Name: 使用彩虹和延时共聚焦成像可视化活斑马鱼中发育中的脑 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: 了解延时共聚焦成像技术用于斑马鱼脑发育研究的方法。该技术通过Brainbow多色标记实现神经祖细胞及其后代动态的可视化，为脊椎动物神经系统发育研究提供重要工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢 Y. A. Pan、J. Livet 和 Z. Tobias 在技术与学术思想方面做出的贡献。本工作由美国国家科学基金会（资助号 1553764）和 M.J. Murdock 慈善信托基金资助。

涉及动物受试者的实验程序已获得刘易斯机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准 &amp;#38; 克拉克学院
1. 斑马鱼胚胎的显微注射
<ol>
	<li>在进行显微注射前一个下午，将野生型成年斑马鱼按性别分开放置在交配用的鱼缸中39,40。</li>
	<li>在显微注射当天早晨配制DNA溶液。将hsp:Zebrabow11质粒DNA用0.1 mM KCl稀释至浓度约为10 ng/μL，并加入2.5%酚红和3.75 U Cre重组酶。</li>
	<li>在受精后45分钟内对单细胞期斑马鱼胚胎进行DNA溶液的显微注射39,41。每个胚胎注射约4.2 nL溶液，相当于约42 pg质粒DNA。 
	注意：如果使用已建立的表达Brainbow的转基因斑马鱼品系进行交配（例如Tg(ubi:Zebrabow)15和Tg(neurod:Zebrabow)18），则可省略显微注射步骤。进行显微注射的优势在于研究人员可调控插入拷贝数和标记密度。此外，如需同时标记或操控特定基因产物，还可共注射第二个DNA构建体（例如一种可与Brainbow互补的远红光荧光蛋白18）。</li>
	<li>将注射后的胚胎置于含有E3培养基39的培养皿中，在28 °C培养箱中培养24小时。</li>
</ol>
2. 热激诱导 Brainbow 表达
注意：如果注射的质粒DNA或表达的转基因未使用hsp70启动子驱动表达，则可省略热激步骤，并在受精后24小时（hpf）立即将健康胚胎转移至苯硫脲（PTU）中。
<ol>
	<li>在24 hpf时，从注射后的胚胎群体中剔除死亡和畸形的胚胎。然后将健康的胚胎转移至50 mL离心管中，每管不超过20个胚胎。</li>
	<li>向离心管中加入10 mL E3培养基。在每根管子上方盖上管盖，但不要拧紧。</li>
	<li>将装有50 mL离心管的管架垂直放入37 °C水浴中。确保水浴中的液面高于管内E3培养基的液面，并静置80至90分钟。</li>
	<li>从水浴中取出装有胚胎的管架，垂直放回28 °C培养箱中。让E3培养基冷却，胚胎逐渐重新适应温度，此过程最多需要1小时。随后将胚胎转移至含有0.2 mM PTU的E3培养基的培养皿中，该培养基需预先在培养箱中预热，以防止胚胎色素沉积。 
	注意：PTU是一种有毒化学品，应小心操作并妥善处理。建议佩戴手套。</li>
</ol>
3. 筛选表达 Brainbow 的胚胎
<ol>
	<li>在热激后 2 至 4 小时，使用标准荧光体视显微镜观察胚胎中 CFP 或 YFP 的表达情况，该表达表明 Brainbow 重组成功（由 dTomato 的默认表达转变而来）。 
	注意： 若具备多种荧光滤光片选项，筛选 CFP 是鉴定重组良好鱼体的最有效方法。若无 CFP 和 YFP 滤光片，也可在绿色荧光蛋白（GFP）滤光片下微弱观察到 YFP，因其光谱特性与 GFP 有部分重叠。</li>
	<li>挑选在整体范围内具有强荧光蛋白（FP）表达的胚胎，转移至含 PTU 的独立培养皿中。在受精后 1 天（dpf；28 hpf 或更晚）对胚胎进行成像，或继续在 PTU 中培养胚胎，并在 2 或 3 dpf 时进行成像。</li>
</ol>
4. 活体成像用胚胎的制备
<ol>
	<li>实验前一天，准备好成像室和胚胎操作工具。
	<ol>
		<li>通过小心地将塑料环用超级胶水粘在60 mm培养皿的中心来制备成像室。</li>
		<li>可选步骤：制备一个自制的胚胎操作器，用于在培养皿内移动胚胎并在固定时调整胚胎方向。将一段短的尼龙钓鱼线（约1/2英寸，约6磅拉力）用超级胶水粘在已剪至约4英寸长的木制棉签棒末端，即可制成该操作器。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>如必要（例如在2 dpf或更早阶段进行成像），在固定胚胎前，在解剖显微镜下使用注射器去除胚胎的绒毛膜。</li>
	<li>对斑马鱼胚胎进行麻醉。
	<ol>
		<li>将60 mm培养皿装至一半体积的E3培养液，并加入5–6滴4 mg/mL的MS-222 Tricaine-S，使终浓度约为0.2 mM。轻轻旋转混合。 
		注意：Tricaine应小心操作，并按规定妥善处理。</li>
		<li>将胚胎从PTU溶液转移至Tricaine溶液中，尽量减少PTU的带入。尽管鱼类的反射通常在1–2分钟内停止，但仍应将胚胎在Tricaine中放置长达10分钟，以确保在延时成像实验中达到充分麻醉。</li>
		<li>确认胚胎已充分麻醉。使用胚胎操作器轻轻触碰胚胎尾部，检测惊吓反射。若观察到反射性运动，则在远离胚胎的位置额外加入一滴Tricaine，并轻轻旋转混合。在解剖镜下观察胚胎心率。若心率异常缓慢，应向培养皿中加入额外几滴E3以降低Tricaine浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将麻醉后的胚胎固定在琼脂糖中。
	<ol>
		<li>将胚胎转移至成像室塑料环的中心位置，并使用细尖移液器尽可能去除多余的E3溶液。</li>
		<li>使用洁净的移液器，将储存在42 °C的含E3的1.0%低熔点琼脂糖（LMA）覆盖胚胎，并在整个塑料环内形成一层薄薄的琼脂糖。用移液器轻轻将胚胎吸入移液头再推出，以确保胚胎完全浸入琼脂糖中，同时避免引入气泡。</li>
		<li>在琼脂糖凝固前，迅速使用胚胎操作器将胚胎调整至合适的方向。若使用直立显微镜成像，应将胚胎尽可能靠近琼脂糖上表面放置。使胚胎与成像室底部平行，尾部保持伸直。 
		注意：对于后脑成像，可将胚胎置于背侧或矢状位观察。需注意在琼脂糖仍为液态时防止胚胎头部下沉。其他方向可根据成像目标组织的发育需求进行调整。对于倒置显微镜，固定方式会有所不同，通常需将胚胎靠近玻璃底培养皿的底部放置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>等待琼脂糖完全凝固后，向成像室中加入E3培养液。尽可能多加入E3，以补偿成像过程中可能发生的蒸发损失。</li>
</ol>
5. 斑马鱼后脑发育过程的延时共聚焦成像
<ol>
	<li>将成像腔室放置于共聚焦显微镜上，准备进行成像。
	<ol>
		<li>将含有斑马鱼和E3培养液的成像腔室置于共聚焦显微镜上。</li>
		<li>选择一个具有高数值孔径和长工作距离的物镜，例如20倍水浸物镜（1.0 NA）。</li>
		<li>寻找细胞类型标记密度适中且荧光信号明亮的区域。 
		注意：显微镜可配备温控载物台或装置，用于在长时间成像过程中调节温度和湿度，从而减少液体蒸发。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置Brainbow成像的采集参数。
	<ol>
		<li>依次对每个荧光蛋白通道进行成像。若使用商业软件（例如Zen软件），需设置三个“轨道”。使用氩离子激光器在458 nm激发CFP，在514 nm激发YFP；使用DPSS 561 nm激光器激发dTomato。收集CFP的发射光波长范围为463–509 nm，YFP为519–555 nm，dTomato为566–691 nm。</li>
		<li>在屏幕上显示时，将CFP设为蓝色，YFP设为黄色，dTomato设为红色。 
		注意：具体设置将根据共聚焦显微镜所配备的激光线及其他功能而有所不同。为提高成像速度，CFP和dTomato通道可同时成像，且串扰可忽略不计。若还需成像其他荧光蛋白（如远红荧光蛋白），可与YFP通道依次或同时成像。</li>
		<li>设置通用成像参数，采集16位图像，分辨率至少为1024 × 1024，并进行两次平均扫描。根据目标区域和细胞类型调整放大倍数（例如，使用20倍物镜对后脑成像时，放大倍数范围为1.0–2.5）。尽量扩大视野范围，以容纳斑马鱼在成像过程中的生长。</li>
		<li>每次仅查看一个轨道（并关闭其他激光以防止光漂白），分别优化每种荧光蛋白的采集参数（如激光功率、针孔大小、光电倍增管增益等）。</li>
		<li>选择Z轴堆栈的成像范围。 
		注意：对于长时间成像（>2 h），需考虑斑马鱼在整个成像过程中会持续生长，因此XY平面视野和Z轴堆栈范围均应预留额外空间。若对后脑进行成像，应在视野中为组织在成像期间向头端移动预留空间。同时需为Z轴方向的生长预留空间。无论斑马鱼处于矢状位还是背侧位，图像中应包含兴趣区域上方约10–20 μm的空间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置延时成像参数。
	<ol>
		<li>选择时间间隔。为追踪发育后脑中的有丝分裂和凋亡事件，时间间隔通常为10–30分钟。具体间隔长度取决于目标事件的发生速度以及单次Z轴堆栈成像所需的时间。</li>
		<li>选择成像时长。延时成像通常在夜间进行，可持续至少16小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>运行实验。 
	注意：成像结束后可立即处死斑马鱼，或使用注射器小心将其从琼脂糖中取出并放回E3培养液中恢复。恢复后的斑马鱼可在后续时间点再次成像，但由于整体生长，细胞位置和深度在此期间会发生变化。</li>
</ol>
6. 时间序列文件管理
<ol>
	<li>将图像文件导入分析软件。
	<ol>
		<li>如果使用 Zen 软件，在完成图像采集后，将文件保存为 .czi 格式。确保以与 Fiji42 和/或其它软件兼容的格式保存原始数据。</li>
		<li>使用 BioFormats 导入器将图像导入 Fiji 软件。 
		注意：延时成像文件通常较大，打开进行分析时可能需要较长时间和大量内存。因此，在保存和打开文件时采取策略性方法会很有帮助。例如，可保存一个质量较低的版本，以便更快速地打开，并通过肉眼观察查找感兴趣的事件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>如果使用 Fiji，可创建更小、更易处理的时间序列文件子集。通过点击 图像|堆栈|工具|创建子堆栈，按时间（例如，仅查看第一个时间点的完整 Z 堆栈）或按深度（例如，每个时间点仅查看前 50 个 Z 层切片）生成子集。</li>
</ol>
7. Brainbow 图像的定量克隆颜色分析
<ol>
	<li>在 Fiji 中测量目标细胞的平均红、绿、蓝（RGB）强度值。 
	注意： 这些说明专门针对 Fiji 中的图像分析。然而，研究人员可能更倾向于在其他软件程序中获取平均 RGB 强度值。
	<ol>
		<li>确保文件被正确裁剪，使图像边缘没有黑色区域。黑色区域会人为降低分析所需的最小强度测量值。如果文件需要裁剪，请选择 矩形选择按钮 并围绕视野绘制一个感兴趣区域（ROI），排除所有黑色区域。单击 图像|作物.</li>
		<li>将测量工具设置为测量平均值、最小值和最大灰度值。单击 分析|设定测量参数。 确保复选框已勾选 分钟 &amp;#38; 最大灰度值 和 平均灰度值 均已选中。</li>
		<li>在 Fiji 中查看原始数据文件或子集化的 Z-stacks，寻找适合进行克隆颜色分析的目标细胞。在后脑中，可通过细胞共同的色调及其径向排列方向，在视觉上识别潜在的克隆。避免选择与另一种颜色的邻近细胞紧密接触、因而难以分辨的细胞，因其色调可能难以准确量化。</li>
		<li>使用显微镜找到目标细胞的中心Z平面 Z轴滚动条. 右键单击 椭圆选择按钮 并选择 椭圆选择按钮其他选择工具适用于不同类型的细胞。在细胞体中央约三分之二区域周围绘制一个椭圆形感兴趣区域（ROI）。</li>
		<li>使用 C滚动条，选择红色（dTomato）通道。通过选择该通道获取其平均荧光强度测量值 分析|测量. 在相同的 ROI 和焦平面下，对绿色（YFP）和蓝色（CFP）通道重复上述操作，并保存所有平均荧光强度值。</li>
		<li>单击图像任意位置，即可移除目标细胞中的椭圆形感兴趣区域（ROI）。</li>
		<li>为了测量用于归一化的背景水平，请使用 C型滚动条 并选择红色（dTomato）通道。通过选择该通道中整个视野的最小强度值进行测量 分析|测量. 对绿色（YFP）和蓝色（CFP）通道使用相同的焦平面重复上述操作，并保存所有最小强度值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算目标细胞的相对RGB通道权重。 
	注意： 根据这些强度值计算相对RGB通道权重，可在多种软件程序中进行，例如 Microsoft Excel 或 R43.
	<ol>
		<li>将每个通道中细胞ROI的平均荧光强度测量值进行归一化处理，方法是减去该通道及焦平面整个视野中的最小强度值。</li>
		<li>将各通道的归一化平均RGB强度值相加，得到细胞的总归一化RGB强度。</li>
		<li>通过将每个通道的归一化平均强度值除以总的归一化RGB强度，计算各通道的相对通道权重。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 R 的 Ternary 软件包将相对 RGB 通道权重以三元图形式展示43,44三元图可用于可视化相似颜色在三维RGB空间中的聚类情况。</li>
	<li>计算颜色扩散系数以量化细胞颜色之间的差异。
	<ol>
		<li>使用以下公式计算两种颜色在三维RGB空间中的欧几里得距离： 
		<img alt="公式 1" src="/files/ftp_upload/60593/60593equ01.jpg" /> 
		其中 R、G 和 B 为在 7.2 节中计算得到的相对 RGB 通道权重。</li>
		<li>为便于理解，将颜色距离除以进行归一化处理 &#8730;2，以获得0到1之间的颜色差异系数，其中0表示颜色完全相同，1表示颜色完全不同（例如纯红色与纯蓝色）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了一种在斑马鱼后脑发育过程中可视化祖细胞和神经元克隆，并利用Brainbow技术结合延时共聚焦显微镜进行活体追踪的方法11。与体外或离体研究相比，该方案的主要优势在于能够随时间推移在天然环境中直接观察脊椎动物大脑的增殖区域。该技术建立在先前使用逆转录病毒载体标记单个克隆的研究基础之上&#160;。相比之下，hsp:Zebrabow 构建体可同时为多个克隆赋予不同颜色编码，从而实现多重谱系示踪，并聚焦于克隆间的动态关系11。本方案可进行调整，以适用于其他系统或细胞类型的发育研究。例如，可在斑马鱼胚胎中表达不同的Brainbow构建体。在hsp:Zebrabow中使用斑马鱼hsp70启动子可在热激后实现多种细胞类型的嵌合标记，包括神经祖细胞和神经元11，并使研究人员能够对基因表达进行时间控制29。需要注意的是，热激启动子的使用通常能清晰地标记出颜色编码的克隆，而其他启动子可能无法以同样方式明确界定细胞谱系。...

在发育的早期阶段，特化的前体细胞池在增殖区域反复分裂，产生多种多样的子代细胞。在这一发育时期产生的细胞随后会分化并迁移，形成新生的器官。在神经系统中，放射状胶质细胞等前体细胞在脑室区产生未成熟的神经元。随着神经元从脑室迁移并逐渐成熟，不断扩展的组织最终形成大脑高度复杂的结构1,2,3,4,5,6。前体细胞的分裂与神经元的分化及迁移之间的协调，将决定大脑最终的大小、形状及其功能，从而直接影响行为7,8,9,10。尽管对这些过程进行严密调控显然对正常大脑发育至关重要，但调控这些动态过程的全局机制目前尚不明确。本文介绍一种可在细胞分辨率下研究神经系统发育的工具，使研究人员能够利用Brainbow技术在活体中观察斑马鱼发育中大脑的前体细胞和神经元，并通过延时共聚焦显微镜追踪其随时间变化的行为11。该方法也可经调整后用于观察发育中胚胎的其他部分。
为了观察并区分发育中斑马鱼大脑中的细胞，我们改进了Brainbow细胞标记技术11。Brainbow利用三种不同荧光蛋白（FPs）的随机组合表达来标记一群细胞。在默认状态下，Brainbow表达红色荧光蛋白dTomato，而在Cre重组酶的作用下发生重组后，则表达mCerulean（青色荧光蛋白，CFP）或黄色荧光蛋白（YFP）12,13。每种荧光蛋白在细胞中的表达量组合赋予细胞独特的颜色，从而能够与邻近细胞清晰地区分开来。此外，当一个前体细胞分裂时，其两个子代细胞会继承母细胞的颜色，形成颜色编码的克隆群体，使研究人员能够追踪细胞谱系11,14。尽管该技术最初用于分析小鼠的神经环路12，但目前已在包括斑马鱼在内的多种模式生物中成功实现表达15。
我们的技术基于先前的多色标记和成像方法，能够在活体斑马鱼中随时间直接成像多种颜色编码的克隆。由于斑马鱼胚胎具有光学透明性，非常适合进行成像实验16，此前已有研究在斑马鱼中利用Brainbow技术研究了多种组织，包括神经系统11,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27。能够直接对活体生物进行成像，加之其快速的体外发育过程，使斑马鱼成为研究脊椎动物发育的宝贵模型。与哺乳动物大脑不同，斑马鱼后脑的整个增殖区均可在不破坏其内源性环境的情况下被轻松成像6。这使得实验可在活体生物中进行，而无需依赖体外或固定组织样本。与固定样本的成像实验相比，活体研究可采用纵向设计，产生数小时的连续数据用于分析模式，从而提高观察到相对罕见事件的可能性。根据所关注事件的速度和持续时间，研究人员可选择进行短时（1–2 h）或长时（长达约16 h）的时间序列成像实验。通过使用斑马鱼热休克启动子70（hsp70, hsp），可实现对Brainbow表达的时间控制28,29。此外，该启动子诱导的嵌合表达非常适合对大量克隆进行标记和追踪11。
能够在活体大脑中通过视觉识别多个克隆是本方法的优势。以往许多重要研究在探究克隆在神经系统发育中的作用时，利用逆转录病毒载体标记单个前体细胞及其子代，所用标记物为单一的荧光蛋白（FP）或其他易于观察的蛋白质。此类标记方法使研究人员能够在体外或体内长期观察单个克隆2,30,31,32,33,34,35,36,37,38。与仅追踪单个克隆内细胞行为的方法不同，Brainbow 技术通过不同的颜色使研究人员能够观察克隆之间的动态关系。此外，通过 Brainbow 在大脑中同时标记多个克隆，相较于仅标记单个克隆的技术，可以获得更丰富的克隆行为数据11。尤为重要的是，本文所述方法可进一步拓展，用于比较经过不同遗传或药理学干预的鱼类之间的发育差异18。总体而言，这些优势使得对表达 Brainbow 的斑马鱼进行活体延时共聚焦成像，成为研究脊椎动物神经系统发育（特别是关注克隆作用的研究者）的理想选择。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 移液管（细尖）</td><td>Globe Scientific, Inc.</td><td>134020</td><td></td></tr><tr><td>1-苯基-2-硫脲（PTU）</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06690</td><td>用 E3 稀释至 0.2 mM，以防止胚胎色素沉积</td></tr><tr><td>50 mL 锥形离心管</td><td>Corning</td><td>352070</td><td>用于胚胎热激处理</td></tr><tr><td>6 磅尼龙钓鱼线</td><td>SecureLine</td><td>NMT250</td><td>用于制作胚胎操作装置</td></tr><tr><td>7.5 mL 移液管</td><td>Globe Scientific, Inc.</td><td>135010</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C3881</td><td>用于配制 E3 溶液</td></tr><tr><td>棉签</td><td>Puritan</td><td>867-WC NO GLUE</td><td>用于制作胚胎操作装置</td></tr><tr><td>Cre 重组酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0298M</td><td></td></tr><tr><td>数字干式恒温仪</td><td>Genemate</td><td>490016-616</td><td>用于在 42 &amp;deg;C 下保存低熔点琼脂糖（LMA）</td></tr><tr><td>落射荧光解剖显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Forma Scientific</td><td>3158</td><td>用于将胚胎维持在 28 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>注射用培养皿模具</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU-1</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 水浴锅</td><td>Fisher Scientific</td><td>2320</td><td>用于胚胎热激处理</td></tr><tr><td>KCl</td><td>AMRESCO</td><td>0395</td><td>用于 E3 溶液及注射用 DNA 溶液</td></tr><tr><td>激光扫描共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td>LSM710</td><td></td></tr><tr><td>LE 琼脂糖</td><td>Genemate</td><td>E3120</td><td>用于制作琼脂糖注射板</td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖（LMA）</td><td>AMRESCO</td><td>J234</td><td></td></tr><tr><td>交配用鱼缸</td><td>Aquaneering, Inc.</td><td>ZHCT100</td><td></td></tr><tr><td>亚甲蓝</td><td>Sigma</td><td>M9140</td><td>用于 E3 溶液</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>9397</td><td>用于 E3 溶液</td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>World Precision Instruments</td><td>M3301</td><td></td></tr><tr><td>微量移液管拉制仪</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>MS-222 三卡因-S</td><td>Western Chemical, Inc.</td><td></td><td>用反渗透（RO）水配制成 4 mg/mL 储存液，然后逐滴加入 E3 溶液中，终浓度为 0.2 mM，用于麻醉胚胎</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>4058-01</td><td>用于 E3 溶液</td></tr><tr><td>培养皿（90 mm，60 mm）</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-107G</td><td>用于饲养胚胎及构建成像腔室（60 mm）</td></tr><tr><td>酚红</td><td>Sigma</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>软质缝合环标记</td><td>Clover Needlecraft, Inc.</td><td>354</td><td>用于与培养皿配合构建成像腔室</td></tr><tr><td>瞬间胶（超凝胶控制型）</td><td>Loctite</td><td>1363589</td><td>用于制作胚胎操作装置</td></tr><tr><td>注射器针头</td><td>Beckton Dickinson</td><td>BD329412</td><td>用于去除胚胎的绒毛膜</td></tr></tbody></table>

利用brainbow技术和活体斑马鱼延时共聚焦成像可视化大脑发育过程

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

脊椎动物神经系统的发育需要复杂细胞行为与相互作用的精确协调。高分辨率的活体成像技术可为在活体生物中观察这些过程提供清晰的窗口。例如，可以在神经系统形成过程中实时追踪分裂细胞及其子代细胞。近年来，多色标记技术的进步拓展了可研究的科学问题类型。多色 Brainbow 技术不仅可用于区分形态相似的细胞，还可对源自同一前体细胞的多个不同细胞克隆进行颜色编码。这使得在发育过程中能够同时对多种不同克隆及其行为进行多重谱系分析。本文描述了一种利用延时共聚焦显微镜，在斑马鱼神经系统发育过程中实时可视化大量多色 Brainbow 标记细胞的技术。该方法特别适用于追踪形态相似细胞之间的细胞相互作用，而这类相互作用使用传统的启动子驱动颜色标记难以实现差异化标记。我们的方法可用于同时追踪多个不同克隆之间的谱系关系。利用该技术生成的大量数据提供了丰富的信息，可在遗传或药理学干预之间进行定量比较。最终，这些研究结果有助于系统性地回答神经系统如何发育的相关问题。

本部分展示了使用此处描述的活体多色延时成像方法可获得的结果示例。我们展示了发育中斑马鱼后脑增殖性室区细胞的Brainbow彩色编码克隆14（图1）。
通常，当 Brainbow 标记的细胞沿着特定的放射状纤维排列时，它们会呈现相同的颜色（图 1D），该颜色可通过相对的 RGB 通道权重进行量化（图 1E）。这表明这些放射状排列的细胞群为分裂细胞的克隆群体，其相似的颜色可用于识别其克隆来源关系，这与此前在斑马鱼、小鼠和鸡中研究所观察到的结果一致14,15。当 Brainbow 标记密度相对稀疏时，这种颜色编码可用于在活体脊椎动物大脑的增殖区域中清晰地可视化并追踪多个不同的放射状克隆。
定量...

活体成像是一种强大的工具，可用于研究神经系统发育背后的细胞机制。本文介绍了一种利用延时共聚焦显微镜实时观察斑马鱼发育过程中大量多色Brainbow标记细胞的技术。

利用Brainbow技术和活体斑马鱼延时共聚焦成像可视化大脑发育过程

脊椎动物神经系统的发育需要复杂细胞行为与相互作用的精确协调。高分辨率成像技术的应用在……

该方法有助于解答关于神经前体细胞及其后代在脊椎动物大脑发育过程中动态行为的基本问题。该技术的主要优势在于能够直接观察活体大脑中多个克隆相关细胞群在数小时发育过程中的动态变化。该方案还可应用于研究斑马鱼胚胎其他发育系统中的克隆及前体细胞动态。使用该方法进行可视化对于直接观察神经发育过程中发生的基本过程特别有用。在进行显微注射的前一天下午，将野生型成年斑马鱼按性别分开放置在交配缸中。次日早晨，按照文稿说明配制DNA溶液，并在受精后45分钟内向单细胞期斑马鱼胚胎注射约4.2纳升该溶液。将注射后的胚胎置于 E3 培养基中，并在 28 摄氏度的培养箱中培养 24 小时，随后统计并剔除该组中的死亡和畸形胚胎。将最多 20 个健康胚胎转移至一个 50 毫升离心管中，加入 10 毫升 E3 培养基，并在每根试管上盖上盖子。将装有 50 毫升离心管的试管架垂直放入 37 摄氏度的水浴中，持续 80 至 90 分钟，确保水浴的液面高于管内 E3 培养基的液面。从水浴中取出试管架，放入28摄氏度的培养箱中。让E3溶液冷却至28摄氏度，并使胚胎适应此温度，过程可能需要长达一小时。随后，将胚胎转移至含有0.2毫摩尔PTU和预热至28摄氏度培养箱中保温的E3溶液的培养皿中。在热激后2至4小时，使用标准荧光体视显微镜观察胚胎中CFP或YFP的表达情况，以判断Brainbow重组是否成功。挑选在整个胚胎中荧光蛋白表达强烈的个体，转移至另一含有PTU的培养皿中。在受精后1天、2天或3天对其进行成像观察。在荧光显微镜下显得微弱的表达信号，在共聚焦延时成像中实际上可能清晰可见。在实验前一天，准备好成像培养皿和胚胎操作工具。准备成像培养皿时，将一个塑料环小心地用超级胶水粘附在直径60毫米的培养皿中央。通过将一小段尼龙钓鱼线用强力胶粘在一根四英寸长的木制棉签末端来组装操作器。如有必要，在固定胚胎前，先在解剖显微镜下对胚胎进行去膜处理。固定胚胎时，将鱼样转移至成像室塑料环的中心位置，并用细尖移液器尽可能去除多余的 E3 溶液。使用洁净的移液管将1%低熔点琼脂糖和E3培养基覆盖在斑马鱼上，用琼脂糖完全填充塑料环形成一层。然后轻轻将胚胎吸入移液管尖端，再缓慢放回琼脂糖中，注意避免引入任何气泡。在琼脂糖凝固前，使用胚胎操作仪迅速调整斑马鱼和琼脂糖的方向。若使用直立显微镜成像，应将胚胎尽可能靠近琼脂糖的上表面放置，确保胚胎与成像室底部平行且尾部伸直。等待琼脂糖凝固后，用E3培养基填充成像室，尽量多加液体以补偿成像过程中可能发生的蒸发。随后将含有斑马鱼和E3培养基的成像室置于共聚焦显微镜上。然后选择具有高数值孔径和长工作距离的物镜。找到细胞标记密度和亮度合适的区域，并设置采集参数。此例使用 Zen 软件，但具体设置将根据所用显微镜及可用的激光谱线而有所不同。准备三条轨道，以依次成像每个荧光蛋白通道。使用氩离子激光器在458纳米波长激发CFP，在514纳米波长激发YFP，并使用561纳米DPSS激光器激发dTomato。在相应的波长处采集三种荧光的发射信号。选择用于成像的Z轴扫描范围，以及10至30分钟之间的时间间隔，以追踪有丝分裂和凋亡事件。最后，设定成像会话的持续时间并运行实验。成像完成后，若使用Zen软件，请将原始数据保存为CZI格式，或保存为与Fiji兼容的其他格式，然后利用Fiji中的Bio-Formats导入器将图像导入。通过活体多色延时成像技术，展示了发育中斑马鱼后脑增殖性脑室区细胞的 Brainbow 彩色编码克隆。沿特定放射状纤维排列的 Brainbow 标记细胞具有相同的颜色，该特征可通过相对 RGB 通道权重进行量化。这表明这些放射状细胞群是分裂细胞的克隆，其相似的颜色可用于识别它们是否具有克隆关系。定量的颜色分析显示，子代细胞与其母细胞表达相同的颜色，但相邻的放射状细胞簇彼此之间可以区分开来。可在体内同时追踪数小时内的多个相关细胞克隆，从而实现多重谱系分析与比较。对受精后两天及三天时克隆中颜色表达的定量分析显示，Brainbow 的表达从两天到三天基本保持稳定。延时成像揭示了在受精后一天至两天期间，大量细胞发生细胞核的同步性迁移和细胞分裂，使得细胞周期的研究成为可能。计算得出平均细胞周期为8.4小时，与之前在斑马鱼中测得的结果相当。此外，该成像技术可用于观察单个细胞经历凋亡相关的典型形态学变化，例如细胞膜起泡和细胞碎裂。由于该方法在活体中进行，斑马鱼可在成像后从成像室中取出，并在后续时间点继续用于成像或其他实验。该技术的应用使我们能够探索关于克隆相关细胞在神经发育过程中作用的新问题。

visualizing-developing-brain-living-zebrafish-using-brainbow-time

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

使用"彩虹"和"延时共聚焦成像"可视化活斑马鱼中发育中的脑

本文介绍了一种用于斑马鱼胚胎的固定方法，适用于长期成像、双光子成像和组织损伤技术，以及延时共聚焦成像。...

双光子轴突切除与活体斑马鱼胚胎的延时共聚焦成像

在本视频中，我们演示了一种利用共聚焦显微镜在单细胞分辨率下对活体斑马鱼胚胎中发育中的脊椎动物大脑进行分析的方法。该方法包括对单细胞斑马鱼胚胎进行显微注射，随后对发育中的大脑进行固定和成像的技术流程。...

活体斑马鱼胚胎大脑的共聚焦显微镜成像

理解塑造早期胚胎的形态发生过程的关键在于能够以高分辨率对细胞进行成像。本文介绍一种在完整斑马鱼胚胎中利用膜定位的绿色荧光蛋白对单个细胞或少量细胞簇进行标记的技术。...

斑马鱼后脑中细胞的标记与成像

本视频展示了一种方法，该方法结合了电穿孔技术和共聚焦显微镜技术，用于对发育中的斑马鱼前脑中的单个神经前体细胞进行活体成像。体内水平上对前脑神经前体细胞在克隆水平的发育过程分析可通过此方法实现。...

延时活体成像观察发育中斑马鱼前脑内克隆相关神经前体细胞

介绍了对幼年斑马鱼脑血管发育进行成像的方法。同时提供了促进三维成像以及利用化学处理手段调控脑血管发育的技术。...

斑马鱼胚胎中脑血管结构的成像与三维重建

延时共聚焦成像是一种用于表征胚胎发育的有力技术。本文中，我们描述了该方法，并对野生型以及 pdgfra, smad5, 和 smo...

利用4D共聚焦显微镜分析斑马鱼颅面形态发生

本文介绍了一种通用的固定方法，可在不干扰斑马鱼胚胎正常发育的情况下，实现对活体斑马鱼胚胎后部体轴发育过程的长期延时成像。...

一种用于斑马鱼发育长期成像的通用固定方法

结合激光扫描显微镜的先进光学技术与长波长多光子荧光激发，对 Tg(sox10:EGFP) 和 Tg(foxd3:GFP)...

多光子延时成像实时可视化发育过程：斑马鱼胚胎中迁移性神经嵴细胞的可视化

本方案描述了一种对斑马鱼早期眼部发育进行整体标记和多维成像的方法。我们介绍了利用激光扫描共聚焦显微镜进行标记、包埋和四维（4D）成像的操作步骤，并讨论了优化数据采集的注意事项，以深入解析视杯形态发生机制。...

斑马鱼视杯形态发生的四维成像

本文介绍一种对斑马鱼胚胎大脑进行活体成像的方法，可观察至幼虫期和稚鱼期。该方法借鉴电生理学技术，属于微创操作，能够获取成熟神经元的细胞及亚细胞结构细节，并可与光遗传学及神经药理学研究相结合，用于表征脑功能及药物干预效果。...

通过去除头骨和皮肤实现清醒斑马鱼幼虫和幼鱼全脑组织的活体成像

本文介绍了一种实验方案 体内...

体内全脑成像斑马鱼幼鱼使用三维荧光显微镜

了解延时共聚焦成像技术用于斑马鱼脑发育研究的方法。该技术通过Brainbow多色标记实现神经祖细胞及其后代动态的可视化，为脊椎动物神经系统发育研究提供重要工具。

利用Brainbow技术和活体斑马鱼延时共聚焦成像可视化大脑发育过程

探索更多视频