정량 실시간 PCR에 의해 마우스 유방 종양 모델에서 폐 전이의 평가

이 절차의 전반적인 목표는 전이를 분석하기 위한 방법으로 폐의 종양 세포에서 특정 mRNA의 양을 검출하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 전이의 정량적 측정이라는 것입니다. 폐 종양 해부를 수행하려면 텍스트 프로토콜에 따라 치사량의 이소플루오린을 사용하여 마우스를 안락사시킨 후 팔다리를 벌린 상태로 등의 폼 보드에 마우스를 놓고 해부 핀을 사용하여 보드에 고정합니다.

에탄올을 사용하여 마우스에 스프레이 한 후 집게를 사용하여 동물의 중앙 부분을 잡고 가위로 피부를 통해 목을 향해 위쪽으로 자르고 마우스의 복강을 뚫지 않도록주의하십시오. 이제 동물의 아래쪽 끝에 있는 복막을 잡고 목 아래쪽을 향해 위쪽으로 자르기 시작합니다. 흉곽의 왼쪽과 오른쪽을 따라 조심스럽게 자르고 흉강으로 출혈할 수 있는 혈관이 절단되지 않도록 주의하십시오.

횡격막과 흉곽의 윗부분을 통해 왼쪽과 오른쪽으로 절단하여 갈비뼈를 제거합니다. 그런 다음 집게를 사용하여 마우스의 기관을 잡고 앞으로 당기고 해부 가위를 사용하여 기관을 절단한 후 마우스에서 폐를 제거합니다. PBS를 사용하여 폐 조직을 부드럽게 씻으십시오.

그런 다음 텍스트 프로토콜에 따라 폐 조직에 대한 전체 평가 후 폐를 즉시 분석해야 하는 경우 RNA 분리를 진행합니다. 조직에서 RNA를 분리하려면 텍스트 프로토콜에 나열된 방법 중 하나를 사용하여 조직을 균질화하는 것으로 시작합니다. RNA 분리 키트에서 용해 완충액을 준비하고, 용해 완충액 1밀리리터에 20마이크로리터의 종양 캡토에탄올을 추가합니다.

300 마이크로 리터의 용해 완충액에 30g의 조직마다 재현탁하고 30 % 진폭으로 설정된 초음파 발생기로 조직을 10 초 동안 초음파 처리합니다. 590 마이크로 리터의 TE 완충액에 10 마이크로 리터의 프로티 나제 K를 추가하고, 300 마이크로 리터의 초음파 처리 된 조직에 600 마이크로 리터의 완충액을 추가합니다. 실온에서 10분 동안 배양합니다.

다음으로, 13 이상, 000 시간 G 보다 크거나 같은 것에 파편을 제거하기 위하여 10 분 동안 표본을 분리기. 그런 다음 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 상등액 900마이크로리터당 450마이크로리터의 에탄올을 첨가하여 RNA를 침전시킵니다.

그런 다음 700마이크로리터의 용해물 에탄올 혼합물을 RNA 컬럼으로 옮깁니다. 13 이상, 1 분 동안 000 번 G보다 크거나 같은 속도로 다시 회전시켜 RNA를 컬럼에 바인딩합니다. 그런 다음 액체 폐기물을 버리고 남은 상층액을 컬럼에 첨가하고 다시 회전시킵니다.

다음으로, 350마이크로리터의 세척 버퍼 1을 컬럼 상단 부분에 추가하고 샘플을 30초 동안 원심분리합니다. 액체 폐기물을 버리고 튜브의 컬럼을 교체하십시오. 각 샘플에 대해 5단위의 DNase 1 효소와 5마이크로리터의 10X DNase 완충액 및 40마이크로리터의 DNase RNase 자유수를 혼합하여 DNase를 준비합니다.

각 컬럼에 50마이크로리터의 DNase 혼합물을 추가하고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 350마이크로리터의 세척 버퍼를 컬럼에 추가하고 30초 동안 샘플을 원심분리합니다. 폐액을 버린 후 600마이크로리터의 세척 버퍼 2를 넣고 30초 더 돌립니다.

250마이크로리터의 세척 버퍼 2를 추가하기 전에 액체를 버리고 2분 동안 회전시킵니다. 컬럼을 새 수집 튜브로 옮기고 50-100마이크로리터의 RNase DNase 자유수를 컬럼에 추가합니다. 1분 동안 배양한 후 1분 동안 돌립니다.

수집된 용리액을 컬럼을 통해 다시 실행하여 RNA 수율을 높입니다. 즉시 사용할 수 있도록 샘플을 얼음 위에 보관하십시오. 나중에 사용할 수 있도록 드라이 아이스 또는 액체 질소에 급동하고 필요할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.

분광 광도계를 사용하여 RNA를 정량화합니다. 그런 다음 멸균 RNase DNase free PCR 튜브 또는 플레이트에서 0.5 - 2 마이크로그램의 총 RNA를 사용하여 이 표와 같이 1차 전합성을 위한 반응 혼합물을 준비합니다. 혼합하고 부드럽게 원심분리한 다음 여기에 표시된 프로그램을 사용하여 표준 PCR 기계를 프로그래밍합니다.

반응이 완료되면 멸균된 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 완성된 반응을 원하는 부피로 희석합니다. 실시간 PCR을 수행하려면 human HER2와 같은 positive control C DNA를 사용하여 C DNA의 1-4개의 연속 희석을 준비하여 5개의 표준물질을 생성함으로써 각 프라이머 세트에 대한 표준 곡선을 설정합니다. 다음으로, 표준 곡선과 실험 표본을 포함해야 하는 총 표본의 수를 계산합니다.

그런 다음 멸균 RNase DNase free tube에서 관심 있는 각 실험 유전자에 대한 마스터 믹스와 gapdh와 같은 내부 대조군을 준비합니다. 각 표준물질 또는 실험 샘플에 대해 1마이크로리터의 C DNase가 포함된 테스트 플레이트를 준비합니다. 각 프라이머 프로브에 대해 웰당 하나 이상의 C DNA 샘플을 할당합니다.

각 프라이머 프로브에 대해 웰당 19마이크로리터의 마스터믹스를 추가합니다. 이 생물 발광 실험은 간극연접 단백질 Connexin 43을 표적으로 하는 ACT1으로 처리된 쥐의 폐가 루시페라제 활성에 대해 음성으로 나타남을 보여주며, 이는 조직에 종양 세포가 없음을 시사합니다. 그러나 폐 조직의 H&E 절편을 분석한 결과, 루시퍼라아제에 의해 밝혀지지 않은 미세전이가 나타나며, 이는 루시퍼라아제 영상이 적은 수의 종양 세포를 검출할 만큼 민감하지 않다는 것을 시사합니다.

다음은 HER2에 특이적인 프로브를 사용하여 마우스 기억 지방 패드에 원래 이식된 세포에서 폐 조직의 인간 HER2와 JIMT1 종양 세포를 검출하기 위한 qRT-PCR 실험의 결과입니다. 폐 중 어느 곳에서도 눈에 띄는 전이가 관찰되지 않았지만 11개 샘플 중 2개에서 qRT-PCR이 전이를 감지했습니다. 이 그림에서는 세포 번호 시리즈에서 마우스 폐 갭으로 정규화된 상대적 HER2 수준을 결정하기 위해 표준 곡선 분석이 준비되었습니다.

결과는 HER2 프로브를 사용하는 qRT-PCR이 10개 미만의 세포에서 HER2 수준을 감지할 수 있을 만큼 민감하다는 것을 나타냅니다. 마지막으로, 이 회귀 분석은 양성 및 음성 대조군을 포함하여 각 폐 샘플의 상대적 세포 수를 보여줍니다. 이 기술을 한 번 숙달하면 제대로 수행한다면 6시간에서 8시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 RNA 분리 및 역전사효소 반응 중에 RNA 무결성을 유지하기 위해 예방 조치를 취하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 정량적 실시간 PCR을 통해 폐 전체 조직에서 전이를 감지하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.