树突棘从锥体神经元的三维定量从人类诱导多能干细胞衍生
October 10th, 2015
锥体神经元的树突棘是哺乳动物大脑皮质最兴奋性突触的部位。此方法描述在从诱导的多能干细胞衍生的人皮质锥体谷氨酸能神经元脊柱形态的三维定量分析。
该程序的总体目标是对来自人类诱导多能干细胞的周神经元的树突棘进行成像，并在三个维度上对其进行量化。这是通过首先用聚氨酯和层粘连蛋白处理 6 孔板中的盖玻片来培养神经干细胞来实现的。接下来，在培养物中稀释神经干细胞。
使用轻轻旋转的移液管运动对培养基进行铺板，并在培养中分化长达 70 天。通过定期更新培养基，然后用 GFP 慢病毒转导细胞，用抗 GFP 抗体染色并观察。最后，固定培养物，并使用共聚焦显微镜对树突棘进行成像。
最终，人类树突棘的图像数据以 3D 形式重建，用于分类和量化。该协议提供了一个逐步程序来获得人脑皮层第 2 至第 4 层的谷氨酸能神经元。它涉及使用源自人类诱导的强效干细胞的神经干细胞，这些干细胞来源于先前发表的方法，来源于人类成纤维细胞。
我们现有方法的这种技术的主要优点是允许在 3D 中自动分割 DON right 和 PY。与现有软件相比，这大大增加了时间，因为现有软件通常仅从 2D 分析中准备。分类中的 donr 和 spy 非常方便且易于使用。
为了制备神经元培养物，将玻璃盖玻片放入六个孔培养皿中，第二天加入聚鸟氨酸，在流动罩下孵育过夜。使用 DPBS 清洗盖玻片 3 次，并加入层粘连蛋白，在流动罩下孵育至少 10 小时。准备包含以下组分的培养基。
然后使用培养基以每平方厘米 50， 000 个细胞的密度对神经干细胞或 NSCS 进行铺板和调度，以缓慢旋转的动作移液，以减少细胞聚集以转导人 IPSC 衍生的神经元。在成熟的任何步骤中，在每个含有新鲜培养基的培养孔中加入 1 微升含有 40 ngGFP 慢病毒载体的储备液，并在 37 摄氏度下孵育 48 小时。要制备用于免疫荧光的细胞，请去除培养基并使用 4% 甲醛在室温下固定转导的细胞 10 分钟。
然后使用一个 XPBS 洗涤细胞 3 次，每次 10 分钟。接下来，将盖玻片浸入补充有 0.05% Triton X 110% 马血清的 PBS 中，并在室温下孵育 1 小时。然后用 PBS 清洗盖玻片 3 次。
向每个盖玻片中加入 100 μL PBS 4% 马血清中的第 1000 个 GFP 一抗。在 4 摄氏度的暗箱中孵育过夜。现在在 PBS 0.5%吐温 20 中稀释 Alexa Fluor 4 88 偶联抗体 1 至 200，并在使用 PBS 洗涤载玻片 3 次后，将细胞与抗体溶液在室温下孵育 1 小时。
使用安装介质安装用于荧光显微镜检查的载玻片。在共聚焦显微镜下，每种情况至少选择 10 个具有副金属形态和折叠树突树枝化的健康神经元，以量化每个树突 60 至 100 微米。使用 40 x na、1.3 油物镜和 488 纳米激光器采集图像，样品水平的典型峰值功率约为 20 微瓦，将像素大小设置为 80 纳米左右，以正确采样树突棘。
要对整个神经元体积进行采样，请获取 Z 间距为 150 至 300 纳米的 Z 堆栈，产生 20 至 30 个 Z 切片，以对树突棘进行 3D 定量。对分析软件使用以下设置进行预处理。通过选择 Image processing smoothing Gaussian filter （图像处理平滑高斯滤波器） 来使用高斯筛选。
将滤镜宽度设置为等于 XY 平面中的像素大小，以从 filament tracer 模块对树突执行半自动跟踪。在 slice （切片） 选项卡中，使用距离工具估计枝晶直径。接下来，在 surpassed 选项卡中，单击 filaments 工具并选择 skip automatic creation 以获得更好的稳健性 在 draw 选项卡中。
现在，将 select auto path 作为方法，将 dendrite 作为类型，并输入估计的枝晶直径。使用指针的选择模式，将光标变成一个框，然后选择 shift 并右键单击树突起点。软件将执行初始计算。
现在，将指针从起点沿树突移动。将显示一条黄线，表示最可能的树突路径。按 Shift 键和向左键。
单击 dendrite 端点以在模块界面中执行自动 spine 分割。单击 rebuild 下拉列表中的 creation 选项卡。选择 rebuild dendrite diameter 并选中 keep data 框。
然后单击 rebuild。设置阈值，以便分段的体积与实际的树枝状体积相对应。作为算法，从 distance map 中选择 shortest distance。
然后单击切片选项卡下的下一步按钮，确定最小的脊椎、头部直径和最大长度。然后在 超越 选项卡下，输入最小直径为 200 到 300 纳米左右的参数值，最大长度为 4 微米左右是不错的起点，无需选中 允许刺 框，单击 下一步 按钮。接下来，调整种子点阈值，使表示书脊的蓝色点定位到实际的书脊头部。
然后单击 Next。现在将执行核心计算，并且可能需要一些时间来对 spine 进行分类，在模块界面的 tools 选项卡下，单击 classify spine。在验证了文本协议中概述的四个类后，模块接口将使用分类结果生成四个新的 filament 对象。
最后，通过单击 export all statistics to file （将所有统计信息导出到文件） 选项卡下导出统计数据。该图说明了标记的抗 β 3 微管蛋白抗体的人类神经元的培养。细胞聚集的趋势在这里也很明显。
此处显示的是 A GFP 标记的旁金属神经元，在从晚期皮质祖细胞分化后 40 天。从浅表皮质层。插图显示了具有表观细胞体的较低放大倍数。
这些面板代表了树突棘在不同成熟阶段的 3D 重建。脊柱密度和脊柱头部体积的定量分析如下所示。正如预期的那样，这两个参数在培养期间会增加。
在尝试培养程序时，重要的是要非常小心地接种和调度神经干细胞，通过轻轻旋转运动缓慢添加细胞以减少细胞胆碱。事实上，这种方法需要识别单个神经元。
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概述
本方法描述了从诱导多能干细胞衍生的人类皮质锥体谷氨酸能神经元树突刺的3D定量分析。该程序涉及对这些刺的成像和定量，以更好地理解其形态学。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 干细胞研究
背景
- 树突刺对于大脑中的突触传递至关重要。
- 锥体神经元是皮质中主要的兴奋性神经元类型。
- 了解刺的形态可以提供神经连接的洞见。
- 诱导多能干细胞为研究人类神经元提供了模型。
研究目的
- 分析人类神经元中树突刺的形态。
- 量化三维中刺的特征。
- 增进对人类大脑中突触结构的理解。
所用方法
- 在处理过的盖玻片上培养神经干细胞。
- 将干细胞分化最多70天。
- 使用GFP慢病毒转导以便可视化。
- 使用共聚焦显微镜成像树突刺。
主要结果
- 成功对培养的神经元中树突刺进行成像。
- 实现了刺形态的定量分析。
- 对人类皮质神经元的结构特性有了洞见。
- 为未来突触结构的研究建立了方法论。
结论
- 该方法提供了一种研究树突刺的可靠方法。
- 研究结果有助于理解兴奋性突触。
- 在神经发育和神经退行性研究中具有潜在应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Three-dimensional quantification of dendritic spines in human iPSC-derived pyramidal neurons enables high-fidelity morphological analysis critical for early CNS target validation. This workflow supports predictive confidence in synaptic function studies and de-risks translational neuroscience programs by providing human-relevant, quantitative readouts. The approach is positioned to inform portfolio decisions in neuropsychiatric and neurodegenerative disease research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic interrogation of synaptic structure in human-derived neurons.
- Supports functional target validation by quantifying spine density and morphology.
- Facilitates predictive confidence in disease-relevant neuronal models.
- Provides a platform for comparative studies between control and patient-derived cells.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible 3D imaging and quantification workflows.
- Generates quantitative outputs suitable for downstream compound screening.
- Prepares validated neuronal systems for high-content analysis platforms.
- Enables reliable evaluation of synaptic modulators in human context.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant human neuronal phenotypes.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in CNS pipelines.
- Provides quantitative endpoints for translational biomarker development.
- De-risks advancement decisions by anchoring on human neuronal data.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust hypothesis testing and quantitative phenotyping in human iPSC-derived neuronal models.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and mechanistic de-risking via 3D spine analysis.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible quantitative outputs for compound evaluation.
- Analytics: Delivers statistical measurements of spine density, head volume, and maturation state.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to disease-relevant human neuronal systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for diverse CNS research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes 3D imaging and quantification for scalable, reproducible outputs.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency in neurobiology portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS assets based on human-relevant data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in human iPSC culture and neuronal differentiation.
- Demands access to confocal microscopy and advanced image analysis software.
- Necessitates cross-team standardization of imaging and quantification parameters.
- Adaptation may be needed for different neuronal subtypes or disease models.
- Careful cell handling is critical to ensure single-neuron identification and reduce clustering.
