Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain

这种大规模电子显微镜或纳米切片实验的总体目标是定义从大分子水平到组织水平的变化，在今天的情况下，在退化的斑马鱼大脑中。纳米切片技术可以帮助回答生命科学中的关键问题。例如，在神经退行性疾病和 1 型糖尿病研究中。

纳米切片的主要优点是可以获取无偏差的信息，从大分子、细胞器、细胞到组织。这允许通过 nanotomy.org 进行定量和开放获取数据共享。尽管纳米切片技术提供了对斑马鱼神经退行性大脑中免疫维持和小胶质细胞的见解，但它也适用于其他疾病模型，包括细胞培养、小鼠，甚至人体组织。

一般来说，刚接触这项技术的科学家会很挣扎，因为数据量太大。这可能是传统 EM 获得的一千倍。根据文本协议固定斑马鱼幼虫后，将幼虫头从头部切到后脑，以促进锇的穿透。将幼虫置于 1% 四氧化锇、1.5% 亚铁氰化钾和 0.1 摩尔二甲胂酸钠中，并在冰上孵育 2 小时。

然后用双蒸水冲洗胚胎 3 次，每次 5 分钟。在包埋之前，样品需要在一系列乙醇中脱水。要包埋胚胎，请按照文本方案在稀释的环氧树脂中孵育过夜后，去除稀释的树脂并用纯树脂替换它。

孵育 30 分钟，然后再次更换树脂，再孵育 30 分钟。第三次刷新填料后，在室温下孵育 3 小时。然后，在 58 摄氏度下孵育 15 分钟。

最后，在室温下低压孵育 1 小时。接下来，在解剖显微镜下，使用针或牙签在市售的硅平面包埋模具中定位头部。然后将环氧树脂在 58 摄氏度下聚合过夜。

当试样完全硬化后，使用剃须刀片修剪掉短管上多余的树脂。为了检测正确的位置，在超薄切片机上使用玻璃刀或金刚石组织刀切割半薄的幼虫切片，以获得甲苯胺蓝/碱性品红。用玻璃巴斯德移液管将其转移到显微载玻片上，其尖端已在火焰中熔化而关闭。

在热板上晾干，直到没有水。接下来，将样品放入 1% 甲苯胺蓝的水中，并在热板上孵育切片 10 秒钟以使其染色。然后，用水冲洗切片后，使用 05% 碱性品红和 1% 四硼酸钠对样品再染色 10 秒。

使用 10 倍至 40 倍的普通光学显微镜检查样品。当到达正确的部位或方向时，使用易于识别的解剖结构，包括嗅坑、眼睛或灰白质边界，以在超薄切片过程中识别感兴趣的大脑区域，并在样品倾斜时调整切片角度。继续用金刚石刀对环氧树脂块进行切片，以切割 70 纳米的超薄切片。

将每个部分安装在单个插槽 L2 x 1 上，形成带条形码的铜栅，以允许不受栅条干扰的采集。一平方毫米可能看起来很小。它刚好适合开口。

通过这种方式，我们可以防止网格条挡住我们的样品。意识到与传统 EM 相比，我们样本中引入的每一个伪影都将被记录下来。根据文本协议将样品与重金属进行对比，并储存在网格框中。要将样品安装在扫描电子显微镜或 SEM 中，请将传输箱中的网格与多网格样品架中的截面放在一起，然后将其转移到 SEM 的腔室中。

根据文本协议对齐检测器后，通过缩小对样品进行预照射，以便要扫描的整个区域适合图像窗口。将孔径更改为 120 微米并且图像散焦后，使用缩小区域扫描选项使扫描区域尽可能紧密。接下来，设置帧速率以在大约 1 到 2 秒内扫描帧。

然后放大至少 100 倍并扫描一小块区域 10 秒钟。如果该区域的亮度仍然发生变化，请继续预照射。当该区域的亮度与周围环境相比没有变化时，预照射就足够了。

在对焦时，选择最亮的区域或特征并设置扫描速度，以便看到细节。在显微镜软件中，通过仔细观察直方图来调整亮度和对比度，以将所有像素保持在动态范围内。对最暗的区域和特征执行相同的作。

返回明亮区域并再次检查，以便直方图的两侧都有一些空间。对于步骤 4 6 到 4 8，必须非常小心地调整亮度和对比度，以便整个区域都在动态范围内。缩小，使要扫描的整个区域适合想象窗口，然后启动大面积采集程序。

然后使用向导选项通过从屏幕中选择一个区域来设置马赛克。使用 2 到 5 纳米的像素大小，具体取决于所需的细节，并为扫描透射电子显微镜 （STEM） 设置三微秒的停留时间。按 optimize 检查显微镜设置，并显示所需的时间。

然后再次打开外部扫描生成器并按继续。要分析 STEM 数据，请打开一个大型 EM 文件查看器程序，然后打开名为 mosaic info 的文件，这将打开平铺的 tif 文件。选择"自动拼接整个马赛克"选项，然后选择以下参数：重叠模式等于一半，拼接阈值等于 0.90，杂色减少等于自动。

如果无法满足拼合条件，请放大并手动将拼贴放置在适当的位置，然后单击"按原样继续"。将数据导出为 HTML 文件或单个 tif。包括最终像素大小和文件名，以便稍后进行测量，然后根据文本协议分析数据。如图所示，对照脑切片的纳米切开揭示了喙前脑神经组织的典型超微结构特征，包括嗅纤维束、神经元核和神经元子区室，包括突触。

在这里，亚细胞结构包括不同细胞类型和细胞器中的不同核形态和病灶，包括高尔基体、内质网、线粒体、突触囊泡和突触后密度。出乎意料的是，与大脑中更横向分散的其他细胞相比，脑室内壁的细胞核电子密度非常高。在小胶质细胞中，细胞核还显示深色病灶，可能是异染色质，这在大脑的其他细胞中是不存在的。

这张来自接受神经元消融的斑马鱼幼虫冠状切片的大尺度 EM 图像揭示了吞噬细胞小胶质细胞。在这些细胞中也发现了哺乳动物细胞中小胶质细胞的特征，包括突出的高尔基体和许多内含物，如溶酶体。一旦掌握，就可以在一天内完成获取，而传统的 EM 至少需要花费您一周的时间。

在尝试此过程时，显微镜作员在获得高质量图像方面起着至关重要的作用非常重要。这不仅仅是一种按下按钮的技术。我们现在不仅将纳米切片应用于神经退化的斑马鱼模型，还将其用于细胞的免疫标记以及研究果蝇的组织、人体组织等。

这项技术为任何领域的研究人员铺平了道路。他们可以在 nanotomy.org 上在线重新访问数据集。然后，他们可以探索推定的变化，范围从纳米到毫米尺度以及研究的所有模型。

观看此视频后，您应该对如何将纳米切片技术应用于您的研究问题以及您正在研究的细胞或组织系统有一个很好的了解。不要忘记，由于有毒试剂和道德考虑，只有专业人员才能进行样品制备，但每个人都可以尝试网站纳米切开术。组织在家里。