基于质粒DNA的链置换门用于实现化学反应网络

本实验的总体目标是从细菌质粒中制备DNA链置换门。该技术的主要优势在于利用细菌质粒作为高纯度的来源，从而生成稳定的DNA门结构。演示本实验操作的将是我的同事Sam Dip以及本人。首先，按照随附的文字版实验方案及厂商说明书中的指示，使用DNA提取试剂盒大量制备并分离含有DNA门的质粒。

使用标准技术测定质粒DNA的浓度。然后，每毫克质粒加入四个单位的限制性内切酶PV U2 HF进行DNA消化。接着，向样品中加入两倍体积的预冷无水乙醇。

将混合物在负80摄氏度下孵育至少一小时，以沉淀DNA。然后在0摄氏度、10,000至14,000 ×g条件下离心样品30分钟，使沉淀的DNA形成沉淀颗粒。弃去上清液，并向样品中加入1000微升室温的95%乙醇。

然后将样品上下颠倒10至15次，接着在4°C条件下以10,000至14,000 × g离心10分钟。离心结束后，弃去上清液，并将DNA在实验台上风干10至20分钟。从沉淀的DNA中去除上清液时，注意不要扰动沉淀物，否则得率将显著降低。

干燥后，加入最多 200 µL 无核酸酶水重悬 DNA 沉淀，并涡旋混匀。加入超过 200 µL 的水通常会使样品过于稀释而无法使用。在动力学实验中，按照制造商说明书，使用分光光度计测定重悬后的 DNA。

然后每1微克质粒加入4单位的切刻酶M-B-B-S-R-D，并加入相应的酶缓冲液。在65摄氏度孵育样品1小时，以消化连接门。接着，每1微克质粒加入8单位的切刻酶NT BST mb及相应的酶缓冲液，消化叉状门。

将样品在 55 摄氏度下孵育 1 小时。首先复苏荧光报告分子，按照随附的文字版实验方案所述，重悬并定量样品。然后在含有 12.5 毫摩尔氯化镁的 Tris-乙酸-EDTA 缓冲液中，将 10 微升报告分子的底链与 13 微升顶部淬灭链混合。

为了确保所有发夹结构完全淬灭，应加入过量30%的淬灭剂标记链。接下来，使用PCR仪退火报告链C复合物。以每分钟1摄氏度的速率，将样品从95摄氏度冷却至20摄氏度。

完成校准后，将样品在4 °C下保存。在温度稳定期间，首先将温度控制器设定为25 °C，然后开始荧光测定。在数据采集软件中设置合适的动力学测量参数。

打开光谱荧光仪软件后，将激发和发射单色器的狭缝宽度均设置为 2.73 纳米。然后将积分时间设置为每第 62 个时间点 10 秒，并将总测量时间设置为 24 小时。最后，将激发和发射波长设置为与实验中使用的荧光染料相匹配。

接下来，向合成石英比色皿中加入 410.2 µL 无核酸酶水和 52.8 µL 含有 125 mM 镁离子的 10 倍醋酸盐 EDTA 缓冲液。再加入 2 µL 浓度为 300 µM 的 poly T 链，然后将合成石英比色皿涡旋振荡 10 至 15 秒。随后加入 9 µL 浓度为 10 µM 的报告链以及每种辅助链各 6 µL（浓度均为 10 µM）。

然后加入45微升的关节门和叉状门，浓度均为1微摩尔，并通过上下吹打至少20次轻轻混匀溶液。最后加入9微升10%十二烷基硫酸钠，使终浓度达到0.15% SDS，立即通过上下吹打至少20次轻轻混匀反应体系，随后将合成的四联体细胞迅速放入光谱仪的样品室中，并开始动力学测量。在测量5分钟后，加入3微升的输入链。

向合成四细胞中加入10 µM。在数据采集程序暂停期间，用移液器轻轻吹打反应液至少20次以混匀，然后关闭光罩，继续记录反应动力学，直至达到稳态。本实验展示了血浆来源门控和合成门控的动力学数据。

信号链A的浓度保持恒定，而催化信号B的量则进行变化。信号C用于在不中断反应的情况下读取反应进程。催化循环周转数定义为在给定时间内每个催化剂B所产生的信号C的量。

对于一个理想的催化体系，只要底物不成为限制因素，其转换数应随时间呈线性增加，并且与催化剂的用量无关。此处观察到，与血浆来源体系相比，合成体系更早地偏离了理想的线性增长趋势，表明催化剂通过某种不利的副反应被隔离或失活。本文还比较了血浆来源和合成门控装置的电路泄漏情况，发现反应进行10小时后，使用血浆来源门控装置的泄漏信号比率比使用合成门控装置的低约8%。

观看本视频后，您应能够充分理解如何从细菌质粒构建稳定的DNA门控系统，并利用荧光动力学测量技术对这些门控系统进行检测。