유방암 전이에 폐포 대 식세포의 역할을 공부

이 실험의 전반적인 목표는 유방암의 syngenaic model을 사용하여 암 전이에서 폐포 대식세포의 역할을 결정하는 것입니다. 이 방법은 종양 면역학 및 암 전이 분야의 주요 질문 중 일부에 답할 수 있으며, 예를 들어 폐가 가장 흔한 표적 중 하나가 간병원성 암 전이인 이유와 같은 질문에 답할 수 있습니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 폐포 미세세포의 매우 구체적인 방법과 함께 매우 잘 확립된 유방암 모델을 사용한다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 연구원인 Surya Kumari Vadrevu입니다. 종양 세포 주사 당일, 먼저 면도하고 마취된 마우스를 수술 패드에 놓습니다. 다음으로, 100마이크로리터의 PBS에 있는 10에서 5번째 종양 세포를 29게이지 바늘이 장착된 영점 5밀리리터 인슐린 주사기에 1회 흡인합니다.

그런 다음 엄지와 검지를 사용하여 두 번째와 세 번째 젖꼭지 근처의 피부를 들어 올리고 피부 아래의 바늘을 세 번째 젖꼭지 바로 아래의 유방 지방 패드에 삽입합니다. 세포를 천천히 피하주사하여 피부 아래에 거품을 형성하고 동물이 완전히 회복될 때까지 모니터링하면서 동물을 우리로 되돌립니다. 접종 후 4-5일 후에 종양을 측정하기 위해 종양 부위를 만지고, 캘리퍼를 사용하여 종양의 가장 큰 직경과 가장 작은 직경을 모두 사용하여 종양의 부피를 측정합니다.

주입된 41GFP 세포를 이미지화하려면 마취된 마우스를 이미저 내부의 가동 가능한 스테이지에 놓고 형광 현미경 검사로 종양 부위를 이미지화합니다. 종양 세포 주입 6일 후 라미너 기류 생물 안전 캐비닛에서 리포좀을 소용돌이하여 입자를 고르게 분포시키고 60마이크로리터의 현탁액을 멸균 피펫 팁으로 흡인합니다. 마취된 종양이 접종된 동물의 콧구멍 근처에 팁을 놓고 5마이크로리터의 리포좀 용액을 천천히 방출하여 마우스가 방울을 흡입할 수 있도록 합니다.

동물이 분만 중에 규칙적으로 숨을 쉴 수 있도록 적절한 수준의 마취를 유지하면서 리포좀 용액을 천천히 투여하는 것이 중요합니다. 60마이크로리터를 모두 투여한 후 마우스가 완전히 회복되도록 하고 동물을 우리로 되돌려 보냅니다. 폐 표면 전이를 계수하고 점수를 매기려면 폐를 해부 현미경 아래에 놓고 폐 표면이 명확하게 보일 때까지 대물렌즈의 초점을 맞춥니다.

그런 다음 두 폐의 전방 및 후방의 metasteses를 수동으로 계산하고 형광 현미경 검사로 종양을 이미지화합니다. 전이를 세고 영상화한 후 수술용 가위와 집게를 사용하여 폐를 다지고 조직 조각을 3ml의 소화 완충액이 들어 있는 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 섭씨 37도의 인큐베이터에서 회전하는 셰이커에서 40분 동안 단편을 염료 테스트한 다음 슬러리를 분쇄하여 조직을 분리합니다.

다음으로, 40미크론 스트레이너를 통해 조직 현탁액을 필터링하여 덩어리를 제거하고 필요에 따라 주사기 플런저로 스트레이너를 통해 더 큰 조각을 누릅니다. 단일 세포 현탁액이 달성되면 원심분리로 세포를 수집하고 실온에서 10분 동안 ACK 버퍼로 적혈구를 용해합니다. 그런 다음 펠릿을 8ml의 RPMI로 두 번 세척합니다.

두 번째 원심분리 후, 계수를 위해 3ml의 완전한 RPMI 배지에 세포를 현탁시키고 세포를 다시 스핀다운합니다. 이제 세포를 FAX 버퍼 농도 100 마이크로 리터 당 6 번째 세포에 1 배 10으로 희석하고 세포의 100 마이크로 리터 eloquotes를 V-bottom, 96 well plate의 개별 well로 옮깁니다. 원심분리로 웰 바닥에 있는 세포를 모은 다음 플레이트를 뒤집어 완충액이 배출되도록 합니다.

100마이크로리터의 CD16 CD32 FC 블록으로 셀을 섭씨 4도에서 15분 동안 차단하고 플레이트를 다시 원심분리합니다. 그런 다음 방금 시연한 것처럼 플레이트를 뒤집어 상층액을 제거하고 관심 항체 칵테일을 적절한 웰에 추가합니다. 섭씨 4도에서 30분 후 원심분리로 세포를 펠렛화한 다음 200마이크로리터의 FAX 버퍼로 세척합니다.

그런 다음 펠릿을 200마이크로리터의 신선한 PBS에 다시 현탁시키고 섭씨 4도에서 20분 동안 생존력 염료로 샘플을 염색합니다. 배양이 끝나면 다른 200 마이크로 리터의 PBS로 세포를 세척하고 섭씨 4 도에서 보관하기 위해 1 % 파라 포름 알데히드 100 마이크로 리터에 샘플을 고정합니다. 분석 직전에 세포 현탁액을 폴리프로필렌 유세포 분석 튜브로 옮깁니다.

4T1GFP 종양 세포를 유방 지방 패드에 주입하면 폐 내에서 관찰되는 빠르게 형성되는 전이에 의해 입증된 바와 같이 인간 유방암의 전이성 확산을 재현하는 마우스 종양이 형성됩니다. GFP를 이용한 4T1 세포의 안정적인 transfection은 전이된 종양 세포의 추적과 전이성 부담의 정량화를 용이하게 합니다. 디지털 병리학 알고리즘과 함께 일상적인 혈액 관리는 전이를 정량화하고 확인하기 위한 좋은 도구를 제공합니다.

또한 다중 색상 유동 사이클 분석을 통해 CD11b 음성, CD11c F80 양성 폐포 대식세포와 같은 희귀 세포 집단의 특성을 분석할 수 있습니다. 이비클로트렌산의 고갈은 리포솜 처리된 동물의 해리된 폐에 이러한 CD11c F480 양성 세포가 없음에 의해 확인될 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 유방 지방 패드에 종양 세포를 주입하고, 종양 성장 및 전이를 모니터링하고, 폐포 대식세포를 고갈시키고, 유동 순환 분석을 위해 폐 세포를 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.