High-Resolution Análise Quantitativa immunogold de Receptores de Membrana na retina fita Sinapses

O objetivo geral deste experimento é desenvolver uma nova abordagem para analisar quantitativamente as proteínas de membrana nas sinapses da fita retiniana. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurobiologia da retina, como a localização precisa das proteínas nas sinapses dentro do circuito. A principal vantagem da técnica é que ela pode estimar o número, a densidade e a rapidez de várias proteínas nas sinapses da fita retiniana.

Demonstrando o procedimento de substituição por congelamento e o corte ultrafino, temos os médicos Ron Petralia e Ya-Xian Wang do NIDCD Advanced Imaging Core. Para iniciar este procedimento, disseque um globo ocular ao microscópio. Para fazer isso, primeiro remova a córnea.

Em seguida, remova o cristalino e o vítreo da superfície inter-retiniana com uma pinça. Depois, descasque a esclera até que a retina seja isolada da ocular. Corte a retina imediatamente em tiras de 100 200 micrômetros de espessura com uma navalha.

Em seguida, misture as tiras de retina em 4% de paraformaldeído em 0,1 molar PB. Em seguida, em 4% de paraformaldeído mais 0,01% de glutaraldeído à temperatura ambiente. Após várias lavagens em PB, com cloreto de cálcio 0,15 milimolar, crioproteger as tiras retinianas com glicerol em PB 0,1 molar, antes da substituição por congelamento. Antes de colocar o tecido congelado nos suportes de incorporação planos, corte um círculo fino de uma folha de plástico transparente e coloque-o na parte inferior de cada suporte para permitir a remoção mais fácil da caixa de amostra polimerizada quando terminar.

Agora, defina a sequência automática no AFS. Encha o AFS com nitrogênio líquido e coloque os suportes de incorporação planos no AFS. Encha-os com acetato de uranilo a 1,5% em metanol e pré-resfrie-os.

Para congelar as tiras de retina em propano líquido a 184 graus Celsius, use um pincel fino para colocar as amostras em pequenos pedaços de fita adesiva dupla presos aos tocos de metal na extremidade das hastes de mergulho. Depois disso, retire o buffer extra usando o pincel. Mergulhe as hastes no propano líquido por cerca de cinco segundos.

Em seguida, transfira-os para o AFS usando uma pequena câmara de transporte cheia de nitrogênio líquido. Depois de colocar a amostra congelada e os instrumentos, fórceps e bisturi no AFS, resfrie os instrumentos na câmara por vários minutos antes de tocar no tecido. Ou resfrie-os colocando as pontas dos instrumentos por alguns segundos na pequena câmara de transporte cheia de nitrogênio líquido.

Depois disso, remova a amostra e a fita do toco usando um bisturi fino. Em seguida, coloque dois pedaços de seções congeladas em cada um dos sete poços no suporte de alumínio embutido plano com acetato de uranila a 1,5% em metanol. Mantenha-os a 90 graus Celsius por pelo menos 32 horas no AFS.

Em seguida, aumente a temperatura gradualmente para 45 graus Celsius na sequência automática. Depois disso, lave as amostras três vezes em metanol pré-resfriado. Em seguida, infiltre as amostras progressivamente com resinas de incorporação de baixa temperatura como meio de incorporação.

No dia seguinte, troque a resina novamente e ajuste o nível de resina para atingir a borda superior dos poços. Configure a luz UV no AFS e polimerize as amostras com luz UV no AFS até o final da sequência automática. Em seguida, remova as amostras do AFS.

Normalmente, os blocos de amostra ainda mostram algum rosa e cor. Coloque as amostras perto da luz fluorescente na capela de exaustão química à temperatura ambiente durante a noite ou até que pareçam completamente claras. Nesta etapa, corte seções ultrafinas de 70 nonômetros de espessura com um ultramicrótomo e colete-as nas grades de níquel revestidas de carbono formvar.

Lave as grades em água destilada uma vez, seguida de três lavagens de TBS. Em seguida, incube as grades em 20 microlitros de 5% BSA em TBS por 30 minutos e, em seguida, em 20 microlitros de uma mistura contendo anti-CTB de cabra e um anticorpo para uma subunidade NMDAR durante a noite em temperatura ambiente. Depois disso, lave as grades três vezes com 20 microlitros de TBS de cada vez em ph 7,6.

Em seguida, lave as grades uma vez com TBS em ph 8,2 por cinco minutos. Incube as grades por duas horas com 20 microlitros de uma mistura contendo IGG anti-coelho de burro acoplado a partículas de ouro de 10 nanômetros e IGG anti-cabra de burro acoplado a partículas de ouro de 18 nanômetros. Após duas horas, lave as grades em 20 microlitros de TBS, a ph 7,6 três vezes, seguida de uma lavagem em água ultrapura e depois seque as grades ao ar.

Em seguida, contra-corar as grades com acetato de uranila a 5% em água destilada por oito minutos, seguido de citrato de chumbo a 0,3% em água destilada por cinco minutos no escuro. Para experimentos de rotulagem tripla, incube as grades durante a noite em temperatura ambiente com 20 microlitros de uma mistura de CTB anti-cabra, PSD-95 anti-camundongo e UN2A anti-coelho. Em seguida, incube as grades por duas horas com 20 microlitros de uma mistura de IGGs acoplados a partículas de ouro de 18, 10 e cinco nanômetros.

Nesta seção, primeiro defina a barra de escala. Em seguida, meça o comprimento do PSD de dendritos RGC individuais com o software ImageJ. Em seguida, conte as partículas de ouro dentro de 10 nanômetros da membrana com base em uma espessura média de sete a nove nanômetros para a membrana plasmática.

Calcule a densidade da partícula como o número de partículas de ouro por micrômetro linear. Em seguida, meça a distância entre o centro de cada partícula de ouro e o meio do PSD para localização sináptica, ou a borda do PSD, para localização extra-sináptica. Esta imagem mostra a marcação dupla de imunoouro de GluA2 / 3 e CTB.

Esta é a fita pré-sináptica e as pequenas partículas de ouro estão agrupadas no PSD dos processos RGC. Esta imagem mostra a marcação dupla de imunoouro de GluN2B e CTB. As pequenas partículas de ouro estão na membrana plasmática extra-sináptica.

E esta imagem mostra a dupla marcação imunogold de GluN2A e CTB. Semelhante ao GluA2 / 3, pequenas partículas são agrupadas dentro do PSD. A marcação tripla de imunoouro de GluN2A, PSD-95 e CTB é mostrada aqui.

As partículas de ouro GluN2A e as partículas de ouro PSD-95 são co-localizadas dentro do PSD em dendritos RGC CTB-positivos individuais. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de fixar o tecido com muita delicadeza, pois alguma antigenicidade proteica, como a dos receptores NMDA, diminui acentuadamente com forte fixação prolongada. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como detectar e analisar proteínas de membrana com grande precisão nas sinapses da fita retiniana.