Name: 生物活性亲水球状蛋白的纳米脂质体制备与表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 s
Description: 学习使用薄膜法制备包裹亲水蛋白tarin的纳米脂质体，通过挤出技术和动态光散射进行表征。该方法可实现高包封效率，为药物递送提供稳定载体。

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作者感谢巴西里约热内卢联邦大学（UFRJ）的COPPE/UFRJ、电子显微镜实验室和多用户材料表征实验室提供的设施支持；感谢巴西里约热内卢联邦大学（UFRJ）的Adalberto Vieyra博士、Jennifer Lowe博士和Rafael Lindoso教授提供超速离心机的使用；感谢巴西里约热内卢联邦大学（UFRJ）的Alexandre Guedes Torres博士和Daniel Perrone教授提供旋转蒸发仪的使用；感谢德国柏林自由大学（Freie Universität）的Roland Bodmeier教授和Andriy Dashevskiy博士，在德国为期六个月的伊拉斯谟+（Erasmus+）奖学金期间提供了资源、新方法，并指导了ACNTF；感谢巴西里约热内卢联邦大学（UFRJ）的Rossana Thiré博士和Aline Fernandes教授及技术人员提供Zetasizer Malvern仪器的使用；感谢巴西里约热内卢联邦大学（UFRJ）的Bluma Guenther教授和Taissa Rodrigues技术人员提供扫描电子显微镜（SEM）的使用；感谢奥斯瓦尔多·克鲁兹基金会（Fundação Oswaldo Cruz）的研究人员Rachel Ann Hauser Davis博士提供解说。本研究部分由巴西高等教育人员进修协调机构（Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES）资助，资助代码001（资助号1627392；1811605）；由里约热内卢州卡洛斯·查加斯·菲略研究支持基金会（Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro, FAPERJ）资助（资助号E-26/202.815/2018；E-26/202.815/2018；E-26/203.039/2015和E-26/202.860/2016）；由国家科学技术发展理事会（Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, CNPq）资助（资助号406601/2018-6）；以及由项目与研究资助基金会（Financiadora de Estudos e Projetos, FINEP）资助。

1. Tarin 脂质体纳米胶囊的制备16
注意：所有制备步骤均需设置三个重复，以获得更大的体积（7 mL），并使样品能够进行超速离心（详见下文）。
<ol>
	<li>使用分析天平称取脂质体组分，如表1所示。</li>
	<li>将脂质组分溶解于氯仿中，使用可适配旋转蒸发仪的250 mL容量瓶，以避免材料损失。</li>
	<li>以150 rpm转速搅拌混合物15分钟。</li>
	<li>在以下条件下使用旋转蒸发仪去除氯仿：
	<ol>
		<li>将容量瓶瓶口调整至标准位置（25°），以实现最佳效率，同时确保与加热浴中的水接触。 
		注意：仪器臂应倾斜25°，以保持容量瓶与水浴的接触，同时不影响蒸发效率或损坏样品。标准位置可能因设备品牌而异。</li>
		<li>将冷凝器温度设置为至少3 °C。</li>
		<li>将加热浴温度设置为40 ± 1 °C。</li>
		<li>将转速设置为120 rpm。</li>
		<li>将真空度调节至207 mbar，沸点调节至20 °C。</li>
		<li>约25分钟后，取下容量瓶，并妥善处理残留在冷凝器中的蒸发溶剂。 
		注意：此步骤会形成一层由脂质体组分构成的薄而不透明的薄膜，可轻易观察到。残留在冷凝器中的蒸发溶剂必须收集至专用废液容器（含氯）中，由专业公司进行妥善处置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用含1 mg/mL tarin的0.3 M硫酸铵溶液（pH = 7.4）水化脂质膜，使脂质终浓度达到0.01 M，定容至10 mL。
	<ol>
		<li>搅拌混合物40分钟，并在4 °C下孵育过夜。 
		注意：此步骤可作为暂停点。过夜孵育并非必需。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>孵育后，在25 °C（室温；RT）下对悬浮液进行1分钟超声处理，以减小囊泡尺寸并防止聚集。 
	注意：尺寸减小在超声破碎仪中进行，条件如下：130 W，40 kHz。</li>
	<li>通过0.2 µm聚碳酸酯孔径膜进行12次挤出。 
	注意：在挤出前，使用水测试微型挤出器组件，以避免样品泄漏。也可使用0.1 µm孔径膜。若使用后者，需将微型挤出器支架预热至脂质相变温度以上，以利于挤出，同时保持脂质和蛋白质的理化特性。
	<ol>
		<li>按照制造商说明书组装微型挤出器各部件。</li>
		<li>将聚碳酸酯膜置于两个预先润湿的滤膜支撑之间，并放入支架中。</li>
		<li>将一支1 mL空注射器插入装置一侧，另一侧注射器吸入全部体积的脂质体悬浮液后插入对侧。</li>
		<li>通过0.2 µm聚碳酸酯孔径膜进行12次挤出。缓慢推动样品从一支注射器转移至另一支，收集挤出后的悬浮液至预冷的离心管中。 
		注意：仅当样品在注射器间转移困难时才需更换聚碳酸酯膜。随着小单层囊泡（SUVs）的形成，脂质体悬浮液在挤出过程中会逐渐变澄清。此步骤中约损失0.2 mL样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过超速离心分离脂质体。 
	注意：在超速离心机准备就绪前，样品应始终置于冰浴中。使用配备摆桶转子的超速离心机，通过超速离心将小单层囊泡（SUVs）与剩余组分及硫酸铵分离（详见下文）。
	<ol>
		<li>将样品装入适配转子的钛管中并称重，对称平衡各管。根据所用转子检查所需的最小体积，以避免损坏管体；必要时可用硫酸铵溶液调节脂质体悬浮液体积。 
		注意：当摆桶转子不在离心机内时，应始终将其置于支架上支撑，以避免刮伤底部用于离心机测定转速的“斑马条纹”（即黑白相间的条纹）。</li>
		<li>使用离心机前开启真空，使其开始制冷。</li>
		<li>将钛管装入摆桶中。 
		注意：将管体抬至其运行时的位置，以确保完全就位。</li>
		<li>释放真空，打开离心机门，将转子放入离心腔内。 
		注意：注意转子底部的圆圈标记，必须与离心机内部相对应的圆圈标记方向相反对齐。</li>
		<li>关闭离心机门，按下“Vacuum”键，等待真空度降至200至&lt;20微米（或26 Pa至&lt;3 Pa）。</li>
		<li>在超速离心机显示屏上设置参数：150,000 x g（对应前述摆桶转子的29,600 rpm），4 °C下离心90分钟（加速度：最大，减速度：最大）。 
		注意：若特定离心机以rpm为单位设定转速，务必将其转换为x g。请根据所用转子，通过离心机官网提供的换算工具进行单位转换。</li>
		<li>按下“Recall”键，核对条件后按下“Start”开始运行。 
		注意：需等待离心机达到设定转速。</li>
		<li>90分钟后，按下“Vacuum”键释放真空，当真空度回升至200–700微米（相当于26–93 Pa）时打开离心机门。</li>
		<li>关闭离心机，将转子从腔内取出，放置于实验台面上，保持摆桶打开状态以自然干燥。</li>
		<li>超速离心后的样品应始终保持在冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小心地将管子倒置，将上清液转移至一次性15 mL离心管中，以分离上清液与沉淀。 
	注意：将含有未包封蛋白的上清液储存于4 °C，用于后续测定包封效率。沉淀呈半透明凝胶状。</li>
	<li>用HEPES缓冲盐水（3 mL的1x HBS）重悬含有包封蛋白的沉淀。 
	注意：HBS 2x（储存液）的配制方法为：将以下试剂溶于蒸馏水中——140 mM NaCl、1.5 mM Na2HPO4、50 mM HEPES，调节pH至7.4，定容至100 mL。为避免干扰（如测定脂质体浓度时），Na2HPO4可用NaHCO3替代或省略。使用前需将HBS 2x储存液用蒸馏水稀释至HBS 1x。</li>
</ol>
2. 包封效率
注意：使用 Peterson 法17测定包封率，以避免脂质对蛋白质定量的干扰。所有样品（BSA 标准品和脂质体上清液）均应设三个重复。同时准备一个空白管。
<ol>
	<li>储备试剂和工作溶液的配制17
	<ol>
		<li>对于储备试剂，通过混合10 mL 20%碳酸钠、 200 µL 0.1% 硫酸铜 200 µL 将0.2%的酒石酸钾与9.6 mL蒸馏水混合。配制100 mL 10%十二烷基硫酸钠（SDS）和0.8 N氢氧化钠（NaOH）。</li>
		<li>配制工作溶液时，准备 10 mL 0.15% 脱氧胆酸钠（DOC）和 72% 三氯乙酸（TCA）。将 10 mg 牛血清白蛋白（BSA）溶于 10 mL 蒸馏水中，得到 1 mg/mL 的标准溶液。通过将等体积的 CTC、NaOH、SDS 和 H 混合制备试剂 A2O. 将福林-酚试剂（Folin-Ciocalteu phenol reagent）用蒸馏水按1:5比例稀释，配制试剂B。 
		注意：每根反应管需要试剂 A 1 mL，而试剂 B 需要 0.5 mL。为确定试剂 A 和 B 的最终用量，首先需明确将使用的反应管数量，包括三种不同浓度的 BSA、空白对照以及各三份重复的样品。使用前须将试剂 A 充分混匀，且可保存于 25 °C （室温）2周。试剂B在室温下也稳定 25 °C （若储存于棕色瓶中，则置于室温）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>沉淀 
	注意：此步骤在微量离心管中进行。
	<ol>
		<li>将脂质体上清液用水稀释至终体积1 mL，其中含有5-100 µg 蛋白质。 
		注意：空白管中应加入 1 mL 蒸馏水。</li>
		<li>加入0.1 mL 0.15% DOC，涡旋混匀，室温孵育10分钟。</li>
		<li>加入 0.1 mL 72% 三氯乙酸，充分混匀，于 3,000 x g 室温孵育15分钟。 
		注意：DOC-TCA 可促进蛋白质沉淀，形成两个明显分层的相。通过离心可回收目标蛋白质，避免脂质干扰。</li>
		<li>小心弃去上清液，将离心管倒置并置于吸水纸上。保留沉淀物用于后续步骤。 
		注意：沉淀物可能很难看到，但即使不可见，也应将离心管倒置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分光光度法
	<ol>
		<li>将步骤 2.2.4 中获得的沉淀重悬于 1 mL 蒸馏水中，充分混匀以确保沉淀完全溶解，然后将样品转移至新的试管中。</li>
		<li>配制牛血清白蛋白（BSA）标准品的稀释液，终体积为1 mL。 
		注意：蛋白质标准品必须在5-100 µg/mL.</li>
		<li>向2.3.1和2.3.2步骤中的试管中无一例外地加入1 mL试剂A，充分混匀，并在室温下孵育10分钟。 
		注意：SDS 可在促进蛋白质溶解的同时消除可能的脂质干扰。</li>
		<li>向步骤 2.3.1 和 2.3.2 的试管中加入 0.5 mL 试剂 B，充分混匀，避光于室温孵育 30 分钟。 
		注意：福林-酚试剂（Follin-Ciocalteu phenol reagent）是钼酸盐和钨酸盐的混合物，用于某些含氮化合物（如蛋白质）的比色测定。铜络合作用可增强酚类对此试剂的反应性，根据蛋白质浓度生成蓝色/紫色复合物。</li>
		<li>使用分光光度计测定 750 nm 处的吸光度。</li>
		<li>根据标准曲线计算上清液中的蛋白浓度，方法如下。
		<ol>
			<li>绘制吸光度值（Abs） 与 BSA 浓度（mg/mL）以获得角系数（k）考虑一条线性趋势线。</li>
			<li>测定上清液中的蛋白质浓度（C吸光度值与角系数之比k），然后乘以总体积，如下所示： 
			<img alt="C = Abs / k × 上清液体积，浓度计算公式；用于光谱分析及示意图。" src="/files/ftp_upload/59900/59900eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1"></li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据以下公式计算包封率： 
	<img alt="包封效率公式；用于研究分析中蛋白质载量计算的方程。" src="/files/ftp_upload/59900/59900eq2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 2"></li>
	<li>其中，加载的蛋白质 = 10 mg，未包封的蛋白质 = 测定值 C 步骤 2.3.6.2 中获得 
	注意：本实验中，使用10 mg刀豆球蛋白A（tarin）溶解于硫酸铵溶液（1 mg/mL）中进行包封操作，因为该浓度足以获得满意的体外效果。13,16,18.</li>
</ol>
3. 大小和稳定性测定
注意：脂质体样品的粒径分布和多分散指数（PdI）通过动态光散射（DLS）进行评估。PdI 接近 0.1 表明样品均一性良好。为测定稳定性，将脂质体在 4 °C 下保存，并定期检测粒径分布及平均粒径。
<ol>
	<li>使用前30分钟打开DLS设备，以预热激光灯。</li>
	<li>将步骤1.10中获得的脂质体样品转移至一次性粒径测定比色皿中。</li>
	<li>设置设备参数如下：分散介质类型 = 水（折射率 = 1.33）；材料 = 脂质（折射率 = 1.45）；室温（RT）。</li>
	<li>按下“开始”按钮，等待设备完成测量。</li>
	<li>取出比色皿并关闭设备。 
	注意：可将样品从比色皿中转移回一次性15 mL离心管中，用于后续分析；若样品量充足可供重新测量，则可弃去。</li>
</ol>
4. 形态学表征
注意：脂质体表征按照 Murtey 和 Ramasamy19 的方法进行。在步骤 1.10 中获得的含有纳米脂质体的样品需制备三个平行样本。
<ol>
	<li>使用双面胶带将玻璃盖玻片（直径 13 mm）固定在培养皿底部。将胶带剪成小块（大小应适合固定盖玻片），撕去下方保护纸后，将其粘贴在培养皿底部。用镊子夹起胶带，撕去上层保护纸，然后将盖玻片固定在胶带上。 
	注意：后续步骤中需小心操作，避免盖玻片脱落，应使用粘性强的胶带。</li>
	<li>用聚-L-赖氨酸对盖玻片进行包被。在培养皿内放入湿润的滤纸以保持湿度，并在室温（25 °C）下孵育 1 小时。</li>
	<li>包被完成后，用蒸馏水冲洗盖玻片。</li>
	<li>在盖玻片上滴加步骤 1.10 中的样品溶液，于室温下干燥 1 小时。</li>
	<li>固定样品时，用 0.1 M 磷酸缓冲液（pH = 7.2）配制的 4% 戊二醛覆盖样品。在培养皿内放置湿润滤纸并密封，以维持湿度。在 4 °C 下孵育 48 小时。</li>
	<li>用相同的磷酸缓冲液冲洗盖玻片，每次 5 分钟，共冲洗 3 次。</li>
	<li>按以下步骤对样品进行脱水：35% 乙醇处理 1 次，每次 15 分钟；50% 乙醇处理 1 次，每次 15 分钟；75% 乙醇处理 1 次，每次 15 分钟；95% 乙醇处理 2 次，每次 15 分钟；无水乙醇处理 3 次，每次 20 分钟。</li>
	<li>将样品浸入六甲基二硅氮烷（HMDS）中进行化学干燥，每次使用 1−2 mL HMDS，处理 2 次，每次 10 分钟。 
	注意：HMDS 应在通风橱内小心操作。样品应在干燥器内或通风橱中于室温下过夜干燥。</li>
	<li>使用导电碳胶带将干燥后的样品固定在样品台上。</li>
	<li>在真空条件下，对盖玻片表面进行溅射镀膜，形成一层厚度为 20 nm 的金-钯导电层。</li>
	<li>使用扫描电子显微镜（SEM）在低真空模式和低电压（20 kV）条件下采集图像。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

Correa 等人16已通过本方案测试包封从Colocasia esculenta中纯化的具有免疫调节和抗肿瘤活性的凝集素——tarin22。该方法取得了成功，能够制备出适用于治疗应用的、尺寸适宜且稳定的纳米脂质体。该制剂在生理条件下不同pH水平下均表现出可控释放特性。此外，它还能增强tarin的药理学特性，例如抑制人胶质母细胞瘤U-87 MG和乳腺癌MDA-MB-231细胞系，并刺激小鼠骨髓细胞。脂质体制剂在健康小鼠细胞中未表现出毒性作用16。
经典的制备方法最初由 Bangham 等人7描述，可用于制备尺寸和形态均不均一的大单层脂质体囊泡。本研究所述对该方法的改进，通过增加超声处理和通过 0.2 µm 聚碳酸酯膜挤出等额外步骤，已成功实现应用。这使得所制备的脂质体在纳米尺度范围内具有更均一的粒径分布16,23,24。因此，为确保获得理想结果，此处描述的包封方案和脂质体制剂必须严格遵循。
为了确保形成以DOPE、MPEG 2000-DSPE和CHEMS为主要成分的双层膜结构，纳米脂质体的组分经过精心筛选。这些成分均为天然动物细胞膜双层的组成成分，其中后者可赋予纳米脂质体结构以流动性，从而确保其在人体内生物活性化合物递送中的广泛应用。
纳米脂质体的聚乙二醇化对于维持脂质体结构的稳定性至关重要。若缺乏聚乙二醇（PEG），会导致粒径增大、多分散系数升高以及包封率降低。以DOPE作为脂质体主要组分时可获得最佳效果，但DOPE是一种成本较高的磷脂。通过使用其他结构相似的脂质（如DOPC（1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱））替代DOPE，可降低纳米脂质体的生产成本。CHEMS是一种天然存在于动物细胞膜中的胆固醇分子，不应从配方中省略，因其对维持脂质双分子层的流动性与可塑性具有重要作用16。
包封方案的其他方面也可进行调整。用于溶解脂质体组分的氯仿可轻松替换为甲醇，且对粒径均值、均一性及包封效率无影响。然而，在4 °C下储存时可能会发生少量蛋白质泄漏16。使用含伴刀豆球蛋白A（tarin）的硫酸铵溶液进行过夜孵育并非必需步骤；但为操作便利起见，该步骤仍可实施，且如Correa等人16所证实，不会对纳米脂质体的生物物理特性、包封效率或稳定性造成损害。挤出步骤在室温下进行，若使用孔径为0.1 µm的膜，则可能导致注射器之间的流速降低。
为解决此问题，应考虑使用孔径为 0.2 µm 的膜或在脂质相变温度以上加热挤出器装置。操作者必须小心避免损伤脂质或蛋白质，防止其失活并丧失生物活性。或者，脂质体样品可采用透析法替代超速离心，使用根据蛋白质分子量选择截留分子量的透析膜，在 HBS 缓冲液中进行透析。纳米脂质体经超速离心后所悬浮的缓冲液的化学性质，直接取决于其后续应用。由于本研究的应用前景包括体内和体外实验，因此采用 HEPES 缓冲盐水进行悬浮，足以确保无细胞毒性作用，并维持接近生理条件的 pH 范围。
脂质体应像活细胞一样进行精细处理，以获得高质量的扫描电镜（SEM）图像。固定和干燥步骤至关重要，可确保在真空条件下承受高于20 kV的电压，从而观察到更小且完整的囊泡。图2A,B展示了与挤出工艺相符的纳米级囊泡。若按照本方案进行充分的样品制备，则可观察到直径范围为51–396 nm的囊泡。该步骤包括固定、通过逐步提高乙醇浓度进行干燥，以及化学脱水，以避免在真空和电子束作用下形成聚集体或破裂的囊泡。另一方面，图2C,D展示的是在室温下干燥且未经过本方案所述任何处理的脂质体囊泡，即制备方法不当。由于制备方法不当，即使经过孔径为0.2 µm的膜挤出，仍会形成巨型囊泡。此外，在两幅图中均可观察到因真空和电子束损伤而导致的破裂囊泡。
纳米脂质体囊泡已被研究作为疏水性分子的包封和递送系统，包括白藜芦醇（3,5,4'-三羟基二苯乙烯），一种对结直肠癌细胞具有生物活性的化合物。该包封工艺可克服脂溶性化合物溶解度差的问题，同时提供脂质体纳米胶囊固有的生物相容性、可生物降解性、非免疫原性和无毒性等特性25。根据给药途径和用途的不同，必须考虑对实验方案进行相应调整，例如开发用于口服给药的新脂质体配方。

近年来，研究高效药物递送系统的文献数量不断增加。然而，诸如快速清除、生物分布差、生理pH条件下的溶解度低以及细胞摄取不足等局限性仍需克服。纳米系统的应用已成为癌症治疗领域的最新进展，旨在提高药物在癌细胞内的胞内浓度，同时尽量减少对健康细胞的毒性。此外，目前正利用多种材料（如聚合物、树状大分子、脂质体、病毒、碳纳米管以及氧化铁和金等金属）制备的纳米颗粒来增强抗癌效果并降低全身毒性1。其中，脂质体纳米胶囊已在制药、化妆品和食品工业中被广泛应用于多种用途。近年来，多种营养保健品，如维生素、酶和植物提取物，已通过脂质体技术进行制剂开发2。
脂质体是由磷脂在水相介质中自发分散形成的具有一层或多层同心脂质双分子层的球形囊泡3,4。磷脂的极性头部位于膜的内外表面，与水环境接触；而脂肪酸链则构成膜的疏水核心，避免与水接触5。脂质体作为药物递送系统具有诸多优势，包括良好的生物相容性、可生物降解性、无免疫原性、无毒性，以及能够包载亲水性和疏水性化合物的能力6。
脂质体可通过多种工艺步骤制备，例如振荡、超声处理、挤出、冻干、冷冻和解冻。经典方法包括逆相蒸发法、溶剂注入法和去垢剂透析法。目前应用最广泛的方法是薄膜水化法，也称为Bangham法，用于制备囊泡状脂质结构7,8,9,10,11。层状性（即磷脂双分子层的层数）和粒径是表征脂质体的经典参数，据此可将脂质体分为两类：1）单层囊泡（ULVs），由单一磷脂双分子层构成，按尺寸进一步分为：i）小单层囊泡（SUVs，约0.02–0.20 µm），ii）大单层囊泡（LUVs，约0.2–1.0 µm），iii）巨大单层囊泡（GUVs，&#62;1 µm）；或 2）多层囊泡（MLVs，&#62;0.1 µm）3,12。在考虑脂质体的治疗用途时，如用于癌症治疗，囊泡尺寸是一个重要参数，其中尺寸小于&#60;200 nm 的纳米囊泡更有利于穿越内皮屏障并到达肿瘤组织4。
本文采用塔林（tarin）——一种被表征为亲水性球状蛋白的植物凝集素13,14,15，描述了基于经典薄脂膜水化法7&#160;的包封过程。通过在主要技术中引入超声处理和挤出步骤，可制备出纳米级囊泡，获得具有高包封效率的稳定脂质体纳米囊泡16。

<table><tbody><tr><td>硫酸铵</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>分析天平 Mettler H10Tw</td><td>Mettler Inc.</td><td>417870</td><td></td></tr><tr><td>Beckman DU-640 分光光度计</td><td>Beckman Coulter</td><td>8043-30-1090</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>BUCHI R-300 型旋转蒸发仪，配备控制器和 V-300 泵</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>05-001-022PM</td><td></td></tr><tr><td>CHEMS（胆固醇半琥珀酸酯）</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>C6512</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>48520-U</td><td>注意</td></tr><tr><td>硫酸铜（五水合物）</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片（13 mm 直径）</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>EW-01839-00</td><td></td></tr><tr><td>DOPE（1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺）</td><td>Lipoid GMBH</td><td>565600.1</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>32205</td><td></td></tr><tr><td>Folin-Ciocalteu 酚试剂</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>F9252</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>六甲基二硅氮烷（HMDS）</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>440191</td><td>注意</td></tr><tr><td>JEOL JSM-6460 LV 扫描电子显微镜</td><td>JEOL LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini Extruder 7</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>MPEG 2000-DSPE 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000]（铵盐）</td><td>Lipoid GMBH</td><td>588200.1</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-90k 超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN LL-IM-12AB</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>P3619</td><td></td></tr><tr><td>多聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>酒石酸氢钾</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>243531</td><td></td></tr><tr><td>碳酸钠</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>S7795</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠（DOC）</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>无水磷酸氢二钠</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>RES20908-A7</td><td></td></tr><tr><td>TESCAN VEGA 3 扫描电子显微镜</td><td>Tescan</td><td>#657874</td><td></td></tr><tr><td>三氯乙酸（TCA）</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>91230</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZSP</td><td>Malvern Panalytical LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗仪，型号 2510</td><td>Branson</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

用于包载生物活性亲水性球状蛋白质的纳米脂质体的制备与表征

Preparation and Characterization of Nanoliposomes for the Entrapment of Bioactive Hydrophilic Globular Proteins

脂质体纳米胶囊已在制药、化妆品和食品工业中得到广泛应用。脂质体具有生物相容性、可生物降解性、无免疫原性、无毒以及能够包封亲水性和疏水性化合物等多种特性。本文采用在有机溶剂中对薄脂质膜进行经典水化的方法，将一种植物凝集素——塔林（tarin）包封于纳米脂质体中。文中详细描述了纳米脂质体的粒径、稳定性、包封效率及形态学表征。纳米脂质体的主要成分为1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基（聚乙二醇）-2000]（铵盐；DSPE-MPEG 2000）和胆固醇基半琥珀酸酯（CHEMS）。首先将脂质溶解于氯仿中形成薄脂质膜，随后在含有待包封蛋白的硫酸铵溶液中重新水化，并过夜孵育。然后通过超声处理和挤出技术制备纳米级单层囊泡。采用动态光散射法测定纳米囊泡的粒径和多分散系数，通过扫描电子显微镜评估其形态。包封效率通过未包封蛋白量与初始加入蛋白总量之比来确定。所得脂质体均一，平均粒径为155 nm，多分散系数为0.168，包封效率高达83%。

图1 描述了纳米脂质体的制备过程16,20,21。首先将脂质体的主要组分——磷脂1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DOPE）、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[氨基（聚乙二醇）-2000]（铵盐；DSPE-MPEG 2000）和胆固醇半琥珀酸酯（CHEMS）——溶于氯仿中以形成脂质膜。随后，将脂质膜在含有待包封亲水性蛋白（tarin）的硫酸铵溶液中重新水化，并过夜孵育。接着采用超声处理和挤出技术制备小单层囊泡。超速离心步骤将脂质体与游离脂质及未包封的蛋白质分离，上清液则用于测定包封效率。
采用上述方法制备的纳米脂质体，其粒径分布范围为51−396 nm，平均粒径为155 nm（表2）。由于多分散系数为0.168，表明该制剂均一性良好。若将脂质体通过孔径为0.2 µm的膜进行挤出，包封率可达83%（表2）。
通过扫描电镜（SEM）评估了形态学纳米脂质体特征。图2A,B 显示粒径为121 nm、在20 kV条件下分析的圆形脂质体囊泡，而图2C,D 显示制备不良的样品。纳米脂质体未经本研究中所述的任何固定或其他处理，仅通过空气干燥。结果观察到粒径为332 µm、在5 kV条件下分析的较大且受损的囊泡。
<img alt="使用有机溶剂蒸发、再水化、超声处理和挤出法制备脂质体制剂的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59900/59900fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：纳米脂质体制备的示意图。 首先将脂质体主要成分DOPE、PEG和CHEMS溶解于氯仿中，以形成脂质膜（1, 2, 3）。随后在含有待包封亲水性蛋白（tarin）的生理缓冲液中对脂质膜进行再水化，并过夜孵育（4）。接着采用超声处理和挤出技术制备小单室脂质体（SUVs）（5, 6）。超速离心步骤用于分离脂质体与游离脂质及未包封的蛋白，上清液则用于测定包封效率（7）。本图改编自Correa等人的研究16。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59900/59900fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="样本显微镜检查的充分与不充分对比；纳米结构比较；用于实验室分析的扫描电镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59900/59900fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：通过扫描电镜观察纳米脂质体的显微图像。（A,B）圆形脂质体囊泡的图像，粒径约为 121 nm，在 20 kV 条件下进行分析。（C,D）制备不当的样本图像。处理不当的样本显示出更大和/或受损的囊泡，无法耐受 5 kV 条件下的真空和/或电压环境。本图经 Correa 等人16 修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59900/59900fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>脂质体组分</td>
			<td>重量 (g)</td>
			<td>浓度 (mM)</td>
			<td>终体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE</td>
			<td>0.0420</td>
			<td>5.7</td>
			<td rowspan="3">10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPEG 2000-DSPE</td>
			<td>0.1059</td>
			<td>3.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHEMS</td>
			<td>0.0024</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
DOPE - 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺）；MPEG 2000-DSPE - 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000]（铵盐）；CHEMS – 胆固醇半琥珀酸酯。
表1：塔林脂质体纳米胶囊的制备。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>膜孔径（µm）</td>
			<td>粒径分布（nm）</td>
			<td>平均粒径（nm）</td>
			<td>多分散系数（PdI）</td>
			<td>主峰（nm）</td>
			<td>包封率</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2</td>
			<td>51 - 396</td>
			<td>155</td>
			<td>0.168</td>
			<td>94 ± 39</td>
			<td>0.83</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
通过动态光散射法测定粒径和多分散性指数，包封率则根据 Peterson17 的方法测定。
表2：纳米脂质体制剂的粒径、多分散指数及包封率。

本研究描述了采用薄膜法进行经典水合以制备纳米脂质体，并随后对纳米颗粒进行表征。一种分子量为47 kDa的亲水性球状蛋白——塔林蛋白（tarin），被成功包封，以此策略提高其稳定性、避免快速清除并促进可控释放。该方法亦可适用于疏水性分子的包封。

脂质体纳米胶囊已广泛应用于制药、化妆品和食品工业的诸多领域。脂质体的特性包括其……

将通过挤出技术逐步演示制备脂质体纳米胶囊的过程，并以从芋头（Colocasia esculenta）中纯化的48千道尔顿球状亲水性蛋白tarin的包封为例进行说明。所有用于纳米胶囊表征的步骤，包括扫描电子显微镜和动态光散射分析，也将一并展示。胶囊化过程可能面临诸多挑战，从脂质的选择到实现高包封效率，同时需保持被包封分子的生物活性。本方案将能够克服其中一些困难。使用分析天平称量脂质体组分。将脂质组分溶于氯仿中，使用可适配旋转蒸发仪的容量瓶，以避免材料损失。以 150 RPM 的转速搅拌混合物 15 分钟。使用旋转蒸发仪除去氯仿。将容量瓶瓶口调整至标准位置以获得最佳效率，同时使其接触加热浴中的水。根据所述方案设置参数。约25分钟后，取下烧瓶，并妥善处理蒸发的溶剂。此时会形成一层薄而不透明的膜，可轻易观察到。将脂质膜溶于含有田箐凝集素（tarin）的硫酸铵溶液中，田箐凝集素浓度为每毫升一毫克。搅拌混合物40分钟，并在4摄氏度下孵育过夜。随后，在25摄氏度（室温）下对悬浮液进行超声处理1分钟。为减小囊泡尺寸并防止聚集，将聚碳酸酯膜置于两个预先润湿的滤膜支撑架之间，并放入膜架中。将一个空注射器插入装置的一侧，另一侧的注射器加入一毫升脂质体悬液，然后将两个注射器安装到位。使用孔径为2微米的聚碳酸酯膜进行12次挤出循环。缓慢将样品从一个注射器推至另一个注射器。最终，由于粒径减小，脂质体悬液在转移过程中应变得澄清。此步骤中大约会损失 2 毫升样品。通过超速离心分离脂质体。首先，将样品称重后加入钛管中，并对管子进行配平。检查需填充的最小体积，必要时用硫酸铵调节体积。将钛管装入摆动桶中。打开离心机门，将转子放入其中。关闭离心机门，按下真空按钮，并等待真空度从200降至低于20微米。调整超速离心机显示屏上的参数。按下“调用”按钮，检查条件，然后启动运行。90分钟后，通过点击真空按钮释放真空，并打开离心机门。从内部取出转子。将超速离心样品保持在冰上，然后通过将离心管倒置，将上清液与沉淀分离，转入一次性59毫升离心管中以进一步分离上清液与沉淀。将含有未包封蛋白的上清液于4°C保存。这将用于测定包封效率。沉淀物呈半透明凝胶状。悬浮沉淀物并加热HEPES缓冲盐溶液。有关更多信息，请参阅实验方案。采用 Peterson 法测定包封率，以避免脂质对蛋白质定量的干扰。样品应设三个重复进行分析。在微量离心管中，用水将脂质体上清液或牛血清白蛋白（BSA）稀释至终体积为1毫升，浓度为每毫升1毫克。加入脱氧胆酸钠（DOC），孵育10分钟。然后加入1毫升72%三氯乙酸（TCA），充分混匀。在室温下以 3,000 g 离心 15 分钟。将离心管倒置，避免管口朝下，小心弃去上清液，置于吸水纸上使其干燥。将沉淀重悬于 1 毫升水中。充分混匀，确保沉淀完全溶解。然后将样品转移至试管中，加入1毫升试剂A，混匀后于室温下孵育10分钟。加入5毫升试剂B，混匀后在室温下避光孵育30分钟。在750纳米处测定吸光度，并计算包封率。粒径平均值和粒径分布通过动态光散射法测定。将脂质体纳米囊泡转移至一次性粒径测定比色皿中。将比色皿放入仪器内。设置仪器参数。为测定稳定性，将脂质体在 4°C 下储存，并定期检查其粒径分布和平均粒径。采用扫描电子显微镜对脂质体进行表征，实验按照 Murta 和 Ramasamy 的方法进行三次重复。用胶带将玻璃盖玻片固定在培养皿底部。用多聚-L-赖氨酸包被盖玻片。在培养皿内放置一张湿润的滤纸以保持湿度，孵育1小时。用蒸馏水冲洗。加入一滴样品，在室温下干燥一小时。用磷酸盐缓冲液配制的戊二醛覆盖样品以进行固定。在培养皿内放置湿润的滤纸。密封培养皿非常重要。在4°C条件下孵育48小时。用相同的磷酸盐缓冲液将盖玻片冲洗三次，每次五分钟。按照以下步骤进行样品脱水：使用浓度逐渐增加的乙醇溶液（从35%至无水乙醇）进行洗涤。用六甲基二硅氮烷化学干燥样品，处理10分钟。操作六甲基二硅氮烷时应在通风橱内小心进行。样品应在室温下置于干燥器内或通风橱中过夜干燥。使用碳导电胶带将干燥后的样品固定在样品台上。用金对样品台进行溅射镀膜。使用扫描电子显微镜（SEM）在低真空模式和低电压（20 千伏）下记录 SEM 图像。图一描述了纳米脂质体的制备过程。首先将磷脂、DOPE、PEG 和化学试剂等主要脂质体组分溶解于氯仿中，以获得脂质膜。随后将脂质膜在含有亲水性蛋白塔里宁（tarin）的生理缓冲液中重新水化，以实现包埋，且孵育应过夜进行。然后通过超声处理和挤出法制备小单层囊泡。超速离心步骤用于分离脂质体与游离脂质及未包封的蛋白质。上清液则用于包封率的测定。采用上述方法制备的纳米脂质体，其粒径分布范围为51至396纳米，平均粒径为155纳米。由于多分散指数为168，该制剂具有较好的均一性。当脂质体通过孔径为2微米的膜进行挤出时，包封率可达83%。采用扫描电子显微镜评估纳米脂质体的形态学特征。为了获得更高质量的图像，脂质体最终应以类似于活细胞的方式进行处理。固定和干燥步骤对于确保在真空条件下能够观察到可耐受超过20千伏的小型完整囊泡至关重要。图2A和2B展示了在20千伏下分析的、直径约为121纳米的球形脂质体囊泡。而图2C和2D则显示了制备不当的样品。处理不当的样本仅能用于观察较大或已受损的囊泡，这些囊泡无法耐受真空和/或电压条件。本文所述方案可制备出形态呈圆形、表面光滑、平均大小约为150纳米且可重复的囊泡。该方法可用于包封具有亲水性校正功能的复杂大分子，例如四聚体蛋白。当纳米胶囊在4°C条件下储存时，包封率高于80%，泄漏率极低，低于1.5%。我们希望本视频能够帮助您实现大分子（如teri）的包封。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

生物活性亲水球状蛋白的纳米脂质体制备与表征

来源：Zhu, J., 等.，用于包裹神经生长因子的新型高密度脂蛋白模拟纳米颗粒的制备与表征。J. Vis. Exp.

将神经生长因子包封于高密度脂蛋白模拟纳米颗粒中

本实验方案的目的是描述由两亲性嵌段共聚物组成的胶束药物递送系统中，对物理包埋的难溶性药物进行制备和表征的方法。...

单药与多药负载的物理包埋型聚合物胶束的制备与表征

我们报道了一种利用碳纳米管对含有自组装纳米结构内核的脂质颗粒进行动力学稳定化的智能应用。制备此类脂质颗粒仅需较低浓度的碳纳米管，因而可将其应用于药物递送等生物医学领域。...

碳纳米管稳定的内源性自组装脂质颗粒的简便制备

采用简单的均质化方法制备新型高密度、模拟高密度脂蛋白的纳米颗粒，用于包载神经生长因子。本文详细阐述了纳米颗粒制备过程中的挑战及具体实验方案， 体外 表征，以及 体内 本文描述了相关研究。...

新型高密度脂蛋白模拟纳米颗粒的制备及表征用于包载神经生长因子

在此，我们介绍一种基于干膜法制备阳离子纳米脂质体的实验方案，该方法可用于安全高效地递送 体外...

用于高效递送的阳离子纳米脂质体的制备 体外 转录的信使RNA

本文介绍了一种利用天然细胞膜纳米颗粒系统结合电子显微镜技术测定膜蛋白寡聚状态的实验方案。...

用于膜蛋白-蛋白相互作用分析的天然细胞膜纳米颗粒系统

采用微流控混合平台方法开发用于mRNA和DNA包封的脂质纳米颗粒。...

利用微流控混合平台制备和表征用于基因递送的脂质纳米颗粒

本方案描述了辛醇辅助脂质体组装（OLA）技术，这是一种用于生成生物相容性脂质体的微流控方法。OLA...

芯片上辛醇辅助脂质体组装用于生物工程

本文介绍了含有纳米盘的生物活性物质的制备与表征方法。以两性霉素B纳米盘为例，逐步描述了该实验方案。...

含生物活性剂纳米盘的制备与表征

我们介绍一种用于重建膜蛋白并将酶及其他水溶性组分包裹于亚微米及微米级脂质囊泡中的实验方案。...

构建纳米和微米级囊泡中非平衡代谢网络

学习使用薄膜法制备包裹亲水蛋白tarin的纳米脂质体，通过挤出技术和动态光散射进行表征。该方法可实现高包封效率，为药物递送提供稳定载体。

用于包载生物活性亲水性球状蛋白质的纳米脂质体的制备与表征

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