利用聚己内酯支架的熔融静电纺丝书写技术与人诱导多能干细胞来源的心脏细胞生成三维人心肌组织

本研究旨在利用熔融电纺支架和人诱导多能干细胞来源的心脏细胞开发生物特征性的三维心脏组织，以改善疾病建模、药物测试和再生医学应用。目前由人诱导多能干细胞分化得到的心肌细胞仍处于未成熟状态，限制了其功能发挥。此外，再现构建三维心脏组织所需的复杂结构仍具有挑战性。

该模型能更好地模拟天然心肌，支持复杂的三维细胞外基质相互作用，适用于疾病建模、药物测试及个体化医疗应用。相较于二维培养和动物模型，该模型提供了更具生理相关性的替代方案。未来，我们的研究将聚焦于心肌细胞模型的深入探索、优化三维组织成熟方案，以及开发适用于猪等大型动物模型的临床前心肌梗死治疗用更大尺寸组织构建物。

首先，将注射器连接至加压氮气供应管路，并将其引入加热室中。开启熔融电写纺丝设备，将加热室的温度调节器设定为80摄氏度，喷嘴温度调节器设定为65摄氏度。30分钟后，移动收集板，使打印头位于收集板的一侧边缘或任何所需位置。

手动调节加热室与收集板在 z 轴方向上的距离至 10 毫米。关闭设备门，此时电场电源将自动接通。在氮气压力为 2 巴的条件下，将电压设定为 7 千伏，以通过 23 号针头进行挤出。

在软件中加载设计G代码，以打印具有方形图案几何结构的支架。将收集器速度调整为1080毫米/分钟。然后按下循环启动按钮以开始打印。

打印完成后，小心地将支架从收集器上取下。使用直径为六毫米的打孔器切割打印好的网状物，以获得用于组织构建的最终支架。用氧气等离子体处理支架五分钟。

将网格浸入70%乙醇中30分钟以灭菌。用无菌蒸馏水充分洗涤30分钟，然后使其自然干燥。在分离人iPSC心肌细胞后，将细胞沉淀重悬于组织生成培养基中，并使用血细胞计数板进行细胞计数。

同样，在消化分离人iPSC来源的心脏成纤维细胞后，将细胞沉淀重悬于组织生成培养基中，并对细胞进行计数。将所需总数的细胞混入一个新的离心管中，并将此混合物称为细胞混合液（Cell Mix）。随后在室温下以300×g离心5分钟。

然后用所需体积的组织生成培养基重新悬浮细胞混合物。制备水凝胶混合物时，在室温下将所需体积的纤维蛋白原加入离心管中，并轻轻混匀。将水凝胶混合物接种到聚四氟乙烯表面，以防止纤维蛋白黏附于培养板。

用移液器取组织体积的一半，使其形成液滴。将聚己内酯（PCL）支架置于每个液滴上方，并将剩余体积的液体加至支架上。随后，加入所需量的凝血酶，并迅速混匀水凝胶，注意避免产生气泡。

将组织在 37 摄氏度下孵育 1 小时，以完成纤维蛋白的聚合。使用无菌镊子轻轻夹住组织边缘，将其转移至含有添加了抑肽酶的组织生成培养基的 12 孔板中。将组织在 37 摄氏度下继续孵育 24 小时。

次日，用两毫升组织维持培养基更换培养液，去除KSR和Y-27残留物。将人iPSC心肌细胞与人iPSC心脏成纤维细胞按8:2的比例接种至纤维蛋白水凝胶中，可在聚合后一小时内实现细胞在支架孔隙中的均匀分布。共聚焦免疫荧光图像显示，细胞在三维组织中呈混合分布，贯穿与PCL支架相互作用的组织，其中大多数人iPSC心肌细胞表达肌节性α-辅肌动蛋白，其间分布着vimentin标记的人iPSC心脏成纤维细胞。

人iPSC心肌细胞通过规则排列的肌节α-辅肌动蛋白呈现出高度有序的肌节结构。细胞在第2天开始出现自发性搏动，第7天时平均搏动频率为每分钟30次，整个网格中收缩活动稳定。随着时间推移，搏动频率逐渐下降，至第14天时降至每分钟17次。

尽管如此，在第7天至第14天之间代谢活性保持稳定，证实了细胞活力的持续性。最后，对搏动组织的轨迹点分析显示，其收缩速度为每秒38微米，收缩幅度为29微米。