质粒载体产生表达FLAG标记的蛋白质在人延伸因子1α启动子的使用吉布森大会规则

该程序的总体目标是使用 Gibson 组装方法创建大型、复杂的 DNA 构建体，该构建体结合了来自多个不同 DNA 来源的短片段和长片段。首先计算设计质粒的完整核苷酸序列，然后设计重叠的引物组。接下来，通过 PCR 扩增用于组装反应的 DNA 模板。

接下来，对 PCR 产物进行纯化。最后一步是所得质粒的组装反应转化和质粒克隆验证。最终，Gibson 组装反应用于在人延伸因子 1 α 启动子的转录调控下，在含有野生型和突变型 CSTF 64 蛋白的标志标记版本的平行质粒中开发。

与传统 DNA Corning 等现有方法相比，该技术的主要优点是它可以并行生成设计相似、野生型和突变质粒，而无需连续的 Corning 步骤。设计一个连续的核苷酸序列来代表最终的质粒。现在列出将用作 PCR 模板的实际质粒和 DNA 片段顺序 不容易获得的 DNA 片段，例如标签和启动子的不同组合，如单个或多个合成双链 DNA 片段。

接下来，将最终构建体的连续核苷酸序列分成适合 PCR 的 DNA 片段。确认片段与可用的质粒和合成的 DNA 片段匹配。避免使用小于 200 个核苷酸的 DNA 片段。

在访问引物生成工具后，在 change Gibson assembly settings（更改 Gibson 装配体设置）弹出窗口中选择 set preferences（设置首选项）菜单。选择更改 pres 选项卡，然后选择构建构建菜单，将分裂的 DNA 片段按顺序从 5 个引物到 3 个引物末端插入引物生成工具中。打开"输入载体或插入片段"窗口，以快速 A 格式粘贴代表载体 DNA 五个主要末端的第一个 DNA 片段，并命名此 DNA 片段。

选择合适的方法获取 DNA 片段。然后单击 continue 选项卡。如果需要在最终构建体的连接处添加额外的核苷酸或限制性位点，则在组装窗口的正向或反向引物间隔区打开添加和插入片段。

仅输入一个 DNA 片段的额外核苷酸或限制性位点。然后点击 完成 选项卡。对所有片段重复此作，直到构建完成。

选择 view primers（查看引物）菜单并查看引物序列。对所有构建体、载体、骨架和插入片段或不同的 DNA 片段重复此作。在水或 te 缓冲液中将 PCR 引物稀释至 10 μmol。

然后在水中将所有用于 PCR 的 DNA 模板和单链合成 DNA 稀释至 1 ng/μL。通过混合 2.5 μL 的 10 μmol 每种引物，在室温下组装 PCR 反应。1 微升/微升模板 DNA 片段 1 纳克，25 微升热。

开始校对 DNA 聚合酶和 19 μL 水。轻轻轻弹混合试管，并通过短暂离心收集液滴。根据所用 DNA 聚合酶的建议，在单独的试管中同时扩增相似大小的 DNA 片段。

进行 25 至 28 个 PCR 循环或确定产生足够 DNA 产量的循环次数。使用标准 AROS 凝胶电泳分离 5 μL 的 PCR。验证代表 PCR 产物的单个 DNA 条带是否可见。

如有必要，使用 DNA 分子量标准品确定 DNA 片段的大小和相对量，重复 PCR 以获得足够量的 DNA 片段。将用 DPN 预消化的 PCR 转移至 1 至 1.5 mL 试管中，并向每个试管中加入 81 μL DNA 纯化磁珠。将混合物在室温下孵育 10 分钟。

将试管放在磁力收集器上 2 分钟。现在，丢弃透明液体。用 200 微升 80% 乙醇洗涤两次，持续 30 秒。

然后将干燥的磁珠重悬于 10 微升 10 毫摩尔盐酸三酯 pH 8.0 中，两分钟后，短暂离心，然后将试管放在磁性收集器上两分钟。取出 8.5 至 10 微升透明溶液，并将其放入新的预标记试管中。通过紫外光谱法测定 DNA 片段的浓度。

使用至少 100 ng 代表载体骨架的 DNA 片段或携带选择性标记的 DNA 片段。计算将用作插入片段的 DNA 片段的三倍摩尔过量。在 PCR 管中混合计算量的 DNA 片段。

然后将体积调节至 10 微升。加入 10 μL Gibson 组装预混液。在 PCR 热循环仪中于 50 摄氏度孵育反应。

继续转化组装产品无能的大肠杆菌，或在零下 20 摄氏度下冷冻产品，直到需要。遵循化学或电感受态细胞随附的转化程序。通常每个转化反应使用 2 μL 组装反应。

最后，通过使用特异性或标准引物进行 DNA 测序来确认 DNA 克隆成功。分析测序数据的准确性。本实验旨在克隆切割刺激因子蛋白 64 和突变体 CSTF 64。

在 HE F1 α 启动子的表达调节下与 3 x 标志标签融合的蛋白质。我们没有含有 HE F1 α 后跟 3 x 标志标签的质粒。然而，以下质粒是可用的。

PC DNA 3.1 M 嘶嘶声 HF 1 个含有 α 的质粒和小鼠 CSTF 64 质粒。构建体的整个序列是使用核苷酸和文本编辑应用程序组装的。随后，将序列分成四个方便的片段，对应于可用的质粒 DNA。

通过 PCR 扩增用于组装反应的 4 个 DNA 片段。扩增来自单个克隆的质粒，并通过限制性内切酶消化进行分析，以便正确组装到 pc DNA 载体中，然后选择克隆，然后通过测序验证。一旦掌握了组装技术，包括质粒和初级设计，后续的 PCR 和通讯验证可以在 5 天内进行，不包括初级和合成 DNA 合成和递送的时间。