源自人诱导性多能干细胞的锥体神经元树突棘三维定量分析

本实验的总体目标是对来源于人诱导性多能干细胞的皮层神经元的树突棘进行三维成像并量化分析。首先，在六孔板中用多聚赖氨酸和层粘连蛋白处理盖玻片，用于神经干细胞的培养。随后将神经干细胞稀释后接种于培养基中。

采用轻柔的旋转移液操作将细胞接种于培养基中，并在培养条件下使其分化长达70天。通过定期更换培养基，随后用表达GFP的慢病毒感染细胞，再用抗GFP抗体染色并进行观察。最后，固定培养物，并利用共聚焦显微镜对树突棘进行成像。

最终，对人类树突棘的图像数据进行三维重建，以实现其分类与定量分析。本方案提供了一步一步的操作流程，用于获取人脑皮层第二至第四层的谷氨酸能神经元。该方法基于已发表的技术，利用来源于人成纤维细胞的诱导性多能干细胞所衍生的神经干细胞进行培养。

与现有方法相比，本技术的主要优势在于能够实现对3D图像中DON右半部分和PY的自动分割。相较于通常仅基于2D分析的现有软件，该方法在时间效率上具有显著提升。DONR和SPY分类方法同样非常便捷且易于使用。

制备神经元培养物时，将玻璃盖玻片放入六孔培养板中，加入多聚鸟氨酸，在超净工作台中孵育过夜。次日，使用DPBS洗涤盖玻片三次，然后加入层粘连蛋白，在超净工作台中孵育至少10小时。准备含有以下成分的培养基。

然后使用培养基以每平方厘米50,000个细胞的密度接种并铺板神经干细胞（NSCs），通过缓慢旋转吹打的方式减少细胞聚集，以转导人iPSC来源的神经元。在任何成熟阶段，向含有新鲜培养基的培养孔中加入1微升含有40纳克GFP慢病毒载体的储存液，并在37°C下孵育48小时。为免疫荧光实验准备细胞时，移除培养基，并用4%多聚甲醛在室温下固定转导后的细胞10分钟。

然后用一份XPBS洗涤细胞，每次10分钟，共洗涤三次。接着将盖玻片浸入含有0.05% Triton X-100和10%马血清的PBS中，在室温下孵育一小时。然后用PBS洗涤盖玻片三次。

在含有4%马血清的100微升PBS中加入1:1000稀释的GFP一抗，分别加入每个盖玻片上。置于暗盒中，4摄氏度孵育过夜。随后，将Alexa Fluor 488标记的二抗按1:200比例稀释于含0.5% Tween 20的PBS中，用PBS洗涤载玻片三次后，在室温下用该抗体溶液孵育细胞1小时。

使用封片剂将切片封片，用于荧光显微镜观察。在共聚焦显微镜下，每种条件下选择至少10个形态正常、具有旁中线形态和分支状树突结构的健康神经元，以定量分析每根树突60至100微米的范围。使用40倍、数值孔径1.3的油镜和488纳米激光器（样品层面的典型峰值功率约为20微瓦），将像素大小设置为约80纳米，以实现对树突棘的适当采样。

为了采样整个神经元体积，以150至300纳米的Z间距获取Z轴层叠图像，获得20到30个Z层面，用于树突棘的三维定量分析。使用以下设置进行分析软件的预处理：选择图像处理中的高斯平滑滤波器进行高斯滤波。

将滤波器宽度设置为等于 XY 平面上的像素尺寸，以从纤维追踪模块中对树突进行半自动追踪。在切片选项卡中，使用距离工具估算树突直径。接下来，在“已超越”选项卡中，单击纤维工具，并在绘制选项卡中选择跳过自动创建，以获得更好的鲁棒性。

现在选择自动路径作为方法，树突作为类型，并输入估计的树突直径。使用指针的选择模式，将光标变为方框，按住 Shift 键并右键单击树突的起始点。软件将执行初步计算。

现在从起始点开始沿树突移动指针。此时会显示一条黄色线条，代表最可能的树突路径。按住 Shift 键并单击左键。

单击树突末端点，以在模块界面中执行自动棘突分割。在重建下拉列表中单击“创建”选项卡。选择重建树突直径，并勾选保留数据复选框。

然后点击重建。设置阈值，使分割出的体积与实际树突体积相对应。算法选择距离图的最短距离。

然后点击切片选项卡下方的“下一步”按钮，确定最小的棘突头部直径和最大长度。接着在“超越”选项卡下，输入参数值，最小直径约为200至300纳米，最大长度为4微米，这些是不错的起始值。不要勾选“允许棘突”复选框，然后点击“下一步”按钮。接下来，调整种子点阈值，使代表棘突的蓝色点准确地位于实际的棘突头部位置。

然后点击下一步。核心计算将开始执行，可能需要一定时间。在模块界面的工具选项卡中，点击“分类树突棘”。在确认分类结果包含文本方案中所述的四类后，模块界面将生成四个新的丝状结构对象，分别对应分类结果。

最后，通过点击“将所有统计信息导出到文件”按钮，在统计选项卡下导出统计数据。该图展示了用抗 βIII 微管蛋白抗体标记的人类神经元的培养情况。此处 также 可明显观察到细胞聚集的趋势。

图中显示的是一个GFP标记的侧部神经元，在晚期皮质前体细胞分化40天后，来自大脑皮质浅层。插图显示了较低放大倍数下的图像，可见明显的细胞体。

这些图版展示了不同成熟阶段树突棘片段的三维重建。此处显示了树突棘密度和树突棘头部体积的定量分析结果。正如预期，这两个参数随着培养时间的延长而增加。

在进行培养操作时，加入细胞时应缓慢并采用轻柔的旋转动作，以减少细胞损伤，因此必须非常小心地接种和处理神经干细胞。实际上，该方法需要对单个神经元进行鉴定。