基于CRISPR-Cas系统与抗CRISPR蛋白的基因数字电路

本实验方案详细说明了如何设计、构建和分析利用II型和V型CRISPR dCas系统及其相应抗CRISPR蛋白的酵母基因数字电路。该方案具有可组装性，因为它整合了一套标准化流程，用于在酵母中组装和测试合成转录网络。首先，配制反应体系：加入20至40纳克DNA模板、1微升正向引物、1微升反向引物、5微升dNTP混合物、0.5微升DNA聚合酶、10微升5× DNA聚合酶反应缓冲液，并用双蒸水补足至总体积50微升。

使用手稿中所述的降落PCR程序，在热循环仪中扩增DNA序列。通过凝胶电泳分离PCR产物，并使用DNA凝胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收并稀释DNA片段。采用Gibson组装法，将纯化的PCR产物插入线性化的穿梭载体中：将等摩尔的DNA混合物在50摄氏度下孵育1小时，完成连接反应。

通过降落PCR和Gibson组装方法构建dCas12a受体载体，具体操作如前所述。使用BamH1和Xhol1进行酶切，并利用T4 DNA连接酶连接，将酵母密码子优化的dCas12a蛋白插入两个新构建的受体载体中。类似地，基于pRS2403穿梭载体，通过降落PCR和Gibson组装方法构建表达抗CRISPR蛋白的质粒。

进行显微镜细胞检测时，取两微升细胞溶液置于载玻片上，并盖上盖玻片。打开荧光光源、显微镜和计算机，通过荧光显微镜观察细胞。记录荧光光源编号后，在计算机上打开显微镜软件。

将玻片置于显微镜载物台上，在绿光下观察细胞，并选择40倍物镜。调节粗调焦旋钮，直至酵母细胞轮廓出现，再使用细调焦旋钮使细胞清晰对焦。检测细胞时，先关闭显微镜视野，切换至计算机屏幕，然后点击“live”按钮。

等待三到五秒。点击“捕获”以拍照并保存图像。接下来，关闭计算机、显微镜和荧光光源。

在测量前20分钟打开流式细胞仪，以预热激光器，并将20微升细胞培养物与300微升双蒸水混合。在连接流式细胞仪的计算机上运行FACS软件，创建新实验，然后设置测量参数。

接下来，根据样本的激发和发射波长选择相应的滤光片，并将采集细胞数设置为 10,000。通过测量荧光微球的强度来调整 FITC 滤光片电压，确保连续两次实验中微球强度的相对差异不超过 5%。用双蒸水冲洗仪器数秒，以去除可能残留的过量微球。测量样本荧光强度，并在等待样本注入稳定 3 至 5 秒后点击预览。

最后点击“acquire”。在实验结束时再次测量微珠。检查两次微珠测量值之间的相对差异是否超过5%后，将FACS数据导出为FCS文件。

打开 R Studio 并加载脚本 BDverse_analysis.R 以分析 FCS 文件。将实验名称设置为 ename，将存储 FCS 文件的目录路径设置为 dir_d，结果文件将生成在 dir_r 目录中。

接下来，设置荧光通道。设定已测量的样本数量。设定散点图的尺寸，以及柱状图和箱线图的 x 轴与 y 轴的最大长度。

通过删除相应行前的井号来选择评分方法。选择与所选设门方法相对应的已设门的flowSet对象以及点图分辨率，分辨率应至少为256。取消注释两条过滤指令，以去除荧光信号为负的测量值，并去除由于其他实验引起的异常值，具体方法详见论文描述。

按下源按钮并运行脚本。分析结果的所有文件均生成在 dir_r 目录中。当合成启动子上含有六个 lexOp 靶位点时，dSpCas9-VP64 达到了最佳的激活效率。

对于dCas12a-VPR，当在合成启动子中插入三个lexOp拷贝时，激活效率最高。当CRISPR RNA和单链向导RNA位于整合型质粒上时，其激活效果分别比位于附加体型质粒上时高出1.4至2.4倍和1.1至1.5倍。RT-qPCR结果显示，无论表达系统如何，附加体型载体产生的单链向导RNA和CRISPR RNA水平均显著高于整合型载体。

测试了dSpCas9复合物与招募MCP-VP64的支架RNA的激活效率。含有单个野生型和F6MS2发夹结构的支架RNA分别实现了5.27倍和4.3倍的激活。然而，两种发夹结构的组合使用则达到了7.54倍的激活，具有最高的激活效率。

使用了四种不同的启动子来驱动三种II型抗CRISPR蛋白的表达，结果表明它们的作用具有剂量依赖性。强启动子分别将荧光水平降低至其原始值的0.21、0.11和0.13。滴定曲线显示，该电路表现出类似结型门控的特性，其开启与关闭状态的比值接近2.3。

五型抗CRISPR蛋白AcrVA1可使作为激活子的denAS-Cas12a和dLB-Cas12a的荧光表达降低19%至71%。研究了激活子与阻遏子之间的关系，其中AcrVA1在由pGAL1启动子驱动、pTEF1和遗传型CYC1t-pCYC1noTata调控时，其抑制效果表现出较大波动；五型抗CRISPR-A1仅对裸露的dLB-Cas12a表现出一定程度的抑制作用。FACS仪器较为精密，因此须小心操作。细胞溶液浓度切勿过高，且仪器应保持清洁。