Name: 质粒载体产生表达FLAG标记的蛋白质在人延伸因子1α启动子的使用吉布森大会规则 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 学习使用吉布森组装克隆技术构建含FLAG标签CSTF64蛋白的质粒载体，通过PCR扩增、产物纯化和转化等步骤，在人延伸因子1α启动子调控下实现野生型和突变型质粒的并行合成，显著缩短克隆时间并提高遗传工程效率。

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我们感谢德克萨斯理工大学健康科学中心（德克萨斯州卢博克）的 Michaela Jansen 和匹兹堡大学医学中心（宾夕法尼亚州匹兹堡）的 Mladen Yovchev 慷慨提供含 pcDNA 3.1 myc-His (A) 和 hEF1α 启动子的质粒。本研究工作得到了美国国立卫生研究院国家儿童健康与人类发育尤妮斯·肯尼迪·施莱弗研究所资助号 R01HD037109（授予 CCM）的支持。额外支持来自劳拉·布什妇女健康研究所（授予 CCM 和 PNG）。本文内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。
作者声明不存在任何竞争性经济利益。

1. 计算机模拟 质粒设计与重叠引物的制备
注意：此步骤的目的是组装构建体的完整核苷酸序列，并设计用于通过重叠延伸克隆（GA克隆）生成具有重叠末端片段的引物。
<ol>
	<li>设计一条连续的核苷酸序列以表示最终的质粒。</li>
	<li>获取或列出将用于PCR的模板的实际质粒和DNA片段。 
	注意：对于不易获得的DNA片段——例如不同组合的标签和启动子——可订购为单条或多条合成的双链DNA片段（sDNA）。这些片段可商业获取，成本相对较低，长度可达2 kb（参见材料表）。</li>
	<li>将第1.1步中组装的连续核苷酸序列划分为适合PCR的DNA片段。确认这些片段与可用的质粒和sDNA片段匹配。避免使用小于200 nt的DNA片段。</li>
	<li>访问引物生成工具（参见设备表）。选择“设置偏好”菜单。在“更改Gibson组装设置”弹出窗口中，点击“CHANGE PREFS”选项卡，选择合适的设置。 
	注意：引物设计也可不使用引物生成工具完成。然而，使用该工具可简化设计过程。</li>
	<li>通过选择“构建载体”菜单开始构建载体。将划分后的DNA片段按从5’到3’端的顺序依次插入引物生成工具中。 
	注意：用作质粒骨架的DNA片段可方便地分为两部分。在最终的PCR产物中，该第一片段的5’端与最后一个片段的3’端连接，形成一条代表载体骨架的连续DNA片段。</li>
	<li>将代表载体DNA 5’端的第一个DNA片段以FASTA格式（核苷酸序列的文本表示形式）粘贴至“输入载体或插入片段”弹出窗口中。为该DNA片段命名。选择获取该DNA片段的适当方式：PCR、限制性酶切（RE Digest）或合成。点击“CONTINUE”选项卡。</li>
	<li>若需在最终构建体的连接处添加额外的核苷酸/限制性酶切位点，请在“向组装中添加插入片段”窗口中提供的“Fwd或Rev引物spacer”区域进行添加。仅向其中一个DNA片段添加额外的核苷酸/限制性酶切位点，而非同时添加至两个片段。点击“DONE”选项卡。</li>
	<li>对所有片段重复上述步骤，直至构建完成。选择“查看引物”菜单并审阅引物序列。</li>
	<li>对所有构建体（载体骨架和插入片段）或不同的DNA片段重复上述过程。</li>
</ol>
2. 使用热启动高保真DNA聚合酶（2x预混液）通过PCR扩增DNA片段
注意：此步骤的目的是通过 PCR 获得足量的 DNA 用于连接反应。
<ol>
	<li>以前一步设计的PCR引物序列订购脱盐产物，并以尽可能小的规格合成。用去离子水或TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 7.9，1 mM EDTA）将引物稀释至10 µM。</li>
	<li>对于不易获得的DNA片段，订购合成的DNA片段（sDNA片段）。</li>
	<li>将所有DNA片段（包括将用作PCR模板的sDNA片段）用去离子水稀释至1 ng/µl。</li>
	<li>在室温下配制PCR反应体系。简而言之，每对引物中各取2.5 µl（来自10 µM的母液），模板DNA片段取1 µl（来自1 ng/µl的母液），加入25 µl高保真热启动DNA聚合酶（DNA pol；2x预混液；参见材料表）以及19 µl去离子水。轻轻弹击管壁混匀，并通过短暂离心收集管壁液滴。</li>
	<li>根据DNA聚合酶的使用说明，在不同的PCR管中同时扩增长度相近的DNA片段。进行25–28个PCR循环，或确定能够产生足够DNA产量的循环数。</li>
	<li>取PCR反应产物总量的10%（5 µl），进行含溴化乙锭（终浓度0.2 µg/ml）的标准琼脂糖凝胶电泳。确认仅出现一条代表PCR产物的DNA条带。利用DNA分子量标准品确定DNA片段的大小及相对含量。如有必要，重复PCR以获得足量的DNA片段。</li>
</ol>
3. PCR 产物的 DpnI 消化
注意：此步骤的目的是消化第2节PCR反应中残留的质粒模板DNA。DpnI仅能消化甲基化的质粒DNA，例如在dam+细菌菌株中培养的质粒DNA所发生的甲基化。因此，如果质粒DNA将用作GA反应中的DNA片段，则不得用DpnI处理。
<ol>
	<li>向第2节中制备的45 µl PCR产物中加入2 µl DpnI限制性内切酶，在37 °C孵育1小时。随后进行第4节操作，或于-20 °C保存备用。</li>
</ol>
4. 利用DNA纯化磁珠对DNA片段进行纯化与浓缩
注意：此步骤的目的是纯化并浓缩在第2和第3部分中获得的PCR产物。也可使用其他PCR纯化方法。
<ol>
	<li>将DNA纯化磁珠平衡至室温。通过短暂涡旋重悬磁珠。</li>
	<li>将经DpnI预消化的PCR产物转移至1.5 ml离心管中，每管加入81 µl DNA纯化磁珠。室温孵育混合物10分钟。</li>
	<li>将离心管置于磁力架上约2分钟。用移液器弃去上清液。用200 µl 80%乙醇洗涤两次，每次30秒。</li>
	<li>让磁珠沉淀自然干燥。保持管盖打开，并将离心管置于磁力架上。</li>
	<li>用10 µl 10 mM Tris-HCl（pH 8.0）重悬干燥的磁珠。室温孵育2分钟。短暂离心，使液体聚集于管底。</li>
	<li>将离心管置于磁力架上2分钟。吸取8.5–10 µl上清液，转移至新的预标记离心管中。通过紫外分光光度法测定DNA片段浓度（见仪器表）。</li>
</ol>
5. 组装克隆反应及产物在 E. coli 中的转化
注意：此步骤的目的是计算插入片段与载体的3:1比例，并进行连接反应。
<ol>
	<li>使用至少 100 ng 代表载体骨架或携带选择标记的 DNA 片段。计算作为插入片段使用的各 DNA 片段所需的 3 倍摩尔过量。</li>
	<li>将每种特定插入片段所需的摩尔过量换算为以 ng 为单位的量。 
	注意：一种便捷的计算方法是使用基于网络的应用程序（参见 设备表）。</li>
	<li>将计算好的 DNA 片段量加入 PCR 管中，并调节总体积至 10 µl。加入 10 µl GA 主混合液（2x，参见 材料表）。在 PCR 热循环仪中，于 50 °C 孵育 1 小时以连接 4–6 个片段，或孵育 15 分钟以连接 2–3 个片段。</li>
	<li>将连接产物直接用于感受态 E. coli 的转化，或将产物在 -20 °C 冻存以备后续使用。</li>
	<li>按照化学感受态或电感受态细胞配套的转化程序操作。通常，每次转化反应使用 2 µl 的连接反应产物。</li>
	<li>转化完成后，将转化后的细胞涂布于添加了相应选择性抗生素的琼脂平板上。</li>
</ol>
6. 质粒提取、限制性酶切与测序
注意：此步骤的目的是从大肠杆菌（E. coli）中分离质粒DNA，然后通过限制性酶切和测序验证构建的正确性。
<ol>
	<li>挑取多个单菌落进行小量培养和质粒提取。使用 2–5 ml 添加适当抗生素的 LB 液体培养基过夜培养。按照所用小量提取试剂盒说明书中的步骤提取相应质粒。</li>
	<li>使用分光光度计测定所获得质粒的数量和浓度。</li>
	<li>取约 0.5 µg 纯化质粒，用一种或多种限制性内切酶进行限制性酶切消化。应选用能产生特异性消化图谱的限制性酶，以区分不同的 DNA 重组构建体。</li>
	<li>利用特异性或通用引物进行 DNA 测序，确认 DNA 克隆是否成功，并分析测序结果的准确性。</li>
</ol>

<ol><li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods in enzymology. 498, 349-361 (2011).</li>
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<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature methods. 6, 343-345 (2009).</li>
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<li>MacDonald, C. C., McMahon, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+mechanisms+of+alternative+polyadenylation%3A+testis%2C+brain%2C+and+beyond.+Wiley+interdisciplinary+reviews%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific mechanisms of alternative polyadenylation: testis, brain, and beyond. Wiley interdisciplinary reviews.</a> RNA. 1, 494-501 (2010).</li>
<li>Sabath, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%27-End+processing+of+histone+pre-mRNAs+in+Drosophila%3A+U7+snRNP+is+associated+with+FLASH+and+polyadenylation+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">3'-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors.</a> Rna. 19, 1726-1744 (2013).</li>
<li>Yang, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+containing+the+CPSF73+endonuclease+and+other+polyadenylation+factors+associates+with+U7+snRNP+and+is+recruited+to+histone+pre-mRNA+for+3%27-end+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">A complex containing the CPSF73 endonuclease and other polyadenylation factors associates with U7 snRNP and is recruited to histone pre-mRNA for 3'-end processing.</a> Molecular and cellular biology. 33, 28-37 (2013).</li>
<li>Grozdanov, P. N., Macdonald, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Sequencing+of+RNA+Isolated+by+Cross-Linking+and+Immunoprecipitation+%28HITS-CLIP%29+to+Determine+Sites+of+Binding+of+CstF-64+on+Nascent+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Sequencing of RNA Isolated by Cross-Linking and Immunoprecipitation (HITS-CLIP) to Determine Sites of Binding of CstF-64 on Nascent RNAs.</a> Methods in molecular biology. 1125, 187-208 (2014).</li>
<li>Youngblood, B. A., Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CstF-64+supports+pluripotency+and+regulates+cell+cycle+progression+in+embryonic+stem+cells+through+histone+3%27+end+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">CstF-64 supports pluripotency and regulates cell cycle progression in embryonic stem cells through histone 3' end processing.</a> Nucleic acids research. , (2014).</li>
<li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one+pot%2C+one+step%2C+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PloS one. 3, e3647(2008).</li>
<li>Irwin, C. R., Farmer, A., Willer, D. O., Evans, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-fusion%28R%29+cloning+with+vaccinia+virus+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">In-fusion(R) cloning with vaccinia virus DNA polymerase.</a> Methods in molecular biology. 890, 23-35 (2012).</li>
<li>Annaluru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+synthesis+of+a+functional+designer+eukaryotic+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome.</a> Science. 344, 55-58 (2014).</li>
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</ol>

开放获取出版和制作费用由 New England BioLabs Inc. 提供。

成功使用GA克隆技术之前，必须仔细设计完整的构建体（图2和图3）。
强烈建议仔细验证由引物生成工具设计的引物序列。尽管可以不使用引物生成工具来设计GA引物，但强烈推荐使用该工具，因为它能简化操作流程。通常，用于GA克隆的引物必须包含两个功能不同的序列区域。第一个区域为DNA片段特异性序列，用于通过PCR扩增目标片段。第二个区域与相邻片段重叠，这是实现GA组装所必需的。典型的DNA片段特异性序列长度应为18–22 nt。用于扩增同一DNA的片段特异性序列应具有相似的熔解温度和GC含量。重叠序列长度至少应为15 nt，且熔解温度至少达到48 °C。当组装超过4个DNA片段时，重叠序列长度应至少为20 nt。更长的重叠区域可提高退火的特异性，从而获得更高比例的正确组装产物。在设计重叠序列时，应避免GC或AT含量偏倚的序列，因为此类偏倚可能影响DNA的正确组装。
我们还建议使用阴性对照，该对照不应产生任何耐药性细菌菌落，仅在基因组组装（GA）反应中产生对应于载体骨架的DNA片段。或者，也可从GA反应中省略构成“插入片段”的其中一个DNA片段，这同样应导致无耐药性细菌菌落生长。其原因在于相邻DNA片段之间缺乏重叠末端，从而无法完成质粒的组装。
在所述方案中，由于所使用的DNA片段数量较多，采用了25 nt的重叠序列来设计引物组（图3）。引物设计工具网站（见设备表）建议，组装4–6个DNA片段时应至少使用20 nt的重叠序列。此外，更长的重叠序列可确保DNA链之间的正确互补配对（见图1），从而提高准确组装产物的数量。
目前，已有多种无缝克隆系统可供使用。然而，其中一些系统仍然使用限制性内切酶（即， 黄金门克隆18）。其他方法则使用基于痘苗病毒DNA聚合酶和来自同一生物来源的单链DNA结合蛋白的专有酶混合物19与GA系统相比，这两种系统的重叠序列较短，因而存在局限性。较短的重叠序列可能无法为相邻DNA片段的退火步骤提供足够的特异性，导致组装超过23个DNA片段时出现困难。而GA系统则不存在这些缺陷。
应考虑待扩增DNA片段的大小，以免超过PCR可靠扩增的长度范围。即， 长度小于8 kbp）。尽管过去10年中DNA聚合酶的功能已有所改进，但大片段DNA的扩增效率和准确性仍然较低。如有需要，可从PCR以外的其他来源获取较大的DNA片段。 例如， 通过质粒分离及使用限制性内切酶进行适当的DNA消化。具体而言，在本论文所述方案中，我们选择PCR的理由是所获得的DNA片段大小均小于5 kbp。若在琼脂糖凝胶电泳中检测到多个PCR产物，建议采用现有的分子生物学技术或合适的试剂盒，对目标片段大小进行凝胶纯化。在本方案中使用了一种耐热DNA聚合酶（见 材料列表）。然而，任何能够提供高保真性和高产量的DNA聚合酶均可适用于本方案。如果使用本方案中未提及的其他高保真DNA聚合酶，请参照相应产品说明书中的建议条件进行设置。在本方案中，使用化学感受态 E. coli 使用GA试剂盒中提供的细胞。或者，使用化学感受态或电感受态细胞 E. coli 可使用 DH5α 或 DH10B 等菌株。
组装克隆2x预混液使用简便，所需手动操作时间极少。但由于需要混合的体积较小，因此要求精确的移液操作。同时，必须始终遵循良好的分子生物学实验技术规范。
GA克隆技术为构建长度超过3 kbp的DNA片段、质粒和载体提供了无限可能。此外，该技术在合成生物学领域具有更广泛的影响，因为它能够实现例如完整细菌（Mycoplasma mycoides）基因组或酵母（Saccharomyces cerevisiae）染色体的合成与组装20,21。该技术也可应用于常规克隆需求，以生成无缝连接的构建体。
综上所述，GA克隆为传统的DNA克隆方法提供了一种快速、可靠且灵活的替代方案。

传统的DNA克隆过程依赖限制性内切酶切割DNA，并利用DNA连接酶将DNA片段连接在一起。构建包含不同DNA片段的定制表达载体是一种顺序性操作，包括使用一种或多种限制性内切核酸酶对DNA进行切割，随后通过连接反应插入DNA片段。该方法的主要缺点是，对于某一DNA片段而言，合适的限制性内切酶可能难以确定（例如，可能具有多个切割位点），从而导致目标全长蛋白的DNA克隆无法成功。因此，在高效且细胞类型特异性的启动子调控下，构建带有定制蛋白标签的表达载体需要极为精细的设计。此外，该技术还耗时且劳动密集。近年来，已有若干研究报道了可在单步或两步反应中同时将多个不同的合成DNA片段按连续序列组装的方法，且无需使用限制性内切酶1-3。这种单步克隆反应（不包括所有前期准备步骤）依赖于DNA外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶2,3的混合酶系以及DNA片段之间的重叠末端（图1）。由于无需使用限制性内切酶，因此任何大小和序列组成（高度重复序列除外）的DNA片段均可无缝融合形成完整的构建体。最近，一种用于单步克隆反应的商用试剂盒（Gibson组装；GA）已上市。该试剂盒可在单一载体中快速、经济高效地组装任意DNA片段，并可定制启动子和蛋白标签。
在哺乳动物细胞培养模型中用于表达外源蛋白的质粒表达载体通常受到病毒启动子，如巨细胞病毒（CMV）或猴病毒40（SV40）启动子的转录调控。这些病毒启动子可在大多数哺乳动物细胞培养模型中实现外源蛋白的高效瞬时表达。然而，在建立稳定表达外源蛋白的细胞系时，常常因CMV或SV40启动子在建系过程中发生转录沉默而导致失败4,5。此外，SV40和CMV病毒启动子在淋巴系来源的细胞或胚胎干细胞中无法有效驱动外源蛋白的表达6,7。克服病毒启动子固有局限性的解决方案是使用强效的组成型非病毒启动子8-10。其中，一个已被充分表征的人源强组成型非病毒启动子是人延伸因子1α（hEF1α）启动子（hEF1α参与催化氨基酰-tRNA在GTP依赖条件下与核糖体的结合11）。然而，含有hEF1α启动子的表达载体不如含病毒启动子的质粒普遍可得，尤其是那些同时在目标蛋白的氨基末端带有3×FLAG标签的载体。
64 kDa 切割刺激因子蛋白（CstF-64）参与大多数 mRNA12,13的3'端加工过程，包括复制依赖型组蛋白 mRNA14,15。CstF-64 在所有体组织中均有表达12。其RNA识别基序可结合新生转录本上切割和多聚腺苷酸化位点下游的富含GU的RNA序列16。CstF-64与前体mRNA的这一结合可促进新生转录本的有效内切核酸酶切割。
本文描述了一种实验方案，该方案利用PCR扩增DNA片段，并使用Gibson组装克隆试剂盒（包含化学感受态细菌细胞），在hEF1α启动子的驱动下，构建在氨基末端带有3xFLAG标签的小鼠CstF-64或突变型CstF-64的定制载体1。

<table><tbody><tr><td>合成双链DNA片段（sDNA）</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>我们使用了gBlocks，其长度可达2 kb。然而，目前市面上有许多可提供合成DNA的商业来源。</td></tr><tr><td>DNA纯化磁珠</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>Agencourt AMPure XP - PCR纯化系统</td></tr><tr><td>质粒提取小量试剂盒</td><td>Omega Bio-Tek Inc</td><td>D6942-01</td><td>E.Z.N.A. 质粒小提试剂盒 I</td></tr><tr><td>Gibson组装克隆试剂盒</td><td>New England BioLabs</td><td>E5510S</td><td></td></tr><tr><td>DNA聚合酶</td><td>New England BioLabs</td><td>M0494S</td><td>Q5 Hot Start高保真2x预混液</td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England BioLabs</td><td>R3131S</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England BioLabs</td><td>R3189S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England BioLabs</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>NanoDrop设备</td></tr><tr><td>EditSeq</td><td>DNASTAR</td><td></td><td>Lasergene核心套件的一部分</td></tr><tr><td>SeqBuilder</td><td>DNASTAR</td><td></td><td>Lasergene核心套件的一部分</td></tr><tr><td>Word</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Microsoft Office的一部分</td></tr><tr><td>NEBuilder</td><td>New England BioLabs</td><td></td><td>引物设计工具：&lt;a href=&quot;http://nebuilder.neb.com&quot; target=&quot;_blank">http://nebuilder.neb.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>NEBioCalculator</td><td>New England BioLabs</td><td></td><td>连接反应计算器：&lt;a href=&quot;http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation&quot; target=&quot;_blank">http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

利用gibson组装技术构建在人延伸因子-1α启动子调控下表达flag标签蛋白的质粒载体

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Gibson 组装（GA）克隆技术为传统的 DNA 克隆方法提供了一种快速、可靠且灵活的替代方案。我们利用 GA 构建了用于在小鼠胚胎干细胞（mESCs）中表达外源基因的定制质粒。在将含有 SV40 或人巨细胞病毒启动子调控的外源基因质粒转染至 mESCs 后，其表达会迅速减弱。解决表达减弱问题的方法之一是采用人延伸因子-1α（hEF1α）启动子来驱动基因表达。然而，含有 hEF1α 启动子的质粒载体不如含有 SV40 或 CMV 启动子的质粒普遍，尤其是同时带有 N 端 3xFLAG 标签的载体更为少见。本文所述的实验方案是一种快速构建在 hEF1α 启动子调控下表达 FLAG 标签 CstF-64 及其突变体的质粒的方法。GA 技术利用 DNA 外切酶、DNA 聚合酶和 DNA 连接酶的混合酶系，实现 DNA 片段重叠末端的克隆连接。根据我们已有的模板 DNA，我们设计将多个片段组装成单一序列。该设计包含四个 DNA 片段：pcDNA 3.1 载体骨架、hEF1α 启动子片段 1、hEF1α 启动子片段 2（其中包含作为双链合成 DNA 片段购买的 3xFLAG 标签），以及 CstF-64 或特定的 CstF-64 突变体。这些片段的序列被上传至引物设计工具，以设计用于扩增 DNA 片段的合适 PCR 引物。PCR 扩增后，将 DNA 片段与含有筛选标记的载体混合，并进行 GA 克隆反应。随后，从单个转化细菌克隆中分离质粒。对质粒的初步筛选通过限制性酶切分析完成，随后进行测序验证。综上所述，利用 GA 技术，我们仅用 5 天时间即成功构建了用于基因表达的定制质粒，包括构建体的筛选与验证。

所遵循的实验方案流程如图2A所示。我们希望在hEF1α启动子的表达调控下，克隆CstF-64及突变型CstF-64蛋白，并使其与3xFLAG标签融合（图2B和图3）。我们无法获得含有hEF1α后接3xFLAG标签的质粒。然而，以下质粒可供使用：pcDNA 3.1 myc-His（A型，由Michaela Jansen慷慨提供）、含hEF1α的质粒（由Mladen Yovchev慷慨提供）以及小鼠CstF-64质粒12（图3）。整个构建体的序列通过核苷酸和文本编辑软件组装完成（图3；见设备表）。随后，该序列被划分为四个便于操作的片段（图2B中的红色区块及图3），分别对应于现有的质粒DNA。使用引物设计工具（见设备表）设计扩增引物，设定条件为生成4至6个片段，最小重叠区域为25个核苷酸，在“更改Gibson组装设置”弹出窗口中进行配置。引物设计中加入了NheI和NotI限制性酶切位点，用于鉴定正确组装的质粒。NheI位点位于pcDNA 3.1与hEF1α启动子5’端之间的引物序列中；NotI位点位于CstF-64终止密码子（UGA）之后，以及pcDNA 3.1载体骨架中。当使用这两种酶同时进行消化时，将释放出包含hEF1α启动子、3xFLAG标签以及CstF-64或突变型CstF-64的DNA片段（见下文及图2B）。引物以最小规模订购并进行脱盐处理。含有3xFLAG标签的hEF1α启动子第二部分DNA片段（490 bp，图2B，图3）作为单条合成DNA片段购买获得（见材料表）。用于组装反应的DNA片段使用DNA聚合酶进行扩增（见材料表）。hEF1α启动子第一部分、hEF1α启动子第二部分、全长及突变型CstF-64的DNA片段在不同管中同时进行28个循环的扩增（图4A），扩增条件遵循DNA聚合酶供应商的建议（见材料表，每个循环包括：98 °C变性7秒，55 °C退火45秒，72 °C延伸90秒）。最初，pcDNA 3.1骨架以相同条件扩增22个循环（仅延伸时间调整为72 °C下3分钟）。然而，所得DNA产量不足以用于组装反应（图4A）。因此，需额外进行一次扩增以获得足够的DNA量。
使用质粒模板获得的PCR产物必须用DpnI限制性内切酶进行消化，以去除质粒DNA，否则该质粒DNA会污染后续的组装反应产物，并产生假阳性的耐药细菌菌落。因此，需用DpnI限制性内切酶对PCR产物进行消化，该酶可切割来自dam+ E. coli菌株的甲基化和半甲基化的质粒DNA。而以合成DNA片段作为模板所获得的PCR产物则无需DpnI消化，因为化学合成的DNA不含甲基化或半甲基化的碱基。
使用DNA纯化磁珠（参见材料表）对DNA片段进行纯化和浓缩，具体操作如方案第4步所述。将用于pcDNA 3.1载体骨架的PCR产物合并，并相应调整所用DNA纯化磁珠的用量。使用分光光度计测定DNA得率（表1和设备表）。CstF-64及突变型CstF-64构建体的连接反应在冰上进行（表1），插入片段（“inserts”）按3倍摩尔过量使用（表1、图3）。将混合DNA片段的终体积用水调整至10 µl，加入10 µl连接反应主混合液（2x）。充分混匀后，在50 °C孵育1小时。同时，按照GA试剂盒说明书推荐的方法设置阳性对照反应，并与CstF-64及突变型CstF-64反应一同孵育。根据方案建议，取各连接反应产物2 µl转化至连接克隆试剂盒提供的化学感受态E. coli中（参见材料表），转化操作按试剂盒说明书进行。通过含氨苄青霉素的LB琼脂平板筛选阳性克隆。每种连接反应随机挑选6个单菌落进行扩增培养。使用质粒提取小量试剂盒（mini kit）提取质粒DNA（参见材料表）。对构建体进行in silico限制性酶切分析，使用NheI和NotI酶切后，CstF-64应产生4,590 bp和3,032 bp两个片段，突变型CstF-64则产生4,590 bp和2,711 bp两个片段（图2B和图4B）；使用HindIII和NotI酶切后，CstF-64应产生5,872 bp、1005 bp和745 bp三个片段，而突变型CstF-64产生5,872 bp、1005 bp和424 bp三个片段（图2B和图4C）。实际对提取的质粒进行酶切后，观察到与预期一致的特征性酶切图谱（图4B,C）。需要注意的是，图4C中CstF-64突变体质粒经HindIII和NotI酶切产生的424 bp DNA片段因片段较小，染色较弱。从6个提取的质粒中选取2个送测序。我们对构建体中的hEF1α启动子区域以及CstF-64或突变型CstF-64部分进行了测序，以确认无缺失、插入或碱基替换。我们强烈建议对本实验或其他基于PCR方法所获得的DNA构建体进行测序验证。测序结果显示，每种构建体中有一个质粒在hEF1α、3xFLAG标签及CstF-64或突变型CstF-64区域的序列完全正确。其余质粒均在对应DNA片段扩增过程中引入了单个碱基突变。将含有CstF-64的质粒转染小鼠胚胎干细胞后，可表达大量外源蛋白，其表达水平与野生型相当17。
<img alt="基因编辑过程示意图；DNA片段、外切酶活性、聚合酶延伸、连接步骤。" src="/files/ftp_upload/52235/52235fig1highres.jpg" width="450" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. Gibson组装机制的示意图。具有重叠末端的DNA片段在单一连续反应中通过恒温条件组装。首先，5’外切酶将重叠末端逐步降解（“咀嚼”），该酶随后随温度升高而逐渐失活。因此，具有重叠末端的不同DNA片段可在恒温条件下退火结合。DNA聚合酶随后填补缺口，耐热DNA连接酶则封闭切口。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52235/52235fig1highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="DNA克隆与验证的Gibson组装流程图及质粒图谱示意图。" src="/files/ftp_upload/52235/52235fig2highres.jpg" width="650" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. (A) 所述组装克隆实验方案的流程图。(B) 使用GA试剂盒构建的质粒pGA-CstF-64的结构示意图。红色——用于组装反应的DNA片段：pcDNA 3.1；人EF1α启动子片段1（hEF1a – 1）；人EF1α启动子片段2（hEF1a – 2），以合成DNA形式订购；小鼠CstF-64（mCstF-64）。蓝色——开放阅读框。紫色——病毒与非病毒启动子。绿色——切割与多聚腺苷酸化区域。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52235/52235fig2highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于基因克隆过程的Gibson组装示意图，包含质粒构建体和DNA片段大小。" src="/files/ftp_upload/52235/52235fig3highres.jpg" width="650" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. Gibson组装CstF-64质粒的设计。 黑色方框表示可用于设计单个Gibson组装CstF-64 in silico 序列的DNA片段。随后，该序列被分为四个DNA片段，并通过PCR扩增。请注意，由于3xFLAG标签尺寸较小，其序列被设计为与hEF1α启动子第2部分一起构成一条短DNA（sDNA）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52235/52235fig3highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="凝胶电泳结果，多个质粒样品中DNA片段的分析，kb标记物梯度。" src="/files/ftp_upload/52235/52235fig4highres.jpg" width="650" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 克隆反应中所用DNA片段的PCR结果及获得质粒的代表性限制性内切酶消化分析。（A）使用热启动高保真2x预混液对组装反应中所用DNA片段进行的代表性PCR结果；（B）代表性质粒hEF1α、全长CstF-64、pcDNA 3.1构建体（pGA-CstF-64）以及hEF1α、突变型CstF-64、pcDNA 3.1构建体（pGA-mutCstF-64）经NheI和NotI酶切后的结果；（C）与（B）相同的质粒经HindIII和NotI酶切后的结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52235/52235fig4highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DNA片段名称</td>
			<td>预期大小 (bp)</td>
			<td>浓度 (ng/µl)</td>
			<td>稀释至 (ng/µl)</td>
			<td>GA CstF-64反应中使用的稀释后体积 (µl)</td>
			<td>GA mutCstF-64反应中使用的稀释后体积 (µl)</td>
			<td>摩尔比 (插入片段:载体)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA 3.1 (载体)</td>
			<td>4,618</td>
			<td>158</td>
			<td>未稀释</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hEF1_ 启动子片段 1</td>
			<td>825</td>
			<td>213</td>
			<td>75</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>3:1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>用于CstF-64的hEF1_ 启动子片段 2</td>
			<td>516</td>
			<td>229</td>
			<td>50</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td>3:1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cstf-64</td>
			<td>1,796</td>
			<td>161</td>
			<td>未稀释</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td>3:1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>用于突变型CstF-64的hEF1_ 启动子片段 2</td>
			<td>516</td>
			<td>199</td>
			<td>50</td>
			<td></td>
			<td>1</td>
			<td>3:1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>突变型CstF-64</td>
			<td>1,448</td>
			<td>201</td>
			<td>171</td>
			<td></td>
			<td>1</td>
			<td>3:1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. DNA片段在磁珠上浓缩、稀释及组装反应体系设置后的得率。

定制质粒的合成过程费时费力。本实验方案描述了使用吉布森组装克隆技术来减少定制DNA克隆所需的工作量和时间。该方案还能以与传统“剪切-粘贴”DNA克隆相似的成本，获得可靠的用于哺乳动物表达的带标签蛋白载体。

利用Gibson组装技术构建在人延伸因子-1α启动子调控下表达FLAG标签蛋白的质粒载体

Gibson 组装（GA）克隆技术为传统的 DNA 克隆方法提供了一种快速、可靠且灵活的替代方案。我们利用 GA 构建了定制的……

本实验的总体目标是利用吉布森组装（Gibson assembly）方法，构建包含来自多个不同DNA来源的短片段和长片段的大型复杂DNA结构。首先通过计算机设计质粒的完整核苷酸序列，然后设计具有重叠区域的引物组。接下来通过PCR扩增组装反应所需的DNA模板。接下来，对PCR产物进行纯化。最后一步是将所得质粒进行组装反应转化，并对质粒克隆进行验证。最终，利用Gibson组装反应平行构建包含在人延伸因子1α启动子转录调控下的野生型和突变型CSTF 64蛋白的flag标签版本的质粒。与传统的DNA克隆等现有方法相比，该技术的主要优势在于能够并行地构建设计相似的野生型和突变型质粒，而无需进行连续的克隆步骤。设计一条连续的核苷酸序列以代表最终的质粒。然后列出将用作PCR模板的实际质粒和DNA片段；对于不易获得的DNA片段，例如不同组合的标签和启动子，可将其作为单个或多个合成的双链DNA片段进行订购。接下来，将最终构建体的连续核苷酸序列分割为适合进行PCR的DNA片段。确认这些片段与现有的质粒和合成DNA片段相匹配。避免使用小于200个核苷酸的DNA片段。接下来，为了访问引物生成工具，在“更改Gibson组装设置”弹出窗口中选择“设置偏好”菜单。选择“更改预设”选项卡，然后选择“构建构建体”菜单，以将分割的DNA片段从5'端到3'端依次插入引物生成工具中。打开“输入载体或插入片段”窗口，粘贴代表载体DNA 5'端的第一个DNA片段（fastA格式），并为该DNA片段命名。选择合适的方法获取DNA片段，然后点击继续选项卡。如果需要在最终构建体的连接处添加额外的核苷酸或限制性酶切位点，则在正向或反向引物间隔区域中打开“添加并插入片段至组装窗口”。将额外的核苷酸或限制性酶切位点仅添加到其中一个DNA片段中，然后单击“完成”标签。对所有片段重复此操作，直至完成整个构建。选择“查看引物”菜单并检查引物序列。同时对所有构建体、载体、骨架、插入片段或不同的DNA片段重复此操作。将PCR引物用无菌水或TE缓冲液稀释至10微摩尔。然后将所有DNA模板和用于PCR的单链合成DNA用无菌水稀释至每微升含1纳克。在室温下配制PCR反应体系，加入2.5微升浓度为10微摩尔的每种引物，1微升浓度为每微升1纳克的模板DNA片段，25微升Hot。 加入起始校对DNA聚合酶和19微升水。轻轻弹击离心管混匀，并通过短暂离心收集液滴。根据所用DNA聚合酶的建议，在不同的离心管中同时扩增大小相似的DNA片段。进行25至28个PCR循环，或确定能够产生足够DNA产量的循环数。取5 µL PCR产物，采用标准AROS凝胶电泳进行分离。确认可见一条代表PCR产物的单一DNA条带。如有必要，使用DNA分子量标准品确定DNA片段的大小和相对含量，重复PCR以获得足量的DNA片段。将经DPNⅠ预消化的PCR产物转移至1.5毫升离心管中，每管加入81微升DNA纯化磁珠。室温孵育混合物10分钟。将离心管置于磁力架上静置两分钟。弃去上清液。用200 µL 80%乙醇洗涤两次，每次30秒。然后将干燥的磁珠重悬于10微升10毫摩尔/升Tris盐酸缓冲液（pH 8.0）中。孵育2分钟后，短暂离心，将离心管置于磁力架上2分钟。吸取8.5至10微升澄清溶液，转移至新的预先标记好的离心管中。通过紫外分光光度法测定DNA片段的浓度。使用至少 100 纳克代表载体骨架的 DNA 片段或携带筛选标记的 DNA 片段。计算将用作插入片段的 DNA 片段的三倍摩尔过量。将计算好的 DNA 片段用量混合于 PCR 管中。然后将体积调至10微升。加入10微升Gibson组装主混合液。在PCR仪中于50摄氏度孵育反应体系。将组装产物转化至不具备转化能力的大肠杆菌中，或在需要时将产物于-20摄氏度保存。按照随化学感受态或电感受态细胞提供的转化步骤进行操作。通常每次转化反应使用2 µL的组装反应产物。最后，使用特异性或通用引物通过DNA测序确认DNA克隆是否成功，并分析测序数据的准确性。本实验旨在克隆剪切刺激因子蛋白64（CSTF 64）以及突变型CSTF 64。在 HE F1 alpha 启动子表达调控下，与三重 flag 标签融合的蛋白质。含有 HE F1 alpha 后接三重 flag 标签的质粒我们无法获得。但是，以下质粒可供使用。含有 PC DNA 3.1 M hiss HF 一个 alpha 和小鼠 CSTF 64 的质粒。该构建体的完整序列通过核苷酸序列和文本编辑软件组装而成。随后，该序列被分为四个易于操作的片段，分别对应于现有的质粒 DNA。通过 PCR 扩增了用于组装反应的四个 DNA 片段。对单个克隆中获得的质粒进行扩增，并通过限制性酶切分析验证其是否正确组装至 pcDNA 载体中。选择正确的克隆进一步通过测序验证。一旦掌握组装技术，包括质粒设计和引物设计，后续的 PCR 扩增和转化验证可在五天内完成（不包括引物合成和人工 DNA 合成与递送所需时间）。

generation-plasmid-vectors-expressing-flag-tagged-proteins-under

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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