用于包载生物活性亲水性球状蛋白质的纳米脂质体的制备与表征

将通过挤出技术逐步演示制备脂质体纳米胶囊的过程，并以从芋头（Colocasia esculenta）中纯化的48千道尔顿球状亲水性蛋白tarin的包封为例进行说明。所有用于纳米胶囊表征的步骤，包括扫描电子显微镜和动态光散射分析，也将一并展示。胶囊化过程可能面临诸多挑战，从脂质的选择到实现高包封效率，同时需保持被包封分子的生物活性。

本方案将能够克服其中一些困难。使用分析天平称量脂质体组分。将脂质组分溶于氯仿中，使用可适配旋转蒸发仪的容量瓶，以避免材料损失。

以 150 RPM 的转速搅拌混合物 15 分钟。使用旋转蒸发仪除去氯仿。将容量瓶瓶口调整至标准位置以获得最佳效率，同时使其接触加热浴中的水。

根据所述方案设置参数。约25分钟后，取下烧瓶，并妥善处理蒸发的溶剂。此时会形成一层薄而不透明的膜，可轻易观察到。

将脂质膜溶于含有田箐凝集素（tarin）的硫酸铵溶液中，田箐凝集素浓度为每毫升一毫克。搅拌混合物40分钟，并在4摄氏度下孵育过夜。随后，在25摄氏度（室温）下对悬浮液进行超声处理1分钟。

为减小囊泡尺寸并防止聚集，将聚碳酸酯膜置于两个预先润湿的滤膜支撑架之间，并放入膜架中。将一个空注射器插入装置的一侧，另一侧的注射器加入一毫升脂质体悬液，然后将两个注射器安装到位。使用孔径为2微米的聚碳酸酯膜进行12次挤出循环。

缓慢将样品从一个注射器推至另一个注射器。最终，由于粒径减小，脂质体悬液在转移过程中应变得澄清。此步骤中大约会损失 2 毫升样品。

通过超速离心分离脂质体。首先，将样品称重后加入钛管中，并对管子进行配平。检查需填充的最小体积，必要时用硫酸铵调节体积。

将钛管装入摆动桶中。打开离心机门，将转子放入其中。关闭离心机门，按下真空按钮，并等待真空度从200降至低于20微米。

调整超速离心机显示屏上的参数。按下“调用”按钮，检查条件，然后启动运行。90分钟后，通过点击真空按钮释放真空，并打开离心机门。

从内部取出转子。将超速离心样品保持在冰上，然后通过将离心管倒置，将上清液与沉淀分离，转入一次性59毫升离心管中以进一步分离上清液与沉淀。将含有未包封蛋白的上清液于4°C保存。

这将用于测定包封效率。沉淀物呈半透明凝胶状。悬浮沉淀物并加热HEPES缓冲盐溶液。

有关更多信息，请参阅实验方案。采用 Peterson 法测定包封率，以避免脂质对蛋白质定量的干扰。样品应设三个重复进行分析。

在微量离心管中，用水将脂质体上清液或牛血清白蛋白（BSA）稀释至终体积为1毫升，浓度为每毫升1毫克。加入脱氧胆酸钠（DOC），孵育10分钟。然后加入1毫升72%三氯乙酸（TCA），充分混匀。

在室温下以 3,000 g 离心 15 分钟。将离心管倒置，避免管口朝下，小心弃去上清液，置于吸水纸上使其干燥。将沉淀重悬于 1 毫升水中。

充分混匀，确保沉淀完全溶解。然后将样品转移至试管中，加入1毫升试剂A，混匀后于室温下孵育10分钟。

加入5毫升试剂B，混匀后在室温下避光孵育30分钟。在750纳米处测定吸光度，并计算包封率。粒径平均值和粒径分布通过动态光散射法测定。

将脂质体纳米囊泡转移至一次性粒径测定比色皿中。将比色皿放入仪器内。设置仪器参数。

为测定稳定性，将脂质体在 4°C 下储存，并定期检查其粒径分布和平均粒径。采用扫描电子显微镜对脂质体进行表征，实验按照 Murta 和 Ramasamy 的方法进行三次重复。用胶带将玻璃盖玻片固定在培养皿底部。

用多聚-L-赖氨酸包被盖玻片。在培养皿内放置一张湿润的滤纸以保持湿度，孵育1小时。用蒸馏水冲洗。

加入一滴样品，在室温下干燥一小时。用磷酸盐缓冲液配制的戊二醛覆盖样品以进行固定。在培养皿内放置湿润的滤纸。

密封培养皿非常重要。在4°C条件下孵育48小时。用相同的磷酸盐缓冲液将盖玻片冲洗三次，每次五分钟。

按照以下步骤进行样品脱水：使用浓度逐渐增加的乙醇溶液（从35%至无水乙醇）进行洗涤。用六甲基二硅氮烷化学干燥样品，处理10分钟。操作六甲基二硅氮烷时应在通风橱内小心进行。

样品应在室温下置于干燥器内或通风橱中过夜干燥。使用碳导电胶带将干燥后的样品固定在样品台上。用金对样品台进行溅射镀膜。

使用扫描电子显微镜（SEM）在低真空模式和低电压（20 千伏）下记录 SEM 图像。图一描述了纳米脂质体的制备过程。首先将磷脂、DOPE、PEG 和化学试剂等主要脂质体组分溶解于氯仿中，以获得脂质膜。

随后将脂质膜在含有亲水性蛋白塔里宁（tarin）的生理缓冲液中重新水化，以实现包埋，且孵育应过夜进行。然后通过超声处理和挤出法制备小单层囊泡。超速离心步骤用于分离脂质体与游离脂质及未包封的蛋白质。

上清液则用于包封率的测定。采用上述方法制备的纳米脂质体，其粒径分布范围为51至396纳米，平均粒径为155纳米。由于多分散指数为168，该制剂具有较好的均一性。

当脂质体通过孔径为2微米的膜进行挤出时，包封率可达83%。采用扫描电子显微镜评估纳米脂质体的形态学特征。为了获得更高质量的图像，脂质体最终应以类似于活细胞的方式进行处理。

固定和干燥步骤对于确保在真空条件下能够观察到可耐受超过20千伏的小型完整囊泡至关重要。图2A和2B展示了在20千伏下分析的、直径约为121纳米的球形脂质体囊泡。而图2C和2D则显示了制备不当的样品。

处理不当的样本仅能用于观察较大或已受损的囊泡，这些囊泡无法耐受真空和/或电压条件。本文所述方案可制备出形态呈圆形、表面光滑、平均大小约为150纳米且可重复的囊泡。该方法可用于包封具有亲水性校正功能的复杂大分子，例如四聚体蛋白。

当纳米胶囊在4°C条件下储存时，包封率高于80%，泄漏率极低，低于1.5%。我们希望本视频能够帮助您实现大分子（如teri）的包封。