Name: 质粒来源的DNA链置换盖茨实施化学反应网络 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: 了解如何从细菌质粒中提取DNA链置换门，并通过荧光动力学测量进行测试。该方法利用高纯度质粒DNA生成稳健的分子门，用于构建多组分化学反应网络系统。

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图1、2、3、4、6、8 以及 表2、3、10、15、16 改编自参考文献29。本研究由美国国家科学基金会（资助号 NSF-CCF 1117143 和 NSF-CCF 1162141，授予 G.S.）提供支持。Y.-J. C. 获中国台湾政府奖学金资助。S.D.R. 获美国国家科学基金会研究生研究奖学金项目（GRFP）资助。

1. 序列设计
注意：序列设计概述：本节描述了质粒来源的DNA门电路的设计策略。在门电路两端设置酶切位点，以便在酶切后释放完整的双链门电路。随后设置切刻位点，使酶在上链产生切刻，从而形成最终的ndsDNA门电路。最后，选择剩余序列时需确保各个独立结构域彼此正交，且不形成二级结构。
<ol>
	<li>将Nt.BstNBI切刻位点置于每个长结构域（a、b、c、r和i）3’端下游4个核苷酸处；将Nb.BsrDI切刻位点置于每个长结构域（a、b、c和r）的5’端（注意结构域i不含任何Nb.BsrDI切刻位点）。图2C展示了JoinAB和ForkBC门的详细序列视图。</li>
	<li>在ndsDNA门的两端均放置PvuII限制性酶切位点，以便通过PvuII消化将门从质粒中释放出来（见图2C）。</li>
	<li>设计其他无约束序列时应遵循两个原则：(a) 引物链不应形成二级结构（可使用Nupack41预测DNA结构）；(b) 所有结构域应相互正交，以最小化串扰。</li>
	<li>将ndsDNA序列置于门模板的中央位置，在门模板两端各添加30–40 bp的随机间隔序列，每个间隔序列作为后续聚合酶链式反应（PCR）的唯一结合位点。</li>
</ol>
2. 将 NdsDNA 门克隆至质粒
注意：本部分描述了将4个拷贝的门序列插入质粒骨架的Gibson克隆方法。
<ol>
	<li>向DNA制造商订购作为双链基因组片段的ndsDNA门控模板（门控模板序列见表1；ndsDNA门控中包含的链序列见表2；结构域水平序列见表3）。</li>
	<li>收到订购的DNA后，将含有基因组片段的离心管在10,000–14,000 × g下离心1分钟，以确保所有干燥的DNA均沉降至管底。</li>
	<li>用无DNase的水重悬干燥的基因组片段，使其终浓度为10 ng/µl。 
	注意：也可选择使用1× Tris-乙二胺四乙酸（EDTA）缓冲液（TE缓冲液：10 mM Tris和1 mM EDTA，pH 8.0）重悬DNA。但EDTA是二价阳离子的螯合剂，可能抑制PCR反应。</li>
	<li>使用高保真DNA聚合酶通过标准PCR扩增生成4个具有不同重叠区域的门控片段（见图3A）。引物序列详见表4（这些引物的熔解温度为62 °C）。</li>
	<li>在室温下以140 V电压运行2%琼脂糖凝胶电泳30分钟（详细的琼脂糖凝胶电泳方案参见42），切下对应于各PCR扩增片段的条带。随后使用凝胶回收试剂盒（请参见材料部分），按照制造商说明书纯化凝胶切片。</li>
	<li>根据制造商说明书，在37 °C条件下使用PvuII-HF和PstI-HF酶切高拷贝数质粒骨架（见材料部分）1小时（见表5）。PvuII-HF和PstI-HF为高保真限制性内切酶，可显著减少非特异性切割。</li>
	<li>运行1.5%琼脂糖凝胶，切下线性化的质粒骨架（通常在室温下以140 V电压电泳30–40分钟）。然后按照制造商说明书，使用凝胶回收试剂盒从凝胶切片中提取DNA。</li>
	<li>将线性化载体与纯化的PCR片段进行Gibson组装43，在50 °C下反应1小时（见表6和图3B）。</li>
	<li>将步骤2.8中的Gibson组装产物转化至大肠杆菌（E. coli）中，并涂布于含有氨苄青霉素抗生素（终浓度为100 µg/ml）的LB（Lysogeny Broth）琼脂平板上。可通过电穿孔或热激法进行转化44,45，并使用相应的E. coli菌株。例如，热激转化可使用E. coli JM109菌株，电穿孔则使用DH5α电转感受态E. coli细胞。 
	注意：所用质粒骨架含有氨苄青霉素抗性表达盒。若使用其他筛选标记，请选用相应的抗生素替代氨苄青霉素。</li>
</ol>
3. 细菌培养扩增与质量控制
注意：本节描述了在质量控制后，含有DNA门的质粒的大规模生产与分离。
<ol>
	<li>从第2.9步的氨苄青霉素选择性平板上挑取单个菌落，接种于3 ml含有氨苄青霉素抗生素（终浓度为100 µg/ml）的富集培养基中。标记该菌落，以便在后续实验步骤中可再次使用。在37 °C下剧烈振荡（200–300 rpm）培养过夜（O/N），通常培养16–24小时。</li>
	<li>按照试剂盒制造商的说明，使用质粒小提试剂盒（Mini-prep kit）从细菌培养物中提取质粒DNA。</li>
	<li>按照制造商说明，使用分光光度计测定纯化后的质粒DNA浓度。通常产量范围为50–1,000 ng/µl。</li>
	<li>将提取的质粒DNA送至DNA测序公司进行测序。测序引物应位于待测区域上下游约100个核苷酸处；用于该质粒的测序引物（参见材料中所述质粒）序列为：ATTACCGCCTTTGAGTGAGC。 
	注意：如果插入的nd-sDNA门控序列存在错误或发生重组，请从第2.9步的平板上重新挑选另一个菌落，并重复步骤3.1–3.4，以确认插入门控序列的正确性。</li>
	<li>在确认序列正确后，从氨苄青霉素选择性平板（第2.9步）上挑取对应的菌落，接种于800 ml含有氨苄青霉素抗生素（终浓度为100 µg/ml）的TB培养基（Terrific Broth, TB）中。在37 °C下剧烈振荡（200–300 rpm）培养16–24小时。TB培养基特别适用于高产量质粒的制备。 
	注意：也可使用LB培养基培养细菌，但质粒产量可能较低。</li>
	<li>按照制造商的说明，使用质粒大提试剂盒（Maxi-prep kit）纯化DNA。</li>
	<li>重复步骤3.3–3.4，检测序列是否正确。若仍发生重组，请参见以下说明；否则进入步骤4。 
	注意：此处可能出现的问题是，质粒中插入的多个门控拷贝可能因DNA修复机制而发生重组。为解决此问题，可使用缺乏recA蛋白（与DNA修复相关的蛋白）的E. coli菌株（如JM109或DH5α），转化一个先前已确认序列正确的质粒（i.e., 无任何序列错误和重组）。然后从该平板上挑取单个菌落，并将样品送至DNA测序公司验证质粒序列。</li>
</ol>
4. 酶处理
注意：本节描述了消化质粒的过程，以确保质粒在正确位置被切割和切口化，从而准备好用于动力学实验。
<ol>
	<li>使用限制性内切酶 PvuII-HF 在 37 °C 条件下消化步骤 3.7 中纯化的质粒 DNA，反应 1 小时（见表 7）。通常每 1 mg 质粒使用 4 单位的 PvuII-HF 进行消化。建议使用高保真限制性内切酶，因为它们可显著减少非特异性切割。</li>
	<li>对样品进行乙醇沉淀。
	<ol>
		<li>向样品中加入 2 倍体积的预冷无水乙醇。</li>
		<li>在 -80 °C 下孵育混合物至少 1 小时（也可在 -80 °C 下过夜）。</li>
		<li>在 0 °C 下以 10,000–14,000 × g 离心 30 分钟。</li>
		<li>弃去上清液。</li>
		<li>向样品中加入 1,000 µl 室温 95% 乙醇，并颠倒混匀 10–15 次。</li>
		<li>在 4 °C 下以 10,000–14,000 × g 离心 10 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，并在实验台上风干 10–20 分钟。</li>
		<li>将 DNA 沉淀重悬于适量无核酸酶水（Nuclease free H2O）中（通常为 100–200 µl）。加入超过 200 µl 通常会使样品在动力学实验中浓度过低。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照制造商说明，使用分光光度计测定重悬 DNA 的浓度。</li>
	<li>使用切刻酶 Nb.BsrDI 在 65 °C 下消化连接门（join gates），每 1 µg 质粒使用 4 单位酶，反应 1 小时（见表 8）；使用切刻酶 Nt.BstNBI 在 55 °C 下消化叉状门（fork gates），每 1 µg 质粒使用 8 单位酶，反应 1 小时（见表 9）。 
	注意：步骤 4.2 可去除酶切缓冲液，并有助于在动力学实验前浓缩门结构。对于连接门可省略步骤 4.2，因为限制性内切酶 PvuII-HF 与切刻酶 Nb.BsrDI 使用相同的消化缓冲液。在步骤 4.2.8 中使用无核酸酶水（Nuclease free H2O）而非 TE 缓冲液，是因为 EDTA 是二价阳离子的螯合剂，可能抑制依赖这些离子发挥活性的限制性内切酶。 
	注意：过量添加酶可能导致初始电路泄漏水平较高（图 4），这很可能是由于过度消化所致46。该问题可通过优化酶用量来解决（见图 4）。酶用量的典型范围为每 1 µg 质粒 1–10 单位。</li>
</ol>
5. 单链寡核苷酸的制备
注意：本节描述了用于信号链和辅助链的化学合成单链DNA（ssDNA）的重悬和定量方案。链序列见表10。请注意，以下方案为制备10 µM ssDNA的示例，其他浓度的ssDNA可参照类似方法制备。
<ol>
	<li>从DNA供应商处收到寡核苷酸后，将含有DNA的离心管在10,000-14,000 × g下离心1分钟，以确保所有干燥的DNA均沉降至管底。</li>
	<li>使用1×三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（EDTA）缓冲液（TE缓冲液：10 mM Tris和1 mM EDTA，pH 8.0）重悬DNA，使其终浓度为100 µM。例如，将8 nmol的DNA溶于80 µl TE缓冲液中。</li>
	<li>在微量离心管中，取10 µl浓度为100 µM的DNA与90 µl分子级水混合，所得终浓度应为10 µM。</li>
	<li>按照制造商说明书，使用分光光度计测定DNA样品的准确浓度。以下步骤举例说明如何测定DNA浓度。
	<ol>
		<li>用2 µl分子级水作为空白对照校准分光光度计。</li>
		<li>测定DNA样品在260 nm处的吸光度（A260）。使用以下公式计算原始浓度。 
		注意：样品浓度计算公式为 M = A260/消光系数。消光系数可在DNA供应商提供的规格数据表中查得。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 荧光报告分子的制备
注意：本节描述了制备ReporterC，其他荧光报告基因可采用类似方法构建。
<ol>
	<li>订购经高效液相色谱（HPLC）纯化的寡核苷酸 ROX-&#60;c* tc*&#62; （上链的 报告基因C）和 &#60;c&#62;-RQ（互补链的3'端） 报告基因C）来自DNA制造商（参见 表10 用于序列。</li>
	<li>收到合成的寡核苷酸后，按照步骤5所述方法重悬并定量样品。</li>
	<li>将报告基因的上游链和下游链混合（即， ROX-&#60;c* tc*&#62; 和 &#60;c&#62;- RQ) 溶于含 12.5 mM Mg 的 1× Tris-乙酸-EDTA (TAE) 缓冲液中2+ （参见 表 11 （详见配方）。注意，此处使用30%过量的淬灭剂标记链 &#60;c&#62;-RQ 的加入用于组装报告分子，可确保所有荧光标记链均被淬灭，即使化学计量比不完全理想。</li>
	<li>退火处理 报告基因C 使用热循环仪将复合物从95 °C以1 °C/min的速率降温至20 °C。样品可在4 °C保存。</li>
</ol>
7. 荧光测量
注意：本节描述了荧光动力学测量的一般实验方案（实验步骤见图5），该方案将在步骤8、9和10中使用。另请注意，本方案适用于使用荧光分光光度计。 alternatively，这些实验也可在酶标仪中进行，但在长期实验中可能存在灵敏度、孔间差异以及温度控制不佳等问题。
<ol>
	<li>将温度控制器设置为 25 °C，并等待温度稳定。使用温度控制器可减少因温度波动引起的信号差异。</li>
	<li>在荧光分光光度计的数据采集软件中设置合适的动力学测量参数。具体示例设置如下：
	<ol>
		<li>将激发和发射单色器的狭缝宽度均设置为 2.73 nm。</li>
		<li>每 60 秒时间点的积分时间为 10 秒，总测量时间为 24 小时。</li>
		<li>设置激发/发射波长以匹配实验中使用的荧光染料。示例波长如下：ROX（588 nm / 608 nm）和 TAMRA（559 nm / 583 nm）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向合成石英比色皿中加入无核酸酶水（Nuclease free H2O）和含有 125 mM Mg2+ 的 10x Tris-乙酸盐-EDTA 缓冲液（10x TAE/Mg2+）。有关使用体积的示例，请参见表 12、13 和 14。</li>
	<li>加入 polyT 链，使其终浓度约为 1 µM（体积参见表 12、13 和 14），然后将合成石英比色皿涡旋振荡 10–15 秒。通常，移液器吸头会非特异性结合 DNA。加入高浓度的 polyT 链可减少此类非特异性结合误差。</li>
	<li>加入报告链和辅助链。有关使用体积的示例，请参见表 12、13 和 14。注意：在进行报告链校准时，无需添加辅助链。</li>
	<li>加入 10% 十二烷基硫酸钠（SDS），使其终浓度为 0.15% SDS。注意：使用 SDS 是为了使酶从质粒来源的门结构上解离，因为酶可能干扰链置换反应（参见图 6）。此处推荐使用 SDS 而非热变性来失活酶，以避免门链解离后发生错误重组，从而对电路功能产生不利影响。</li>
	<li>[报告链校准时跳过此步骤。]
	<ol>
		<li>向合成石英比色皿中加入连接门（join gate）和分叉门（fork gate）（体积参见表 13 和 14），并通过上下吹打至少 20 次混匀溶液（切勿涡旋振荡比色皿，因为含 SDS 的溶液经涡旋可能产生气泡，从而影响荧光动力学测量）。</li>
		<li>此外，应尽快进入后续测量步骤，因为一旦将连接门和分叉门加入合成石英比色皿，泄漏反应即刻开始。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将合成石英比色皿放入荧光分光光度计的样品室中。</li>
	<li>开始动力学测量。</li>
	<li>测量 5 分钟后，向合成石英比色皿中加入输入链（体积参见表 12、13 和 14），并通过上下吹打至少 20 次混匀反应体系。注意应轻柔混匀样品以避免产生气泡。此步骤应在数据采集程序暂停期间进行，以避免外部光线引发的信号被记录。</li>
	<li>持续记录反应动力学直至达到稳态。反应动力学曲线将&#160;实时显示在&#160;计算机上。</li>
</ol>
8. 校准荧光报告分子
注意：本节描述了荧光报告分子校准曲线的制备方案。校准曲线将用于将任意荧光单位转换为摩尔信号浓度。
<ol>
	<li>按照第7步所述方案校准荧光报告分子。使用反应物和缓冲液的体积详见下表总结。 表12标准浓度在此示例中为 50 nM（1x）；报告分子为 3x；输入为 1x。对于输入 &#60;tc c&#62; 分别为 0.25x、0.5x、0.75x 时，调整无核酸酶水的体积2O相应地调整以使每个反应的最终体积为600 µl。示例数据如下所示： 图7A.</li>
	<li>制作标准曲线 报告基因C 通过最终荧光值与信号初始浓度的线性拟合 C （示例标准曲线如图所示） 图7B该标准曲线可用于将任意荧光单位转换为其对应的信号浓度。</li>
</ol>
9. 定量质粒来源的 ndsDNA 门控浓度
注意：每个独立处理的质粒来源的 ndsDNA 门控产物所得到的功能性门控产量均不相同，本部分描述了一种用于定量质粒来源的 ndsDNA 门控浓度的方案。
<ol>
	<li>按照第7步所述的方案，测定质粒来源的ndsDNA门的浓度。使用的试剂体积详见表13。注意：表13描述的是ForkBC定量的一个示例配方。JoinAB及其他门的测定可采用类似方法，但需使用不同的输入链、辅助链和报告分子。</li>
	<li>利用第8.2步的校准曲线，将本实验测得的最终荧光值转换为信号C的浓度，再反推出ndsDNA门的浓度。例如，根据图7B中的校准曲线，门定量实验测得的最终荧光值对应于25 nM的信号C（0.5倍稀释）。由于ForkBC的储备液在此反应中被稀释了40倍，因此该ForkBC门的储备液浓度为1 µM。</li>
</ol>
10. 反应动力学测量 A+B-&#62;B+C
注意：本节描述了一种利用荧光动力学测量来检测形式化学反应的DNA实现的实验方案。
<ol>
	<li>按照第7步所述方案进行动力学测量。所用试剂和缓冲液体积详见表14。</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, D. Y., Seelig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+DNA+nanotechnology+using+strand-displacement+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem%22%5BJournal%5D)">Dynamic DNA nanotechnology using strand-displacement reactions.</a> Nat. Chem. 3, 103-113 (2011).</li>
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作者声明不存在竞争性财务利益。

本文介绍了一种从高纯度质粒DNA中制备ndsDNA门控元件的方法。此外，还提供了一种利用荧光动力学检测法表征门控性能的实验方案。实验数据显示，即使合成系统所用的寡核苷酸链经过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化，质粒来源的系统性能仍优于其合成对应物。质粒来源门控元件性能提升的主要原因可能是生物来源DNA的极高纯度。合成DNA含有多种错误，尤其是缺失突变，会导致产生长度小于n-1的寡核苷酸；这类副产物通常无法通过PAGE或高效液相色谱（HPLC）纯化步骤完全去除。在之前一项关于使用生物来源DNA的催化发夹放大器的研究中，也观察到了与此处报道类似的性能提升21。
然而，即使使用质粒来源的门控元件，也无法完全消除门控功能中的错误，其原因至少有两个：首先，过度消化或切割精度不足可能导致门控元件出现过多切口或切口位置错误。无论哪种情况，门控元件都更易参与非预期的反应。通过优化所用酶的用量，可缓解此类问题（见图4）。其次，在这些实验中，大多数输入链和辅助链均为合成DNA，因此含有缺失或突变。理论上，所有单链输入链和辅助链也可通过切口酶消化预先编码的m13病毒基因组质粒DNA获得26。或许使用来源于细菌基因组的单链DNA可进一步提升电路性能。
尽管使用质粒来源的门控元件可提高电路性能，但对成本和处理时间的分析表明，虽然质粒来源门控元件的生产成本略低（表15），但其处理时间比使用商业合成寡核苷酸进行门控元件组装和纯化的时间长2至3倍（表16）。质粒来源门控元件的主要成本在于基因合成以及限制性内切酶的使用。对于300 pmol的门控元件（足以进行15次反应，每次30 nM），Join门控元件的估计成本约为170美元，Fork门控元件约为200美元，成本差异主要源于使用了不同的切刻酶。相比之下，相同门控元件的化学合成链成本约为260美元，其中包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化费用。质粒来源门控元件的主要时间成本在于克隆过程，这一过程与DNA合成类似，可外包给基因合成公司完成。然而，一旦构建完成，质粒来源门控元件的优势在于宿主质粒易于复制，并可保存为细菌甘油菌种的形式，从而实现门控元件的多次重复使用。
展望未来，质粒来源的逻辑门性能提升后，有望实现比目前DNA化学反应网络（CRNs）实验所展示的更为广泛的动态行为。例如，近期的理论研究47,48表明，通过反应-扩散机制，可在宏观尺度上利用DNA CRNs实现自组织的空间图案。本文所提出的方法为构建此类自图案化DNA材料所需的分子组分提供了可行路径。尽管具有挑战性，以可编程方式开发宏观形态将在生物材料研究到再生医学等多个领域产生重要意义。

沃森-克里克碱基配对的可预测性使得动态DNA纳米技术成为一种可编程的设计具有动态特性的分子装置的方法1,2。特别是DNA链置换——一种可编程的竞争性杂交反应——已被证明是构建动态DNA系统的有力机制。在DNA链置换反应中，一条输入的寡核苷酸会将先前与其互补结合伙伴结合的“输出”链置换下来。多个此类反应可以串联形成多步反应级联，从而高度可控地调控各个反应步骤的顺序和时间进程3。DNA链置换级联已被用于构建数字和模拟分子电路4-7、可切换的纳米结构8-10、自主分子马达11-15以及非共价催化放大器13,16-21。此外，利用计算机辅助设计软件，可以对基于链置换反应的DNA装置进行模拟与设计，以实现多种应用22-24。
目前，化学合成的DNA是DNA纳米技术的主要材料。然而，DNA合成过程中的错误以及由此产生的不完美寡核苷酸被认为会引发错误的副反应，从而限制动态DNA器件的性能。例如，在没有反应触发条件的情况下，“泄漏”反应仍可能导致输出寡核苷酸的释放。这种效应在自催化反应级联中尤为明显，即使初始泄漏量极小，最终也可能导致整个级联反应被完全激活19,20。相反，许多反应常常无法达到预期的激活水平，因为某些组分即使在存在目标输入的情况下也无法被触发7,25。为了使基于DNA的纳米器件的性能能够与生物体内基于蛋白质的对应系统相媲美，必须大幅降低此类错误模式的发生率。
细菌质粒或其他生物来源的DNA可作为纳米技术应用中相对廉价且高纯度DNA的来源。通过在细菌中复制可大量生成DNA，而生物系统固有的校对能力则确保了所得DNA的纯度。事实上，近年来已有数篇论文认识到生物DNA在纳米技术应用中的潜在用途21,26-28。然而，质粒DNA完全双链的性质迄今限制了其作为构建动态DNA器件材料的应用，因为这类器件通常由多个寡核苷酸组成，并包含双链和单链区域。在最近的一项研究29中，这一问题得到了解决，提出了一种新型DNA门结构，其主要由切口双链DNA（ndsDNA）构成。
重要的是，可以设计出实现任意形式化学反应网络（CRN）动力学的ndsDNA门控系统29。因此，原则上ndsDNA门可用于构建表现出振荡与混沌、双稳态与记忆、布尔逻辑或算法行为的动力学系统30-38。例如，参考文献29展示了一个包含三个反应的CRN，实现了“共识”协议的分子层面实现，这是一种分布式计算算法29,39,40。该研究首次展示了CRN形式体系作为一种“编程语言”的新颖用途，可用于快速合成具有功能的分子系统（图1A）。
本文提供了一种从质粒DNA制备ndsDNA门控元件的详细实验方案。首先回顾了序列设计过程，随后介绍了如何将包含门控序列的合成寡核苷酸克隆至质粒中，并通过细菌培养进行序列验证与扩增。接下来，阐述了通过酶法处理从质粒中获得ndsDNA门控元件的方法（见图2）。最后，概述了利用荧光动力学检测法测试门控元件功能特性的方法。
反应机理 
以催化化学反应为例，本实验方案重点阐述了该反应过程 A+B-&#62;B+C物种 A，B 和 C （“信号”， 图1B）均对应一条不同的单链DNA分子。这些分子的序列完全独立，且各链之间不会直接发生反应。所有信号序列均包含两个不同的功能区段， 即， 在链置换反应中协同作用的亚序列：1）用于启动链置换反应的短链趾域（标签为 ta、tb、tc）；以及 2）决定信号身份的长链域（标签为 a、b、c）。
信号链之间的相互作用由切口双链DNA（ndsDNA）门控复合物（称为JoinAB和ForkBC）以及辅助单链物种（&#60;tr r&#62;、&#60;b tr&#62;、&#60;c tb&#62;和&#60;i tc&#62;）介导。形式反应A+B-&#62;B+C通过一系列链置换反应步骤实现，其中每个反应步骤暴露出一个后续反应所需的趾区（toehold）（图1B）。在此示例中，信号A和B初始时游离于溶液中，而信号C则结合在叉形门上。反应结束时，B和C均存在于溶液中。更普遍地，结合在门上的信号处于非活性状态，而游离于溶液中的信号则处于活性状态，即可作为输入参与链置换反应。该反应的时间进程通过荧光报告策略进行监测（图1C）。在先前的研究29中已证明，该反应机制不仅能实现目标反应的正确化学计量比，还能准确模拟其反应动力学。

<table><tbody><tr><td>含HF缓冲液的Phusion高保真PCR预混液</td><td>NEB</td><td>M0531S</td><td></td></tr><tr><td>PvuII-HF</td><td>NEB</td><td>R3151L</td><td></td></tr><tr><td>PstI-HF</td><td>NEB</td><td>R3140S</td><td></td></tr><tr><td>吉布森组装预混液</td><td>NEB</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>改良型优质肉汤</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T0918-250G</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep旋转柱小量提取试剂盒（250）</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Hispeed Maxi-prep 大量提取试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>12662</td><td></td></tr><tr><td>Nb.BsrDI</td><td>NEB</td><td>R0648L</td><td></td></tr><tr><td>Nt.BstNBI</td><td>NEB</td><td>R0607L</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>双链基因组片段</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horiba Jobin-Yvon Spex Fluorolog-3 荧光光谱仪</td><td>Horiba/Jobin Yvon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>合成石英比色皿&amp;nbsp;</td><td>Starna</td><td>23-5.45-S0G-5</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN凝胶回收试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>质粒骨架</td><td>BioBrick</td><td>E0240-pSB1A2</td><td>具有氨苄青霉素抗性的高拷贝数质粒。序列可从 http://parts.igem.org 获取</td></tr></tbody></table>

基于质粒dna的链置换门用于实现化学反应网络

Plasmid-derived DNA Strand Displacement Gates for Implementing Chemical Reaction Networks

DNA纳米技术需要大量高纯度的DNA作为工程材料。质粒DNA可能满足这一需求，因为它具有高保真复制能力，可通过细菌培养轻松扩增，并能以细菌甘油菌种的形式无限期保存。然而，质粒DNA的双链性质迄今阻碍了其在构建通常包含单链或分支结构域的DNA纳米结构或装置中的高效应用。在近期的研究中发现，可从质粒DNA中获得切口双链DNA（ndsDNA）的链置换门元件。以下是一份详细的操作方案，介绍如何在质粒中高效编码这些ndsDNA门元件，并通过少量酶促处理步骤从质粒中制备获得。同时提供了一种利用荧光动力学测量来测试ndsDNA门元件的操作流程。ndsDNA门可用于实现任意的化学反应网络（CRNs），从而为将CRN形式体系作为指导性的分子编程语言提供了可行路径。为展示该技术，构建了一个具有催化动力学特性的多步反应级联。此外，结果表明，来源于质粒的组件性能优于由合成DNA组装而成的相同组件。

本方案描述了一种从质粒中构建DNA链置换门并利用荧光动力学测量对其进行测试的方法。这些门可模块化地组合成多组分系统，以模拟形式化学反应网络（CRN）的行为，展示了将CRN作为分子编程语言的一种新用途。

基于质粒DNA的链置换门用于实现化学反应网络

DNA 纳米技术需要大量高纯度的 DNA 作为工程材料。质粒 DNA 可以满足这一需求，因为它能够在宿主细胞内高效复制……

本实验的总体目标是从细菌质粒中制备DNA链置换门。该技术的主要优势在于利用细菌质粒作为高纯度的来源，从而生成稳定的DNA门结构。演示本实验操作的将是我的同事Sam Dip以及本人。首先，按照随附的文字版实验方案及厂商说明书中的指示，使用DNA提取试剂盒大量制备并分离含有DNA门的质粒。使用标准技术测定质粒DNA的浓度。然后，每毫克质粒加入四个单位的限制性内切酶PV U2 HF进行DNA消化。接着，向样品中加入两倍体积的预冷无水乙醇。将混合物在负80摄氏度下孵育至少一小时，以沉淀DNA。然后在0摄氏度、10,000至14,000 ×g条件下离心样品30分钟，使沉淀的DNA形成沉淀颗粒。弃去上清液，并向样品中加入1000微升室温的95%乙醇。然后将样品上下颠倒10至15次，接着在4°C条件下以10,000至14,000 × g离心10分钟。离心结束后，弃去上清液，并将DNA在实验台上风干10至20分钟。从沉淀的DNA中去除上清液时，注意不要扰动沉淀物，否则得率将显著降低。干燥后，加入最多 200 µL 无核酸酶水重悬 DNA 沉淀，并涡旋混匀。加入超过 200 µL 的水通常会使样品过于稀释而无法使用。在动力学实验中，按照制造商说明书，使用分光光度计测定重悬后的 DNA。然后每1微克质粒加入4单位的切刻酶M-B-B-S-R-D，并加入相应的酶缓冲液。在65摄氏度孵育样品1小时，以消化连接门。接着，每1微克质粒加入8单位的切刻酶NT BST mb及相应的酶缓冲液，消化叉状门。将样品在 55 摄氏度下孵育 1 小时。首先复苏荧光报告分子，按照随附的文字版实验方案所述，重悬并定量样品。然后在含有 12.5 毫摩尔氯化镁的 Tris-乙酸-EDTA 缓冲液中，将 10 微升报告分子的底链与 13 微升顶部淬灭链混合。为了确保所有发夹结构完全淬灭，应加入过量30%的淬灭剂标记链。接下来，使用PCR仪退火报告链C复合物。以每分钟1摄氏度的速率，将样品从95摄氏度冷却至20摄氏度。完成校准后，将样品在4 °C下保存。在温度稳定期间，首先将温度控制器设定为25 °C，然后开始荧光测定。在数据采集软件中设置合适的动力学测量参数。打开光谱荧光仪软件后，将激发和发射单色器的狭缝宽度均设置为 2.73 纳米。然后将积分时间设置为每第 62 个时间点 10 秒，并将总测量时间设置为 24 小时。最后，将激发和发射波长设置为与实验中使用的荧光染料相匹配。接下来，向合成石英比色皿中加入 410.2 µL 无核酸酶水和 52.8 µL 含有 125 mM 镁离子的 10 倍醋酸盐 EDTA 缓冲液。再加入 2 µL 浓度为 300 µM 的 poly T 链，然后将合成石英比色皿涡旋振荡 10 至 15 秒。随后加入 9 µL 浓度为 10 µM 的报告链以及每种辅助链各 6 µL（浓度均为 10 µM）。然后加入45微升的关节门和叉状门，浓度均为1微摩尔，并通过上下吹打至少20次轻轻混匀溶液。最后加入9微升10%十二烷基硫酸钠，使终浓度达到0.15% SDS，立即通过上下吹打至少20次轻轻混匀反应体系，随后将合成的四联体细胞迅速放入光谱仪的样品室中，并开始动力学测量。在测量5分钟后，加入3微升的输入链。向合成四细胞中加入10 µM。在数据采集程序暂停期间，用移液器轻轻吹打反应液至少20次以混匀，然后关闭光罩，继续记录反应动力学，直至达到稳态。本实验展示了血浆来源门控和合成门控的动力学数据。信号链A的浓度保持恒定，而催化信号B的量则进行变化。信号C用于在不中断反应的情况下读取反应进程。催化循环周转数定义为在给定时间内每个催化剂B所产生的信号C的量。对于一个理想的催化体系，只要底物不成为限制因素，其转换数应随时间呈线性增加，并且与催化剂的用量无关。此处观察到，与血浆来源体系相比，合成体系更早地偏离了理想的线性增长趋势，表明催化剂通过某种不利的副反应被隔离或失活。本文还比较了血浆来源和合成门控装置的电路泄漏情况，发现反应进行10小时后，使用血浆来源门控装置的泄漏信号比率比使用合成门控装置的低约8%。观看本视频后，您应能够充分理解如何从细菌质粒构建稳定的DNA门控系统，并利用荧光动力学测量技术对这些门控系统进行检测。

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Research

科研

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Biology

生物学

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从DNA折纸设计一种生物响应机器人

定制质粒的合成过程费时费力。本实验方案描述了使用吉布森组装克隆技术来减少定制DNA克隆所需的工作量和时间。该方案还能以与传统“剪切-粘贴”DNA克隆相似的成本，获得可靠的用于哺乳动物表达的带标签蛋白载体。...

利用Gibson组装技术构建在人延伸因子-1α启动子调控下表达FLAG标签蛋白的质粒载体

本文介绍了一种在液体处理机器人上使用模块化克隆DNA组装方法实现模块化DNA“元件”组装的自动化工作流程。该方案采用一种直观的软件工具，用于生成组合式DNA元件文库的液体处理工作站移液清单，并通过两个液体处理平台进行了演示。...

模块化DNA器件的自动化机器人液体处理组装

本文介绍了一系列用于开发工程化细胞和功能化表面的实验方案，这些方案能够使合成工程化的大肠杆菌（E.

利用合成生物学构建可与可编程材料相互作用的活细胞

我们详细描述了6×6网格可重构DNA手风琴支架的设计、模拟、湿实验及分析的完整实验方案。...

可重构DNA手风琴支架的设计与合成

我们描述了一种简单的光刻方法，用于将基因长度的DNA分子固定在表面，该方法可用于在生物芯片上进行无细胞基因表达实验。...

利用多步链置换光刻技术实现基因的功能性表面固定

本文介绍了一种实验方案，用于：i）利用CyanoGate模块化克隆工具包构建一种可自我复制的载体；ii）通过接合转移将该载体导入蓝细菌宿主；以及iii）使用酶标仪或流式细胞术对转基因蓝细菌菌株进行表征分析。...

利用CyanoGate模块化克隆工具包通过接合进行蓝细菌的遗传改造

本实验方案旨在提供一份详细的分步指南，用于基于Golden...

使用模块化Golden Gate克隆技术快速组装多基因结构

我们描述了一种新型DNA锚定的T7...

DNA锚定的RNA聚合酶用于可编程的体外转录与分子计算

基于CRISPR-Cas系统与抗CRISPR蛋白的基因数字电路

体内组装是一种不依赖连接酶的克隆方法，该方法依赖细菌内在的DNA修复酶通过同源重组将DNA片段组装在一起。该方案既节省时间又降低成本，所需试剂很少，且克隆效率可高达99%。...

使用 体内 高效质粒构建组装

了解如何从细菌质粒中提取DNA链置换门，并通过荧光动力学测量进行测试。该方法利用高纯度质粒DNA生成稳健的分子门，用于构建多组分化学反应网络系统。

基于质粒DNA的链置换门用于实现化学反应网络

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