质粒来源的DNA链置换盖茨实施化学反应网络

该程序的总体目标是从细菌质粒获得 DNA 链位移门。该技术的主要优点是它利用细菌质粒作为高纯度来源来生成强大的 DNA 门。演示此程序的将是我的同事 Sam Dip 和我自己 开始大规模生产，然后按照随附文本方案中的说明，并按照 ellucian 后面的制造商说明使用 DNA 分离试剂盒开始大规模生产并分离含有 DNA 门。

使用标准技术测量质粒 DNA 的浓度。然后通过向每毫克质粒添加 4 个单位的限制性内切酶 PV U2 HF 来消化 DNA。接下来，向样品中加入两等体积的冰冷无水乙醇。

将混合物在零下 80 摄氏度下孵育至少 1 小时以沉淀 DNA。然后，将样品在 10， 000 至 14， 000 倍 G 和 0 摄氏度下离心 30 分钟，使沉淀的 DNA 沉淀。去除 SNAT 并向样品中加入 1000 微升室温 95% 乙醇。

然后将样品倒置 10 至 15 次，将样品以 10， 000 至 14， 000 倍 G 和 4 摄氏度离心 10 分钟。完成后，去除上清液，在工作台上风干 DNA 10 至 20 分钟。从沉淀的 DNA 中去除上清液时，注意不要干扰沉淀，否则产量会显著降低。

干燥后，将 DNA 沉淀重新悬浮在最多 200 μL 的无核酸酶水中，并涡旋混合。添加超过 200 微升的水通常会使样品稀释以供使用。在动力学实验中，按照制造商的说明使用分光光度计测量重悬的 DNA。

然后每 1 μg 质粒加入 4 个单位的切口酶 M-B-B-S-R-D，并加入相应的酶缓冲液。将样品在 65 摄氏度下孵育 1 小时以消解接缝门。接下来，通过每 1 μg 质粒添加 8 个切口酶 NT BST mb 1 单位和相应的酶缓冲液来消化叉门。

将样品在 55 摄氏度下孵育 1 小时。要首先准备荧光报告基因 Resus，请按照随附文本方案中的说明暂停和定量样品。然后将 10 微升报告基团下链与 13 微升上淬灭基团链混合在 tris 乙酸 EDTA 缓冲液中，加入 12.5 毫摩尔镁。

为确保所有菌群、四条标记的链都被淬灭，应添加 30% 过量的淬灭剂标记链。接下来，使用热循环仪对报告基因 C 复合物进行 anil 处理。以每分钟 1 摄氏度的速度将样品从 95 摄氏度冷却到 20 摄氏度。

完成后，校准后将样品储存在 4 摄氏度。首先将温度控制器设置为 25 摄氏度，同时保持温度稳定，以开始荧光测量。在数据采集软件中为动力学测量设置适当的参数。

打开光谱荧光计的软件后，将激发和发射单色的滑移宽度设置为 2.73 纳米。然后将每 62 个时间点的积分时间设置为 10 秒，并将总测量时间设置为 24 小时。最后，设置激发波长和发射波长以匹配实验中使用的植物群

接下来，向合成石英池中加入 410.2 微升无核酸酶水和 52.8 微升含有 125 毫摩尔镁的 10 种额外乙酸盐 EDTA 缓冲液。同时加入两微升 300 毫摩尔多聚 T 链，然后将合成石英池涡旋 10 至 15 秒。接下来，在 10 微摩尔的 9 微升报告链和 10 微摩尔的每条辅助链中 6 微升。

然后在 45 微升的关节门和叉门中以 1 微摩尔分液，并通过上下吹打至少 20 次轻轻混合溶液。最后，在 9 微升 10% 钠中，硫酸钠钠达到 0.15% SDS 的最终浓度，通过上下吹打至少 20 次轻轻混合反应，立即将合成夸脱细胞放入光谱凹槽的腔室中并开始动力学测量。测量 5 分钟后，加入 3 微升输入链。

向合成夸脱细胞中加入 10 微摩尔。当数据采集程序暂停时，通过上下移液至少 20 次轻轻混合反应，然后关闭光罩并继续记录反应动力学，直到达到稳定。等离子体衍生门和合成门的状态动力学数据在实验中显示。

信号链 A 的浓度是固定的，而催化信号 B 的量是变化的。信号 C 用于在不中断的情况下读出反应的进度。催化循环周转定义为在给定时间为每个催化剂 B 产生的信号 C 量。

对于理想的催化系统，只要底物不受限制，该周转数应随时间线性增加，并且与催化剂的量无关。在这里观察到，合成系统比等离子体衍生系统更早地偏离了理想的线性周转量增加，这表明催化剂通过不需要的副反应被隔离。这里比较了等离子体衍生门和合成门的电路泄漏，观察到反应 10 小时后，使用等离子体衍生门的泄漏信号比使用合成门的泄漏信号比低约 8%。

观看本视频后，您应该对如何从细菌质粒生成稳健的 DNA 门以及使用荧光动力学测量测试门有很好的了解。