固体脂质纳米粒（前哨淋巴结）细胞内定位的应用
2015年11月17日
在这项研究中，描述了一种合成超小生物相容性纳米颗粒的方法，以及几种评估其细胞相互作用的体外方法。
该程序的总体目标是合成超小的生物相容性纳米颗粒群，表征它们的物理特性并研究颗粒细胞相互作用。这是通过首先使用相反转温度法合成脂质纳米颗粒来实现的。在此过程中，脂质和表面活性剂最初共熔化。
加入一定量的水后，将混合物加热直至发生相分离。然后不断搅拌混合物，直到产生纳米乳液并完成固体脂质纳米颗粒或 sln 的合成。接下来，使用动态光散射或 DLS 来测量颗粒大小和多分散性。
差示扫描量热法或 DSC 是一种用于确定熔点和熔化潜热的附加技术，以便进一步表征颗粒，最终可以使用荧光显微镜和流式细胞术来研究颗粒细胞相互作用。与现有的高能量方法（如超声微流体和高压均质化）相比，该技术的主要优点是，这是一种相对温和的合成技术，既简单又可扩展。为了合成 LNS，将 0.6 毫克荧光染料或其他亲脂性化合物与 0.10 克线性铝或脂质混合。
在一个 15 毫升的小瓶中，在 90 摄氏度下熔化组分并搅拌，加入 0.11 克线性非离子表面活性剂。然后将所得混合物在 90 摄氏度下搅拌。接下来，将 1.79 克无菌水加入混合物中，加热至 90 摄氏度，并目视监测溶液，直到观察到两个阶段。
现在搅拌混合物，直到形成透明的纳米乳液。在不添加荧光染料的情况下平行制备单独的纳米乳液，以用作对照样品。使用无菌 0.2 微米过滤器对每种纳米乳液进一步消毒。
使用 DLS 测量 S lns 的粒度和多分散性 使用玻璃 在仪器设计中测量粒度 在测量样品之前，应按照制造商的标准品制备和测量方案测量两种已知标准品的粒径。接下来，测量为每个样品准备的样品。使用 100 秒的运行时间、水的折射率和 20 摄氏度时水的粘度。
报告粒径分布的平均粒径和多分散性，以研究 S lns 的热行为，使用 DSC 首先将 S LNS 移液到质量约为 25 mg 的 40 μL 铝盘中。使用通用压接机对盘进行气密密封，以最大限度地减少 DSC 扫描过程中的水分损失。在 5 到 80 摄氏度范围内测量每种纳米乳液之前，从 DSC 图中报告熔点和熔化潜热，其中谷值表示熔点和曲线下面积的积分。
在 DSC 图中，除以材料量表示熔融培养物的潜热。根据制造商的说明，在液体培养基中将原代人成纤维细胞置于用于培养人真皮成纤维细胞的液体培养基中。补充低血清生长补充剂试剂盒，将细胞维持在 37 摄氏度、5% 二氧化碳的潮湿环境中，并在 MTT 和成像分析种子细胞达到 80% 汇合时进行传代培养。
在 96 孔板中，密度为每孔 20， 000 个细胞。让细胞在 37 摄氏度下平衡过夜，然后在 SLN 暴露于时间零，在完全培养基中稀释 S SLM 以达到所需的脂质浓度，并在与 S lns 孵育 24 小时后，向 96 孔板中的每个重复孔中每孔添加 10 微升，根据制造商的方案使用 MTT 测定法测定细胞活力。洗涤细胞一次，并向每个细胞中加入 100 μL 新鲜培养基。
在 70% 甲醇溶液中孵育 10 分钟，然后用新鲜培养基替换，杀死对照孔。将 MTT 试剂以每孔 10 微升的浓度添加到微孔板的每个孔中，并在 37 摄氏度下孵育过夜，孵育过夜，用 100 微升提供的去污剂溶液溶解细胞内形式和晶体。根据制造商的方案，在室温下将细胞在去污剂溶液中孵育 3 小时，然后获得吸光度值。
使用酶标仪为显微镜做准备。用无菌磷酸盐膨化盐水洗涤成纤维细胞两次。在用 lns 成纤维细胞给药后，在特定时间点用 70% 冷的甲醇固定细胞 10 分钟。
10 分钟后，用磷酸盐缓冲盐水或 PBS 替换甲醇，然后使用倒置显微镜捕获图像。使用 MTT 测定法合成的 S SLN 得到平均粒径为 18.59、多分散度为 5.83 的对照 S LNS 和平均粒径为 16.87 纳米、多分散度为 4.47 的尼罗红负载 SLM。测量剂量反应对细胞代谢的影响，其中颗粒浓度增加导致细胞活力降低。
单独暴露于 SLN 的细胞与负载尼罗红的细胞之间的毒性没有观察到差异。SLN.同时目视检查细胞对组织培养物的依从性。使用等于 5 μg/mL 的剂量拍摄聚苯乙烯和图像以证明代表性细胞形态和荧光颗粒随时间的摄取。
暴露后 2 小时观察到脂质颗粒摄取。通过流式细胞术测量小鼠骨髓来源的树突状细胞或 B MDC 中尼罗红荧光的强度，确定纳米颗粒掺入水平。观察到使用的 SNS 浓度与 B MDC 中评估的荧光量之间存在直接相关性。
观看此视频后，您应该对如何合成超小群体的生物相容性纳米颗粒、表征其物理特性和研究颗粒细胞相互作用有很好的了解。
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概述
本研究提出了一种合成超小规模的生物相容性纳米颗粒的方法，并通过各种体外方法评估它们的细胞相互作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 纳米颗粒合成
- 生物相容性
- 细胞相互作用
背景
- 了解纳米颗粒在生物系统中的行为至关重要。
- 生物相容性纳米颗粒在药物输送中具有潜在应用。
- 纳米颗粒的表征对其有效使用至关重要。
- 体外方法提供了细胞相互作用的见解。
研究目的
- 合成超小规模的生物相容性纳米颗粒。
- 表征它们的物理性质。
- 研究纳米颗粒与细胞之间的相互作用。
使用的方法
- 纳米颗粒合成的相反温度法。
- 脂质和表面活性剂的共熔。
- 加热和相分离以创建纳米乳液。
- 动态光散射（DLS）用于测量粒子尺寸和多分散性。
主要结果
- 成功合成超小规模的脂质纳米颗粒。
- 物理性质的表征确认了生物相容性。
- 体外方法揭示了显著的细胞相互作用。
- 动态光散射提供了准确的粒子尺寸测量。
结论
- 合成的纳米颗粒在生物医学应用中很有前景。
- 表征技术对评估纳米颗粒性质是有效的。
- 需要进一步研究来探索体内相互作用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Solid lipid nanoparticles (SLNs) offer a scalable, biocompatible platform for intracellular targeting, enabling precise modulation of cellular signaling and gene expression in discovery workflows. Their synthesis via the phase inversion temperature method supports reproducible nanoparticle production for preclinical evaluation of drug delivery systems. This approach enhances predictive confidence in target validation by characterizing nanoparticle-cell interactions across relevant cell types.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through controlled nanoparticle delivery to primary human fibroblasts and murine dendritic cells.
- Operational Value: Provides a standardized system for assessing cellular uptake and toxicity using fluorescence microscopy and flow cytometry.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by correlating nanoparticle concentration with cellular response via MTT assay and fluorescence intensity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative particle size and polydispersity data via DLS for formulation consistency in screening campaigns.
- Operational Value: Establishes biocompatible nanoparticle preparations suitable for high-throughput cellular interaction assays.
- Assay Readiness: Uses MTT assay to define non-toxic dosing ranges prior to mechanistic studies, improving assay window reliability.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Demonstrates intracellular targeting capability in two distinct cell types, supporting extrapolation to disease-relevant models.
- Biomarker Alignment: Facilitates fluorescent dye loading (e.g., Nile red) for tracking nanoparticle biodistribution in preclinical systems.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on uptake kinetics and viability thresholds observed in dose-response studies.
Pipeline & Workflow Integration
SLN synthesis and characterization fit within the discovery-to-preclinical continuum, supporting lead identification through formulation optimization and mechanistic insight.
- Discovery Biology: Tests delivery hypotheses by tracking nanoparticle internalization and cellular effects over time.
- Screening: Delivers standardized, ultra-small nanoparticles with defined size (16.87 nm) and low polydispersity (4.47) for consistent compound or probe evaluation.
- Analytics: Provides multi-parametric readouts including particle size (DLS), thermal behavior (DSC), viability (MTT), and uptake (fluorescence/flow cytometry).
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by demonstrating biocompatibility and cellular interaction in primary human and murine cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular nanoparticle platform adaptable to various lipophilic payloads for repeated use across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in delivery studies by correlating nanoparticle dose with cellular response.
- Operational Value: Enables reproducible synthesis via a simple, scalable phase inversion temperature method without high-energy equipment.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by minimizing late-stage failure through early assessment of nanoparticle-cell interactions.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of delivery systems based on uptake efficiency and safety profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid-based nanoparticle formulation and phase behavior analysis.
- Dependent on access to DLS, DSC, fluorescence microscopy, and flow cytometry for characterization.
- Necessitates standardized cell culture protocols for primary human dermal fibroblasts and murine dendritic cells.
- Requires optimization of surfactant-lipid ratios and aqueous phase volume for reproducible nanoemulsion formation.
- Limited to lipophilic payloads due to the lipid matrix encapsulation mechanism of SLNs.
