第8天从心脏中胚层前体细胞获得心外膜细胞（<strong clas...

本文介绍了一种可重复的方法，通过结合熔融电纺写入（MEW）法制备的聚己内酯（PCL）支架、纤维蛋白水凝胶以及人诱导多能干细胞来源的心肌细胞和成纤维细胞，生成三维心肌组织。该技术可精确控制支架结构，适用于临床前药物筛选和心脏疾病建模。

功能性人类心肌组织的开发在药物筛选、疾病建模以及……等应用方面具有重要意义

本研究旨在利用熔融电纺支架和人诱导多能干细胞来源的心脏细胞开发生物特征性的三维心脏组织，以改善疾病建模、药物测试和再生医学应用。目前由人诱导多能干细胞分化得到的心肌细胞仍处于未成熟状态，限制了其功能发挥。此外，再现构建三维心脏组织所需的复杂结构仍具有挑战性。该模型能更好地模拟天然心肌，支持复杂的三维细胞外基质相互作用，适用于疾病建模、药物测试及个体化医疗应用。相较于二维培养和动物模型，该模型提供了更具生理相关性的替代方案。未来，我们的研究将聚焦于心肌细胞模型的深入探索、优化三维组织成熟方案，以及开发适用于猪等大型动物模型的临床前心肌梗死治疗用更大尺寸组织构建物。首先，将注射器连接至加压氮气供应管路，并将其引入加热室中。开启熔融电写纺丝设备，将加热室的温度调节器设定为80摄氏度，喷嘴温度调节器设定为65摄氏度。30分钟后，移动收集板，使打印头位于收集板的一侧边缘或任何所需位置。手动调节加热室与收集板在 z 轴方向上的距离至 10 毫米。关闭设备门，此时电场电源将自动接通。在氮气压力为 2 巴的条件下，将电压设定为 7 千伏，以通过 23 号针头进行挤出。在软件中加载设计G代码，以打印具有方形图案几何结构的支架。将收集器速度调整为1080毫米/分钟。然后按下循环启动按钮以开始打印。打印完成后，小心地将支架从收集器上取下。使用直径为六毫米的打孔器切割打印好的网状物，以获得用于组织构建的最终支架。用氧气等离子体处理支架五分钟。将网格浸入70%乙醇中30分钟以灭菌。用无菌蒸馏水充分洗涤30分钟，然后使其自然干燥。在分离人iPSC心肌细胞后，将细胞沉淀重悬于组织生成培养基中，并使用血细胞计数板进行细胞计数。同样，在消化分离人iPSC来源的心脏成纤维细胞后，将细胞沉淀重悬于组织生成培养基中，并对细胞进行计数。将所需总数的细胞混入一个新的离心管中，并将此混合物称为细胞混合液（Cell Mix）。随后在室温下以300×g离心5分钟。然后用所需体积的组织生成培养基重新悬浮细胞混合物。制备水凝胶混合物时，在室温下将所需体积的纤维蛋白原加入离心管中，并轻轻混匀。将水凝胶混合物接种到聚四氟乙烯表面，以防止纤维蛋白黏附于培养板。用移液器取组织体积的一半，使其形成液滴。将聚己内酯（PCL）支架置于每个液滴上方，并将剩余体积的液体加至支架上。随后，加入所需量的凝血酶，并迅速混匀水凝胶，注意避免产生气泡。将组织在 37 摄氏度下孵育 1 小时，以完成纤维蛋白的聚合。使用无菌镊子轻轻夹住组织边缘，将其转移至含有添加了抑肽酶的组织生成培养基的 12 孔板中。将组织在 37 摄氏度下继续孵育 24 小时。次日，用两毫升组织维持培养基更换培养液，去除KSR和Y-27残留物。将人iPSC心肌细胞与人iPSC心脏成纤维细胞按8:2的比例接种至纤维蛋白水凝胶中，可在聚合后一小时内实现细胞在支架孔隙中的均匀分布。共聚焦免疫荧光图像显示，细胞在三维组织中呈混合分布，贯穿与PCL支架相互作用的组织，其中大多数人iPSC心肌细胞表达肌节性α-辅肌动蛋白，其间分布着vimentin标记的人iPSC心脏成纤维细胞。人iPSC心肌细胞通过规则排列的肌节α-辅肌动蛋白呈现出高度有序的肌节结构。细胞在第2天开始出现自发性搏动，第7天时平均搏动频率为每分钟30次，整个网格中收缩活动稳定。随着时间推移，搏动频率逐渐下降，至第14天时降至每分钟17次。尽管如此，在第7天至第14天之间代谢活性保持稳定，证实了细胞活力的持续性。最后，对搏动组织的轨迹点分析显示，其收缩速度为每秒38微米，收缩幅度为29微米。

3d-human-myocardial-tissue-generation-using-melt-electrospinning

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

使用聚己内酯支架和 hiPSC 衍生的心肌细胞的熔融静电纺丝写入生成 3D 人体心肌组织

生成排列整齐的心肌组织是将干细胞生物学的最新进展应用于临床实用目的的关键要求。本文中，我们描述了一种微接触印刷技术，可精确控制细胞形态与功能。利用高度纯化的胚胎干细胞来源的心脏前体细胞，我们进而生成了各向异性的功能性心肌组织。...

通过微接触印刷技术生成取向功能性心肌组织

本论文描述了利用表面标志物表达和细胞分选技术构建明确组成的工程化心肌组织的方法。这些明确组成的心肌组织随后可用于多组织生物反应器，以研究心脏细胞治疗的机制，从而提供一个具有功能性且可控的人类心脏模型系统。...

构建定义明确的人源工程化心肌组织以研究心肌细胞治疗机制

本方案描述了无需使用生物材料的三维心脏组织生物打印技术。三维生物打印的心脏补片表现出组分球状体之间的机械整合，在心脏组织再生及作为心脏疾病的三维模型方面具有广阔的应用前景。...

利用3D生物打印技术构建表现出类球体机械整合的心脏组织

本方案描述了一种基于网状模具的方法，用于构建具有满意结构完整性和同步搏动行为的三维无支架心肌组织。...

一种基于网状模具的无支架三维心脏组织构建方法

本方案旨在生成含有源自人诱导性多能干细胞的心血管细胞的网状工程化心肌组织，以用于心脏疾病细胞移植治疗的研究。...

由人iPS细胞衍生的网格状工程化心肌组织制备及其在体内心肌修复中的应用

本文介绍一种易于使用的3D自组装心脏微组织阵列制备方法，该阵列由预先分化的人诱导多能干细胞来源的心肌细胞、心脏成纤维细胞和内皮细胞组成。这种操作简便且所需细胞量少的心脏微组织制备技术，可用于疾病建模及药物研发的早期阶段。...

利用人iPSC来源的心肌细胞、心脏成纤维细胞和内皮细胞构建三维心脏微组织阵列

本实验方案旨在介绍并演示一种高度定向的人类心肌组织三维（3D）微流控模型的构建方法。该模型由干细胞来源的心肌细胞与心脏成纤维细胞（CFs）在仿生性胶原基水凝胶中共培养形成，可用于心肌组织工程、药物筛选及疾病建模等应用。...

在微流控平台上构建三维有序的人类心脏组织

该方法为在三维（3D）支架（例如心脏瓣膜瓣叶）中构建仿生纤维结构提供了一种创新途径。采用3D打印的导电几何结构来确定形状和尺寸。每一层的纤维取向和特性均可独立调节。一个实验设置中可同时制备多个样品。...

结合3D打印与静电纺丝技术制造仿生心脏瓣膜瓣叶

本文介绍了一组从人诱导性多能干细胞衍生的心肌细胞在高通量、多维度培养条件下生成心脏类球体（CSs）并进行冷冻保存的实验方案。该三维模型可作为疾病建模和高通量筛选的可靠平台，并在冷冻保存后仍能维持其功能特性。...

人诱导多能干细胞来源心脏类球体的生成、高通量筛选与生物样本库保存

利用光来控制心肌细胞和组织可实现非接触式刺激，从而保持细胞的自然状态和功能，这一方法在基础研究和治疗应用中均具有重要价值。...

一种用于通过非遗传性光学刺激研究钙离子（Ca2+）传导的心脏微生理系统

学习熔融静电纺丝写入技术构建三维心肌组织模型，结合聚己内酯支架与人诱导多能干细胞衍生心肌细胞。该方法可精确控制支架结构，模拟天然心肌微环境，为心脏疾病建模、药物筛选及再生医学研究提供更相关的体外平台。

利用聚己内酯支架的熔融静电纺丝书写技术与人诱导多能干细胞来源的心脏细胞生成三维人心肌组织

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