Name: 定量糖组学和蛋白质组学组合式净化策略 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: 学习基于单滤膜的高通量方法，同时纯化血浆中的N-糖链和蛋白质，结合液相色谱-串联质谱进行精确定量。该技术可同时分析糖组学和蛋白质组学，为疾病生物标志物发现提供可靠数据。

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本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）国家癌症研究所IMAT项目基金（R33，项目编号CA147988-02）、美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所北卡罗来纳州立大学分子生物技术研究生培训基金（T32GM008776）、美国教育部北卡罗来纳州立大学分子生物技术GAANN博士生奖学金项目（P200A140020）、W.M.凯克基金会以及北卡罗来纳州立大学的资助。鸡血浆样本的获取得到了北卡罗来纳州立大学家禽科学系James N. Petitte博士和Rebecca Wysocky的协助。

<ol><li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).</li>
<li>Preston, R. J. S., Rawley, O., Gleeson, E. M., O'Donnell, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+role+of+carbohydrate+determinants+in+regulating+hemostasis%3A+insights+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Elucidating the role of carbohydrate determinants in regulating hemostasis: insights and opportunities.</a> Blood. 121, 3801-3810 (2013).</li>
<li>Hasnain, S. Z., Gallagher, A. L., Grencis, R. K., Thornton, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+role+for+mucins+in+immunity%3A+Insights+from+gastrointestinal+nematode+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A new role for mucins in immunity: Insights from gastrointestinal nematode infection.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 45, 364-374 (2013).</li>
<li>Roseman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reflections+on+glycobiology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Reflections on glycobiology.</a> J. Biol. Chem. 276, 41527-41542 (2001).</li>
<li>Laine, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+calculation+of+all+possible+oligosaccharide+isomers+both+branched+and+linear+yields+1.05+x+10%2812%29+structures+for+a+reducing+hexasaccharide%3A+The+isomer+barrier+to+development+of+single-method+saccharide+sequencing+or+synthesis+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">A calculation of all possible oligosaccharide isomers both branched and linear yields 1.05 x 10(12) structures for a reducing hexasaccharide: The isomer barrier to development of single-method saccharide sequencing or synthesis systems.</a> Glycobiology. 4, 759-767 (1994).</li>
<li>Zaia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+and+glycomics%5BTitle%5D)+AND+%22Omics%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry and glycomics.</a> Omics. 14, 401-418 (2010).</li>
<li>Hirabayashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lectin-based+structural+glycomics%3A+Glycoproteomics+and+glycan+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+J%22%5BJournal%5D)">Lectin-based structural glycomics: Glycoproteomics and glycan profiling.</a> Glycoconjugate J. 21, 35-40 (2004).</li>
<li>Nilsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+glycopeptides+for+glycan+structure+and+attachment+site+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Enrichment of glycopeptides for glycan structure and attachment site identification.</a> Nat. Methods. 6, 809-811 (2009).</li>
<li>Redmond, J. W., Packer, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+solid-phase+extraction+with+graphitised+carbon+for+the+fractionation+and+purification+of+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohyd.+Res%22%5BJournal%5D)">The use of solid-phase extraction with graphitised carbon for the fractionation and purification of sugars.</a> Carbohyd. Res. 319, 74-79 (1999).</li>
<li>Ruhaak, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+chromatography-based+high-throughput+sample+preparation+method+for+N-glycan+analysis+from+total+human+plasma+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction chromatography-based high-throughput sample preparation method for N-glycan analysis from total human plasma glycoproteins.</a> Anal. Chem. 80, 6119-6126 (2008).</li>
<li>Kim, Y. -G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+high-throughput+analysis+of+N-glycans+from+ovarian+cancer+serum+using+a+96-well+plate+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rapid and high-throughput analysis of N-glycans from ovarian cancer serum using a 96-well plate platform.</a> Anal. Biochem. 391, 151-153 (2009).</li>
<li>Zielinska, D. F., Gnad, F., Wiśniewski, J. R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+mapping+of+an+in+vivo+N-glycoproteome+reveals+rigid+topological+and+sequence+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Precision mapping of an in vivo N-glycoproteome reveals rigid topological and sequence constraints.</a> Cell. 141, 897-907 (2010).</li>
<li>Abdul Rahman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filter-aided+N-glycan+separation+%28FANGS%29%3A+a+convenient+sample+preparation+method+for+mass+spectrometric+N-glycan+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Filter-aided N-glycan separation (FANGS): a convenient sample preparation method for mass spectrometric N-glycan profiling.</a> J. Proteome Res. 13, 1167-1176 (2014).</li>
<li>Walker, S. H., Carlisle, B. C., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+reverse+phase+and+hydrophilic+interaction+liquid+chromatography+platforms+for+the+analysis+of+N-linked+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of reverse phase and hydrophilic interaction liquid chromatography platforms for the analysis of N-linked glycans.</a> Anal. Chem. 84, 8198-8206 (2012).</li>
<li>Walker, S. H., Taylor, A. D., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individuality+normalization+when+labeling+with+isotopic+glycan+hydrazide+tags+%28INLIGHT%29%3A+A+novel+glycan-relative+quantification+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectr%22%5BJournal%5D)">Individuality normalization when labeling with isotopic glycan hydrazide tags (INLIGHT): A novel glycan-relative quantification strategy.</a> J. Am. Soc. Mass Spectr. 24, 1376-1384 (2013).</li>
<li>Walker, S. H., Lilley, L. M., Enamorado, M. F., Comins, D. L., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+derivatization+of+N-linked+glycans+for+increased+ion+abundance+in+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass.+Spectr%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic derivatization of N-linked glycans for increased ion abundance in electrospray ionization mass spectrometry.</a> J. Am. Soc. Mass. Spectr. 22, 1309-1317 (2011).</li>
<li>Baldwin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permethylation+and+tandem+mass+spectrometry+of+oligosaccharides+having+free+hexosamine%3A+Analysis+of+the+glycoinositol+phospholipid+anchor+glycan+from+the+scrapie+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Permethylation and tandem mass spectrometry of oligosaccharides having free hexosamine: Analysis of the glycoinositol phospholipid anchor glycan from the scrapie prion protein.</a> Anal. Biochem. 191, 174-182 (1990).</li>
<li>Harvey, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivatization+of+carbohydrates+for+analysis+by+chromatography%3B+electrophoresis+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B%22%5BJournal%5D)">Derivatization of carbohydrates for analysis by chromatography; electrophoresis and mass spectrometry.</a> J. Chromatogr. B. 879, 1196-1225 (2011).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitive+screening+design+optimization+of+mass+spectrometry+parameters+for+sensitive+comparison+of+filter+and+solid+phase+extraction+purified%2C+inlight+plasma+N-glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Definitive screening design optimization of mass spectrometry parameters for sensitive comparison of filter and solid phase extraction purified, inlight plasma N-glycans.</a> Anal. Chem. 87, 7305-7312 (2015).</li>
<li>Nepomuceno, A. I., Gibson, R. J., Randall, S. M., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+identification+of+deamidated+peptides+in+global+proteomics+using+a+quadrupole+orbitrap+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Accurate identification of deamidated peptides in global proteomics using a quadrupole orbitrap mass spectrometer.</a> J. Proteome Res. 13, 777-785 (2013).</li>
<li>Yen, T. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+challenges+and+opening+new+opportunities+in+glycoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Overcoming challenges and opening new opportunities in glycoproteomics.</a> Biomolecules. 3, 270-286 (2013).</li>
<li>Meiring, H. D., van der Heeft, E., ten Hove, G. J., de Jong, A. P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+LC-MS%28n%29%3A+technical+design+and+applications+to+peptide+and+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Sep.+Sci%22%5BJournal%5D)">Nanoscale LC-MS(n): technical design and applications to peptide and protein.</a> J. Sep. Sci. 25, 557-568 (2002).</li>
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<li>Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+to+correlate+tandem+mass+spectral+data+of+peptides+with+amino+acid+sequences+in+a+protein+database%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database.</a> J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 5, 976-989 (1994).</li>
<li>Gonzalez-Galarza, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+appraisal+of+techniques%2C+software+packages%2C+and+standards+for+quantitative+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Omics%22%5BJournal%5D)">A critical appraisal of techniques, software packages, and standards for quantitative proteomic analysis.</a> Omics. 16, 431-442 (2012).</li>
<li>Spivak, M., Weston, J., Bottou, L., Käll, L., Noble, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+to+the+Percolator+Algorithm+for+Peptide+Identification+from+Shotgun+Proteomics+Data+Sets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Improvements to the Percolator Algorithm for Peptide Identification from Shotgun Proteomics Data Sets.</a> J Proteome Res. 8, 3737-3745 (2009).</li>
<li>Collier, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+stable-isotope+labeling+with+amino+acids+in+cell+culture+and+spectral+counting+for+relative+quantification+of+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Sp%22%5BJournal%5D)">Comparison of stable-isotope labeling with amino acids in cell culture and spectral counting for relative quantification of protein expression.</a> Rapid Commun Mass Sp. 25, 2524-2532 (2011).</li>
<li>Kronewitter, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+retrosynthetic+glycan+libraries+to+profile+and+classify+the+human+serum+N-linked+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The development of retrosynthetic glycan libraries to profile and classify the human serum N-linked glycome.</a> Proteomics. 9, 2986-2994 (2009).</li>
<li>Sheeley, D. M., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+carbohydrate+sequence%2C+linkage%2C+and+branching+in+a+quadrupole+ion+trap+mass+spectrometer%3A+Neutral+oligosaccharides+and+N-linked+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of carbohydrate sequence, linkage, and branching in a quadrupole ion trap mass spectrometer: Neutral oligosaccharides and N-linked glycans.</a> Anal. Chem. 70, 3053-3059 (1998).</li>
</ol>

我们与剑桥同位素实验室（Cambridge Isotope Laboratories，CIL）建立了合作关系，以产品（GTK-1000）的形式向更广泛的科学界推广P2GPN试剂及相关技术。然而，我们并不从该产品的销售中获得任何收入。

高通量定量方法的开发对于实现常规糖链分析至关重要。尽管糖组学在疾病研究、临床应用和药物开发中具有重要意义，但在过去三十年中，其分析技术仍局限于少数研究团队。FANGS-P2GPN 糖组学与蛋白质组学纯化及标记方法可在同一样本分装中完成相同的分析，从而降低试剂成本并减少所需样品量（在人类和小鼠研究中尤为重要）。此外，尽可能减少样品制备过程中的变异性极为关键，因为每增加一个操作步骤都会引入误差，可能掩盖病例-对照研究中重要但丰度较低的变化。将 FANGS 与疏水性肼类标记技术结合，可使蛋白质和糖链样本在同一反相液相色谱（RPLC）柱上进行分析，增强糖链的离子化效率，实现相对定量，并可对血浆样本进行定量分析。
对于 N-糖链分析，使用建议量的PNGase F以实现完全去糖基化至关重要。尽管糖链位于蛋白质溶剂可及区域，但蛋白质变性处理及过量酶的使用有助于确保切割反应高效且彻底。为了准确量化糖链，必须在衍生化后将其完全干燥，以终止反应并防止NAT与SIL物种混合时发生交叉反应。最后，当将实验流程扩展至糖基化位点分析时，各步骤的时间控制至关重要，以最大限度减少非特异性脱酰胺反应。所提供的用于糖组学与蛋白质组学联合分析的改进方案，若按要求操作，可稳定获得可靠结果。
该工作流程与金标准固相萃取（SPE）方法相比，可实现对血浆中 N-糖链的准确相对定量。在分子量、亲水性及组成结构方面，所提取的糖链类型无明显偏差。尽管我们尚未探索 O-连接糖链的定性分析，但我们预计在 N-连接糖链经PNGase F消化后，FANGS方法可兼容加入β-消除步骤。然而，该过程在质谱分析前需对试剂进行彻底清除，操作步骤将需大幅调整，且肽段分析会受到显著影响。在蛋白质组学方面，该方法可达到与传统FASP方法相当的蛋白质组覆盖深度。重要的是，该方法实现了 N-糖链脱酰胺的极低假发现率。虽然该方法在PNGase消化步骤中兼容天冬酰胺（Asn）的18O标记22,23，但较低的糖基化位点假发现率表明该标记可能并非必需，从而进一步降低了成本与操作复杂性。
该方法未对蛋白质组中的糖蛋白进行富集，这既有优点也有缺点。某些低丰度的糖蛋白可能在分析中无法被检测到。然而，可以在不同生物样本之间比较每个蛋白质上糖基化位点的占据情况。此外，消除了由凝集素亲和纯化或化学富集所引入的误差和偏差。总之，将FANGS与使用糖链肼标签标记时的个体化归一化策略相结合，形成了一种简化的、可定量的、高通量的糖组和蛋白质组串联分析方法，在临床病例-对照研究中具有广阔的应用前景。

在蛋白质组学领域，滤膜辅助样品制备（FASP）因其能够减少起始材料用量、降低样品制备过程中的人为干扰，并最大化样品通量而被广泛应用1。然而，类似的方法在糖组学领域尚未出现并获得广泛应用。由于糖基化在生物防御中具有关键作用，并且在癌症或疾病中受到调控，因此迫切需要开发高通量、定量的分析流程2,3。在哺乳动物中，N-糖链由重复的单糖单元（己糖（Hex）、己糖胺（HexNac）、唾液酸（NeuAc）和岩藻糖（Fuc））组成，这些单元修饰在一个核心结构（Hex3HexNac2）4上，并共价连接至天冬酰胺。尽管考虑异构体时糖结构空间极为庞大（&#62;1012），但从组成层面来看其多样性相对有限，分子量通常在1,000–8,000 Da之间5。该类糖链的组成均一性以及其强亲水性，为纯化、分离和质谱（MS）分析流程带来了独特的挑战6。
传统上，N-聚糖通过肽-N-糖苷酶F（PNGase F）从蛋白质或肽段上消化下来，随后通过凝集素亲和层析7进行富集，或通过肼基化微珠捕获8，或通过固相萃取（SPE）纯化9,10。尽管这些方法均非常有效，但它们引入了额外的脱盐步骤，并限制了可同时处理的样品数量。在过去十年中，已提出多种用于糖组学的高通量平台。Kim et al. 报道了一种使用真空驱动的96孔SPE板的半自动化方法11。此外，Mann团队开发了一种亲和滤膜法（N-glyco-FASP），该方法需先用多种凝集素复合物对滤膜进行衍生化12。最后，Thomas-Oates团队提出了一种半定量方法——滤膜辅助N-聚糖分离法（FANGS），该方法利用了糖组空间组成范围较窄的特点13。该方法依赖于分子量截断滤膜，首先将小分子污染物冲洗至废液，然后对N-聚糖进行消化并洗脱。在此方案中，去糖基化的蛋白质保留在滤膜上，可进一步进行在线FASP处理。
通过电喷雾电离（ESI）质谱法对糖链进行鉴定和定量，需要离线分离以实现异构体的部分分辨，并需进行衍生化处理以检测低丰度的糖链组分。在归一化过程中使用糖链肼标签标记个体样本，可与反相液相色谱（RPLC）兼容14,15。4-苯乙基苯肼（P2PGN）疏水性标签可改变糖链的亲水性，使其平均离子化效率提高约四倍16。尽管其他技术如全甲基化17或胺基反应性标记化学方法18也具有类似优势，但在肼基反应中，糖链可在温和条件下以1:1的化学计量比进行反应。通过将经天然（NAT）或13C6稳定同位素标签（SIL）衍生化的样品进行串联分析，可实现相对定量。
以下方法改进了用于血浆应用的FANGS技术，并将其与P2GPN疏水标签结合，以实现准确的相对定量。此外，该方法设计用于对单一样品等分试样进行鸟枪法蛋白质组学、脱酰胺分析和定量糖组学分析，且不会影响各分析的完整性。

<table><tbody><tr><td>乙酸（50%）</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>45754</td><td></td></tr><tr><td>乙腈，HPLC级</td><td>Burdick &amp; Jackson&amp;nbsp;</td><td>AH015-4</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢铵</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Bradford试剂</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>B6916</td><td>替代方案：双辛可宁酸试剂盒（Sigma Aldrich BCA1）</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td>其他可达到14,000 × g的离心机亦适用</td></tr><tr><td>DL-二硫苏糖醇，1&amp;nbsp;M 溶液</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Easy-nLC 1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>LC120</td><td>其他纳米级或超高压液相色谱系统可获得类似数据，例如：1. Dionex UltiMate&amp;Ograve; 3000 LC（Thermo Scientific）；2. Acquity UPLC（Waters）</td></tr><tr><td>浮力试管架</td><td>TedPella</td><td>20831-20</td><td></td></tr><tr><td>胎球蛋白（Fetuin）</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>P6042S</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Isotemp标准实验室烘箱</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-625F</td><td>其他可达到56&amp;nbsp;&amp;deg;C的培养箱亦适用</td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>56302</td><td></td></tr><tr><td>GE微波炉</td><td>General Electric</td><td>57B5 E82904</td><td>任何具备可调功率设置的微波炉均可使用</td></tr><tr><td>INLIGHT糖链标记试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>GTK-1000</td><td>INLIGHT试剂盒提供P2GPN试剂的NAT和SIL两种版本</td></tr><tr><td>碘乙酰胺</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A3221</td><td></td></tr><tr><td>Kinetix 2.6 mM，100 &amp;Aring;，C&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt; 填料固定相</td><td>Phenomenex&amp;nbsp;</td><td>Bulk Media</td><td>替代方案：任何C&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt; 固定相，5&amp;nbsp;mM</td></tr><tr><td>Mascot Daemon软件与服务器</td><td>Matrix Science</td><td></td><td>替代方案：Proteome Discoverer软件（Thermo Scientific）</td></tr><tr><td>甲醇，HPLC级</td><td>Burdick &amp; Jackson&amp;nbsp;</td><td>AH230-4</td><td></td></tr><tr><td>PicoFrit自装填色谱柱：360&amp;nbsp;&amp;#956;m外径，75&amp;nbsp;&amp;#956;m内径，15&amp;nbsp;&amp;#956;m喷嘴，无涂层，每盒5根，50 cm</td><td>New Objective</td><td>1 5 PF360-75-15-N-5</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F（无甘油），75,000&amp;nbsp;单位/mL</td><td>New England BioLabs</td><td>P0705L</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive HF杂交四极杆-Orbitrap质谱仪</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>其他高质谱精度（5&amp;nbsp;ppm）质谱仪亦可提供类似数据</td></tr><tr><td>RNase B</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>P7817S</td><td></td></tr><tr><td>猪胰蛋白酶</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>T6567-5X</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>51456</td><td></td></tr><tr><td>真空浓缩仪Savant SPD131DDA SpeedVac浓缩仪</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD131DDA</td><td>其他真空浓缩仪亦适用</td></tr><tr><td>Vivacon 500 30 kDa滤膜&amp;nbsp;</td><td>Sartorius Stedim Biotech</td><td>VN01H22</td><td>替代方案：Amicon Ultra 0.5离心滤膜装置，Ultracel-10&amp;nbsp;kDa膜（Millipore UFC501096）</td></tr><tr><td>水，HPLC级</td><td>Burdick &amp; Jackson&amp;nbsp;</td><td>AH365-4</td><td></td></tr><tr><td>水，&lt;sup&gt;18&lt;/sup&gt;O</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>OLM-240-97-1</td><td>在PNGase F消化步骤中添加&lt;sup&gt;18&lt;/sup&gt;O为可选操作，对于置信度达95%的去酰胺化研究可能并非必需</td></tr><tr><td>Xcalibur 2.0</td><td>Thermo Scientific</td><td>XCALIBUR20</td><td></td></tr><tr><td>Zwittergent测试试剂盒</td><td>Merck Millipore</td><td>693030</td><td></td></tr></tbody></table>

一种定量糖组学与蛋白质组学结合的纯化策略

A Quantitative Glycomics and Proteomics Combined Purification Strategy

在生物与临床科学领域，人们日益希望整合并关联多种类型的生物分子，以揭示生物学机制、定义通路、改进治疗方案、理解疾病并促进生物标志物的发现。N-连接糖基化是蛋白质上最重要且最稳定的翻译后修饰之一，调控着信号传导、细胞黏附和酶活性等关键细胞功能。在过去十年中，用于纯化和分析N-聚糖的分析技术发展相对缓慢。尽管现有方法准确且有效，但通常需要较高的专业技术水平和资源投入。虽然已开发出一些高通量纯化方案，但其尚未得到广泛应用，且往往依赖于糖肽的富集。Thomas-Oates 等提出的一种有前景的方法——滤膜辅助N-聚糖分离法（FANGS），已在组织样本中进行了定性验证。本文中，我们将FANGS方法改进并应用于血浆样本，并将其与“使用糖链肼标记物进行个体化归一化”策略相结合，以实现通过液相色谱-质谱法进行精确的相对定量分析，并增强电喷雾离子化效率。此外，我们进一步拓展了该方案的功能，实现了对鸡血浆样本的串联、 shotgun 蛋白质组学及糖基化位点分析。我们证明，通过滤膜纯化并以疏水性肼标记物衍生化的N-聚糖，在丰度和类别上与固相萃取（SPE）方法获得的结果相当；而后者被公认为该领域的金标准。重要的是，两种方案之间的变异性在统计学上无显著差异。与糖组学数据同步采集的蛋白质组数据，其检测深度与标准胰蛋白酶消化方法相当。本方案有效减少了肽段脱酰胺反应，从而限制了在糖基化基序处检测到的非特异性脱酰胺现象。这使得可直接进行糖基化位点分析，同时该方案也兼容18O位点标记。总体而言，我们展示了一种新型的、在线的、高通量、无偏倚、基于滤膜的定量糖组学与蛋白质组学联合分析方案。

<img alt="病例对照生物样本处理示意图，含PNGase F消化的糖组学/蛋白质组学工作流程。" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1：用于整合蛋白质组学与糖组学分析的FANGS-P2GPN疏水标记偶联方法（方法A）示意图。 图中突出显示了仅进行糖组学处理与串联糖组学和蛋白质组学分析（含糖基化位点鉴定）之间的步骤差异。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
采用在线蛋白质组学与糖组学的基于滤膜的P2GPN疏水标记方法（方法A），利用混合鸡血浆样本对糖链的鉴定、定量及分子量偏差进行了验证（图1）。在仅进行糖组学实验时，将方法A提取的N-糖链丰度与碳柱固相萃取法（金标准，方法B）进行了相互比较（图2）。两种方法在糖链丰度上无显著差异。还通过同一方法提取糖链的SIL:NAT比值评估了方法内变异性。两种方法的log2分布均呈高斯分布，中心位于零附近，且无显著差异（图3A-B）。两种方案的分子量范围完全重叠，表明滤膜未基于分子量范围或亲水性对N-糖链产生选择性偏倚（图4）。
<img alt="方法B与方法A比率比较图表；带误差棒的统计方差数据分析。" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2： 采用方法A或方法B从2.5 μl鸡血浆（N = 4）中提取的NAT与SIL等摩尔混合的N-糖链样品。 样品按照第6节推荐的参数进行UPLC-MS分析。每种糖链在NAT/SIL各通道中的丰度通过积分提取离子色谱图峰面积（MMA = 3 ppm）、校正分子量重叠效应，并根据TGNF进行调整后计算得出。图中显示了相应的标准误差。方法B与方法A的N-糖链丰度之间无显著差异（p &gt;0.05）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="Log2(SIL:NAT) 分布的直方图比较；上方为灰色，下方为蓝色，显示计数与累积频率的关系。" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：比较了（A）方法 A（N = 133）与（B）方法 B（N = 123）策略的组内变异性。采用相同提取方案获得的 N-糖链的 NAT 与 SIL 等摩尔混合物，经三次技术重复进行分析。log2 分布以零为中心，两种实验流程之间的分布无显著差异。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="聚糖分子量比较图；方法A与方法B；递增趋势分析。" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4： 对每种策略获得的聚糖分子量范围进行了比较。两种实验流程所产生的聚糖覆盖相同的分子量范围。一种方案中检测到的 N-聚糖相对于另一种方案略高于检测限（1 × 105 丰度），并不反映系统性偏差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
去糖基化蛋白被分子量过滤器保留，从而实现了在线全蛋白质组分析及糖基化位点鉴定。本文将多种糖链和蛋白质联合纯化方案与传统的不含去糖基化步骤的FASP制备方法进行了比较。表5）。我们通常采用的18小时基于滤膜的PNGase F消化，随后进行FASP胰蛋白酶消化（标准方案），会导致较高水平的非特异性脱酰胺，这可能干扰糖基化位点的鉴定。因此，采用一种在较高温度下缩短孵育时间的方法（50 °C）并探索了PNGase F内标添加步骤（SPI方案）以及微波消解方案（MD方案）作为替代方法，以尽量减少非特异性脱氨反应。新消解方法中观察到的糖链在组成和丰度上与标准18小时 37 °C 过滤PNGase F消化产物图5）。结合短时间的胰蛋白酶孵育，非特异性脱氨作用显著减少，糖基化位点的假阳性率 &lt;5% (表5).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="4">蛋白质</td>
			<td></td>
			<td colspan="4">肽段</td>
			<td></td>
			<td colspan="4">脱酰胺肽段</td>
			<td></td>
			<td colspan="4">糖基化位点</td>
			<td></td>
			<td colspan="4">糖蛋白</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">+</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">+</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">+</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">+</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">+</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">FASP</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">249</td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">3083</td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">795</td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">5</td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">18小时</td>
			<td colspan="2">217</td>
			<td colspan="2">304</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">6013</td>
			<td colspan="2">5086</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">1029</td>
			<td colspan="2">733</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">257</td>
			<td colspan="2">24</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">112</td>
			<td colspan="2">18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">MD</td>
			<td colspan="2">270</td>
			<td colspan="2">266</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">5190</td>
			<td colspan="2">5125</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">465</td>
			<td colspan="2">455</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">254</td>
			<td colspan="2">8</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">102</td>
			<td colspan="2">7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">SPI</td>
			<td colspan="2">281</td>
			<td colspan="2">288</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">4729</td>
			<td colspan="2">4482</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">602</td>
			<td colspan="2">573</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">232</td>
			<td colspan="2">10</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">145</td>
			<td colspan="2">8</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表5： 对标准胰蛋白酶消化法与在线FANGS-P2GPN标记方法的蛋白质组学数据进行了比较。 实验分别在添加（+）和不添加（-）PNGase F的条件下进行，以确定非特异性脱酰胺反应的背景水平，并评估糖基化位点假阳性率。蛋白质鉴定的假发现率（FDR）设定为1%；肽段筛选基于Proteome Discoverer 1.4软件中的“高”肽段置信度（q &lt;0.01）；糖基化位点的鉴定依据为包含保守糖基化基序（N-X-S/T）中天冬酰胺脱酰胺的唯一序列；糖蛋白则定义为至少含有一个已鉴定糖基化位点的已鉴定蛋白质。
<img alt="比较 MD 与 SPI 中糖链数量的直方图，显示 Log2(18小时/方法比值) 分布。" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 5"> 
图5：开发了缩短的糖链处理方案，以尽量减少样品中的脱氨反应，并与18小时FANGS PNGase F消化法进行比较。MD（2.2.3）和SPI（2.2.2）方案在丰度上的平均差异分别为10%和5%。在鉴定出的48种糖链中，90%的糖链变化倍数小于1.5倍。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

开发了一种高通量方案，用于血浆中蛋白质组学与糖组学联合纯化及液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）定量分析。N-连接糖基化基序的脱酰胺分析特异性针对去糖基化位点。通过将滤膜辅助的N-糖链分离与糖链肼基标签标记过程中的个体性归一化策略相结合，实现了对N-糖链的准确定量。

生物和临床科学领域日益希望整合并关联多种类型的生物分子，以揭示生物学机制、定义……

本单滤膜法工作流程的总体目标是从生物样本中简便、定量地连续纯化N-糖链和蛋白质，用于质谱分析。该方法具有可扩展性、快速性以及良好的分析重现性，对生物质谱实验室而言，在资源和技能要求方面均易于实现。该技术的主要优势在于，能够在大规模高通量的生物研究中，同时开展糖组学、糖基化位点占据率以及蛋白质组学相关问题的研究。我们通过将该方法与专为质谱设计的衍生化策略相结合，克服了N-糖链检测中的各项挑战，实现了癌症状态与对照状态之间准确的相对定量。由于分析变异性降低，有望揭示糖组与蛋白质组之间新的生物学相互作用，从而深入理解疾病状态，并为生物标志物的发现提供新的机遇。实验开始时，将2.5 µL血浆上样至滤膜上。然后，向滤器中的每个样品加入 2 µL 的 1 M 二硫苏糖醇溶液。用 200 µL 的 100 mM 碳酸氢铵 PNGase 消化缓冲液稀释样品。盖紧滤器样品管，轻轻涡旋震荡，注意不要扰动滤器在底座中的位置。将样品在 56 摄氏度下孵育 30 分钟，以使蛋白质和糖蛋白变性。为烷基化样品，加入 50 微升 1M 碘乙酰胺，使终浓度约为 200 mM。然后在 37 摄氏度下孵育 60 分钟。将变性后的糖蛋白通过离心浓缩至滤膜上：样品在14,000 × g条件下离心40分钟，弃去滤过液。用100 µL PNGase消化缓冲液洗涤样品。再次将糖蛋白在滤膜上浓缩，并弃去滤过液。重复洗涤和浓缩步骤两次，共进行三次，最终在滤膜残留体积中获得浓缩样品。洗涤完成后，弃去所有穿滤液和收集管。然后，将滤膜转移至新的收集管后，向其中加入2 µL无甘油的肽-N-糖苷酶F（peptide N-glycosidase F）或PNGase F。加入98微升PNGase消化缓冲液，使总体积达到100微升，并轻轻吹打滤膜上的溶液以混匀。在消化程序的加标步骤中，将样品于50摄氏度孵育2小时。操作需迅速，取出样品后加入额外的2微升无甘油PNGase F，轻轻涡旋1至2秒以混匀。将样品在 50 摄氏度下继续孵育 2 小时。在 20 摄氏度下通过离心洗脱糖链后，向滤膜中加入 100 微升 PNGase 消化缓冲液，并再次离心。收集含有任何残留 N-连接糖链的洗涤液，与洗脱液一同置于同一收集管中。重复两次后，移去滤膜，将其放入新的收集管中用于蛋白质组学样品制备。接着，将糖链样品置于80摄氏度的冰箱中孵育30至60分钟，直至完全冻结。然后，在室温下使用真空浓缩仪干燥4至6小时，直至完全干燥。用400微升8M尿素缓冲液冲洗含有去氨基化肽段的滤膜。盖上收集管管盖，轻轻涡旋混匀。在弃去全部滤过液之前，先将肽段在滤膜上浓缩。在重复尿素缓冲液洗涤两次后，用胰蛋白酶消化缓冲液冲洗含有脱氨肽段的滤膜。盖紧收集管，轻轻涡旋混匀，然后如前所述再次在滤膜上进行浓缩。弃去全部滤过液，并重复此步骤2次，共完成3次胰蛋白酶消化缓冲液洗涤。将所有后续洗脱液和洗涤液收集至一个新的收集管中。然后，按照发现性蛋白质组学实验中胰蛋白酶与蛋白质比例为1:50，或定量蛋白质组学实验中比例为1:5，加入50微升猪源修饰胰蛋白酶。盖上收集管，轻轻涡旋混匀。将样品在 37 摄氏度孵育 2 小时后，迅速取出样品，并按照适当的胰蛋白酶与蛋白质比例加入额外的 50 微升胰蛋白酶。轻轻涡旋样品 1 至 2 秒以混匀。然后在 50 摄氏度继续孵育 2 小时。按照之前的方法离心20分钟洗脱肽段后，用淬灭缓冲液冲洗滤膜上残留的肽段。再按照之前的方法离心15分钟，将肽段从滤膜上洗脱下来。在测定样品中的肽段浓度后，将肽段样品置于80摄氏度的冰箱中孵育至完全冻结。然后，在真空浓缩仪中于室温下干燥4至6小时，直至完全干燥。在进行液相色谱-质谱联用（LCMS）分析之前，将胰蛋白酶消化后的蛋白质溶解于流动相A中，调整至所需浓度。由2.5微升血浆获得的胰蛋白酶肽段浓度范围为每微升100至300纳克。在进行糖链分析之前，将冻干的稳定同位素标记的4-苯乙基苯甲酰肼试剂以及未标记的P2GPN试剂分别用1毫升衍生化溶液重悬，使其终浓度为0.25毫克/毫升。试剂完全溶解可能需要长达10分钟，需充分涡旋振荡以确保完全溶解。用200微升稳定同位素标记或天然的P2GPN试剂标记干燥的N-聚糖。反复吹打以重新悬浮干燥的聚糖。随后涡旋混匀样品，并在台式离心机上离心约5秒，使液体沉至管底。将糖类与试剂在56 °C下反应3小时。立即将糖类从培养箱转移至真空浓缩仪，并在55 °C下干燥3至5小时直至完全干燥。在进行液相色谱-质谱分析前，立即将标记的N-糖链重新悬浮于25至50 µL水中。用移液器反复吹打，确保N-糖链完全溶解。按照之前方法离心5分钟，弃去上清液，注意移液器吸头不要接触离心管底部。将一对天然样品与稳定同位素标记样品按1:1比例混合，用于相对定量串联分析。为蛋白质组学和糖组学工作流程准备两种不同的液相色谱-质谱联用方法。进行蛋白质分析时，将约400纳克蛋白质在NPA中上样至色谱柱。以每分钟300纳升的流速运行样品，预柱平衡体积为1微升，分析柱平衡体积为5微升。在文本方案提供的质谱条件下使蛋白质离子化。进行糖链分析时，将5微升重悬的P2GPN标记的天然型与稳定同位素标记的等摩尔（equi-M）样品注入色谱柱。以300纳升/分钟的流速运行样品，预柱平衡体积为2微升，分析柱平衡体积为5微升。然后，在文本方案提供的质谱条件下对糖链进行离子化。基于滤膜的纯化方案与标准固相萃取方法进行了比较，两种方案检测到的血浆糖链丰度无显著差异。在两种方法中，接近检测限的糖链均表现出较高的变异性。评估了采用基于滤膜或标准固相萃取方法纯化的血浆中 equiM 混合物的个体间变异性。两种方法均呈现正态分布，其均值与零相比无显著差异。80% 的糖链变化在两倍范围内。新旧纯化方案中检测到的糖链分子量分布无显著差异，且覆盖相同范围。定性分析未观察到糖链之间的偏好性。血浆蛋白采用标准的滤膜辅助样品制备法及多种在线联用方案进行处理。不同方案所鉴定出的蛋白质数量相似。在微波消化和尖峰未消化方案中，非特异性脱酰胺被控制在10%以下。在进行该操作时，需注意准确的糖基化位点占据率依赖于尽量减少热量和时间的暴露。一旦掌握，该内联 pecurikene N-聚糖纯化方法可在两天内完成。通过遵循本方案，可利用高阶统计技术对蛋白质 N-聚糖的定量结果及糖基化位点占据情况进行整合与建模。该技术能够快速解读癌症生物学所表达的复杂语言，对蛋白质治疗剂的差异进行定量比较，并真正揭示糖基化在生物学背景中的重要性。

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