利用Gibson组装技术构建在人延伸因子-1α启动子调控下表达FLAG标签蛋白的质粒载体

本实验的总体目标是利用吉布森组装（Gibson assembly）方法，构建包含来自多个不同DNA来源的短片段和长片段的大型复杂DNA结构。首先通过计算机设计质粒的完整核苷酸序列，然后设计具有重叠区域的引物组。接下来通过PCR扩增组装反应所需的DNA模板。

接下来，对PCR产物进行纯化。最后一步是将所得质粒进行组装反应转化，并对质粒克隆进行验证。最终，利用Gibson组装反应平行构建包含在人延伸因子1α启动子转录调控下的野生型和突变型CSTF 64蛋白的flag标签版本的质粒。

与传统的DNA克隆等现有方法相比，该技术的主要优势在于能够并行地构建设计相似的野生型和突变型质粒，而无需进行连续的克隆步骤。设计一条连续的核苷酸序列以代表最终的质粒。然后列出将用作PCR模板的实际质粒和DNA片段；对于不易获得的DNA片段，例如不同组合的标签和启动子，可将其作为单个或多个合成的双链DNA片段进行订购。

接下来，将最终构建体的连续核苷酸序列分割为适合进行PCR的DNA片段。确认这些片段与现有的质粒和合成DNA片段相匹配。避免使用小于200个核苷酸的DNA片段。

接下来，为了访问引物生成工具，在“更改Gibson组装设置”弹出窗口中选择“设置偏好”菜单。选择“更改预设”选项卡，然后选择“构建构建体”菜单，以将分割的DNA片段从5'端到3'端依次插入引物生成工具中。打开“输入载体或插入片段”窗口，粘贴代表载体DNA 5'端的第一个DNA片段（fastA格式），并为该DNA片段命名。

选择合适的方法获取DNA片段，然后点击继续选项卡。如果需要在最终构建体的连接处添加额外的核苷酸或限制性酶切位点，则在正向或反向引物间隔区域中打开“添加并插入片段至组装窗口”。

将额外的核苷酸或限制性酶切位点仅添加到其中一个DNA片段中，然后单击“完成”标签。对所有片段重复此操作，直至完成整个构建。

选择“查看引物”菜单并检查引物序列。同时对所有构建体、载体、骨架、插入片段或不同的DNA片段重复此操作。将PCR引物用无菌水或TE缓冲液稀释至10微摩尔。

然后将所有DNA模板和用于PCR的单链合成DNA用无菌水稀释至每微升含1纳克。在室温下配制PCR反应体系，加入2.5微升浓度为10微摩尔的每种引物，1微升浓度为每微升1纳克的模板DNA片段，25微升Hot。

加入起始校对DNA聚合酶和19微升水。轻轻弹击离心管混匀，并通过短暂离心收集液滴。根据所用DNA聚合酶的建议，在不同的离心管中同时扩增大小相似的DNA片段。

进行25至28个PCR循环，或确定能够产生足够DNA产量的循环数。取5 µL PCR产物，采用标准AROS凝胶电泳进行分离。确认可见一条代表PCR产物的单一DNA条带。

如有必要，使用DNA分子量标准品确定DNA片段的大小和相对含量，重复PCR以获得足量的DNA片段。将经DPNⅠ预消化的PCR产物转移至1.5毫升离心管中，每管加入81微升DNA纯化磁珠。室温孵育混合物10分钟。

将离心管置于磁力架上静置两分钟。弃去上清液。用200 µL 80%乙醇洗涤两次，每次30秒。

然后将干燥的磁珠重悬于10微升10毫摩尔/升Tris盐酸缓冲液（pH 8.0）中。孵育2分钟后，短暂离心，将离心管置于磁力架上2分钟。吸取8.5至10微升澄清溶液，转移至新的预先标记好的离心管中。通过紫外分光光度法测定DNA片段的浓度。

使用至少 100 纳克代表载体骨架的 DNA 片段或携带筛选标记的 DNA 片段。计算将用作插入片段的 DNA 片段的三倍摩尔过量。将计算好的 DNA 片段用量混合于 PCR 管中。

然后将体积调至10微升。加入10微升Gibson组装主混合液。在PCR仪中于50摄氏度孵育反应体系。

将组装产物转化至不具备转化能力的大肠杆菌中，或在需要时将产物于-20摄氏度保存。按照随化学感受态或电感受态细胞提供的转化步骤进行操作。通常每次转化反应使用2 µL的组装反应产物。

最后，使用特异性或通用引物通过DNA测序确认DNA克隆是否成功，并分析测序数据的准确性。本实验旨在克隆剪切刺激因子蛋白64（CSTF 64）以及突变型CSTF 64。

在 HE F1 alpha 启动子表达调控下，与三重 flag 标签融合的蛋白质。含有 HE F1 alpha 后接三重 flag 标签的质粒我们无法获得。但是，以下质粒可供使用。

含有 PC DNA 3.1 M hiss HF 一个 alpha 和小鼠 CSTF 64 的质粒。该构建体的完整序列通过核苷酸序列和文本编辑软件组装而成。随后，该序列被分为四个易于操作的片段，分别对应于现有的质粒 DNA。

通过 PCR 扩增了用于组装反应的四个 DNA 片段。对单个克隆中获得的质粒进行扩增，并通过限制性酶切分析验证其是否正确组装至 pcDNA 载体中。选择正确的克隆进一步通过测序验证。一旦掌握组装技术，包括质粒设计和引物设计，后续的 PCR 扩增和转化验证可在五天内完成（不包括引物合成和人工 DNA 合成与递送所需时间）。