使用"彩虹"和"延时共聚焦成像"可视化活斑马鱼中发育中的脑

这种方法可以帮助回答关于神经祖细胞及其祖学的动力学的基本问题，这些基因是脊椎动物大脑发育的根据。这种技术的主要优点是能够在许多小时的发育中直接可视化活脑中与克隆相关的细胞的多个集群。该协议还可用于研究斑马鱼胚胎其他发育系统中的克隆和祖体动力学。

使用此方法的可视化对于直接观察神经发育过程中发生的基本过程特别有用。在进行微注射前的下午，在性别隔离交配罐中设置野生型成年斑马鱼。第二天早上，根据手稿指示准备DNA溶液，并在受精后45分钟内将大约4.2升的DNA溶液注入一个细胞斑马鱼胚胎。

将注射的胚胎保持在E三培养和28摄氏度的培养箱中24小时，然后从组调用死亡和畸形的胚胎。将多达20个健康胚胎移植到50毫升的管子中，用10毫升的E三填充，并在每个管上盖上一顶帽子。将 50 毫升管直立放在 37 摄氏度水浴中的机架上，80 至 90 分钟，确保浴池中的水位高于管中的 E 三。

从水浴中取出管架，将其放在 28 摄氏度的培养箱中。允许一个小时让E三冷却，胚胎重新适应温度。然后将它们转移到培养皿与0.2毫摩尔PTU和E三保持温暖在28摄氏度的培养箱。

在热冲击后两到四小时，在标准荧光解剖显微镜下检查胚胎，以表达CFP或YFP，这表明脑弓重组成功。在整个过程中选择具有健壮的FP表达的胚胎，然后将它们转移到一个带PTU的单独培养皿中。给他们成像一、二、三天后受精。

在荧光显微镜下显得暗淡的表达实际上可以在共声延时成像中很好地可视化。在实验前，准备成像室和胚胎操作工具。要准备成像室，请小心地将塑料环粘在60毫米培养皿的中心。

通过将一小段尼龙钓鱼线粘到四英寸木拭子的末尾来构造操纵器。如有必要，在安装前在解剖显微镜下对胚胎进行脱光。要安装胚胎，请将鱼转移到成像室中的塑料环中心，用细尖的移液器去除尽可能多的多余的E三。

使用干净的转移移液器用百分之一的低熔加糖和 E 三覆盖鱼，用一层加糖填充整个塑料环。然后轻轻地将胚胎拉入移液器尖端，然后回到气管中，而不引入任何气泡。使用胚胎操纵器快速定向鱼和红糖之前，它硬化。

如果使用直立显微镜进行成像，请将胚胎尽可能靠近红糖的上表面，确保胚胎与成像室底部平行，其尾部是直的。等待红糖硬化，然后用E三填充成像室，尽可能多地添加，以解释成像过程中蒸发的原因。将带鱼和 E 三的成像室放在共合显微镜上。

然后选择具有高数值孔径和长工作距离的目标的物。查找具有适当密集和明亮标记的细胞区域，并设置采集参数。这是使用 Zen 软件的示例，但设置会因可用的显微镜和激光线而异。

准备三个轨道，按顺序对每个 FP 通道进行图像。使用 argon 激光在 458 纳米时激发 CFP，在 514 纳米时使用 YFP 激发，并使用 DPSS 561 纳米激光器激发 dTomato。以适当的波长收集三个任务。

选择要图像的 Z 堆栈范围和 10 到 30 分钟之间的时间间隔，以跟踪线粒体和凋亡事件。最后，选择成像会话的长度并运行实验。成像完成后，如果使用 Zen 或其他与斐济兼容的格式，则以 CZI 格式保存原始数据，然后使用生物格式导入将图像导入斐济。

体内多色延时成像用于显示脑弓彩色编码的细胞克隆在发育中的斑马鱼后脑的增殖心室区。脑弓标记的细胞排列在特定的径向纤维上，颜色相同。可量化为相对 RGB 通道权重。

这表明，这些无线电组是分裂细胞的克隆，其相似的颜色可以用来识别它们与克隆有关。定量颜色分析表明，子细胞的表达颜色与母细胞的颜色相同。但是，相邻的无线电细胞集群可以彼此区分。

在体内，相关细胞的多个克隆可以同时进行数小时，从而允许进行多路复用血统分析和比较。在两个克隆体中对颜色表达进行量化，然后在受精后三天再次量化，表明脑弓表达在两到三天之间保持相对恒定。延时成像显示，许多细胞在受精后一天到两天内进行运动间核迁移和细胞分裂，因此可以研究细胞周期。

计算的平均细胞周期为8.4小时，与之前的斑马鱼测量结果相当。此外，这种成像技术用于观察单个细胞，这些细胞正经历着与凋亡相关的陈规定型形态变化，如膜出血和细胞分裂。由于此方法在体内执行，因此可以从成像室中救出斑马鱼，并在以后的点进行成像或其他实验。

这种技术的使用使我们能够探索有关克隆相关细胞在神经发育过程中作用的新问题。