定量糖组学和蛋白质组学组合式净化策略

这种基于单过滤器的工作流程的总体目标是从质谱分析的生物样品中轻松、定量地同时纯化 N-糖和蛋白质。该方法的可扩展性、速度和分析重现性使其在生物质谱实验室的资源和技能集方面可以直接使用。该技术的主要优点是它允许研究人员在大规模高通量生物学研究中同时研究糖组学、糖基化位点占用率和蛋白质组学问题。

通过将该方法与质谱定制的衍生化策略相结合，我们克服了 N-糖测量的挑战，从而在癌症和对照状态之间实现了准确的相对定量。随着分析变异性的降低，可以阐明糖组和蛋白质组之间的新生物相互作用，从而获得对疾病状态的关键见解和生物标志物发现的新机会。首先，将 2.5 μL 血浆加载到过滤器上。

然后，向过滤器中的每个样品中加入 2 微升 1M 二硫苏糖醇溶液。用 200 微升 100 mM 碳酸氢铵 PNGase 消化缓冲液稀释样品。盖上过滤器样品管并轻轻涡旋，小心不要从其底座上干扰过滤器。

将样品在 56 摄氏度下孵育 30 分钟，以使蛋白质和糖蛋白变性。为了对样品进行烷基化，加入 50 μL 的 1M 碘乙酰胺，得到约 200 mM 的最终浓度。然后，在 37 摄氏度下孵育 60 分钟。

丢弃流出液之前，将样品以 14， 000 x g 离心 40 分钟，将变性糖蛋白浓缩到过滤器上。用 100 μL PNGase 消化缓冲液洗涤样品。将糖蛋白集中在过滤器上，丢弃流出液。

重复洗涤和浓缩步骤两次，总共 3 次，在过滤器死体积中产生浓缩物。洗涤完成后，丢弃所有流通液和收集瓶。然后，转移到新鲜收集瓶中后，向过滤器中加入 2 μL 不含甘油的肽 N-糖苷酶 F 或 PNGase F。

加入 98 μL PNGase 消化缓冲液，使总体积达到 100 μL，然后在过滤器上轻轻上下移液以混合。对于消化方案中的加标，将样品在 50 摄氏度下孵育 2 小时。快速工作，取出样品并加标另外 2 μL 不含甘油的 PNGase F.将样品轻轻涡旋 1 至 2 秒以混合。

将样品在 50 摄氏度下再孵育 2 小时。通过在 20 °C 下离心样品以逃避游离寡糖后，向过滤器中加入 100 μL PNGase 消化缓冲液并再次离心。将含有任何剩余 N-连接糖的洗涤液收集在与洗脱液相同的收集瓶中。

重复两次后，取下过滤器并放入新的收集瓶中进行蛋白质组学制备。接下来，将游离寡糖样品在 80 摄氏度的冰箱中孵育 30 至 60 分钟，直至冻结。然后，在真空浓缩器中室温干燥 4 至 6 小时。

用 400 微升 8M 尿素缓冲液冲洗含有脱钙肽的过滤器。盖上收集瓶盖，轻轻涡旋混合。在丢弃所有流过之前，将肽集中在过滤器上。

再重复尿素缓冲液洗涤两次后，用胰蛋白酶消化缓冲液冲洗含有脱钙肽的过滤器。盖上收集瓶盖并轻轻涡旋混合，然后像以前一样再次集中在过滤器上。弃去所有流出液，再重复 2 次，总共 3 次胰蛋白酶消化缓冲液洗涤。

将所有未来的洗脱液和洗涤液收集到新的收集瓶中。然后，以 1：50 胰蛋白酶与蛋白质的比例添加 50 微升猪修饰的胰蛋白酶，用于发现蛋白质组学，或以 1：5 的胰蛋白酶与蛋白质比例添加，用于定量蛋白质组学实验。盖上收集瓶盖，轻轻涡旋混合。

将样品在 37 摄氏度下孵育 2 小时后，快速去除样品，并以适当的胰蛋白酶与蛋白质比例再加入 50 μL 胰蛋白酶。将样品轻轻涡旋 1 至 2 秒以混合。然后，在 50 摄氏度下再孵育 2 小时。

像以前一样离心 20 分钟洗脱肽后，用淬灭缓冲液冲洗过滤器中剩余的肽。像以前一样离心 15 分钟，洗脱过滤器。定量样品中的肽浓度后，将肽样品在 80 摄氏度的冰箱中孵育直至冷冻。

然后，在真空浓缩器中室温干燥 4 至 6 小时。然后，在液相色谱质谱法或 LCMS 分析之前，在流动相 A 中将胰蛋白酶蛋白提取至所需浓度。2.5 μL 血浆中的胰蛋白酶肽浓度范围为 100 至 300 ng/μL。

在聚糖分析之前，将干燥的稳定同位素标记的 4-苯乙基苯并酰肼试剂以及天然 P2GPN 试剂放入 1 mL 衍生化溶液中，最终浓度为 0.25 mg/mL。试剂需要 10 分钟才能完全溶解。广泛涡旋以确保完全溶解。

用 200 μL 稳定同位素标记或天然 P2GPN 试剂标记干燥的 N-糖。上下移液以重新悬浮干燥的游离寡糖。然后，涡旋样品并在台式离心机上离心约 5 秒。

将游离寡糖与试剂在 56 摄氏度下反应 3 小时。立即将游离寡糖从培养箱转移到真空浓缩器中，并在 55 摄氏度下干燥 3 至 5 小时。在液相色谱和质谱分析之前，将标记的 N-糖重悬于 25 至 50 μL 水中。

上下移液以确保 N-糖完全溶解。像以前一样离心样品 5 分钟后，去除上清液，小心不要让移液器尖端接触离心管底部。将一对天然和稳定同位素标记的样品以 1：1 的比例混合，用于相对定量串联分析。

为蛋白质组学和糖组学工作流程准备 2 种不同的 LCMS 方法。对于蛋白质分析，将大约 400 ng 蛋白质注入 NPA 中的色谱柱上。以 300 ng/min 的速度运行样品，采用 1 μL 柱前平衡和 5 μL 分析柱平衡。

在文本方案中提供的 MS 条件下电离蛋白质。对于游离寡糖分析，将 5 μL 重悬的 P2GPN 标记的天然和稳定同位素标记的 equi-M 样品注入色谱柱上。以 300 ng/min 的速度运行样品，进行 2 μL 柱前平衡和 5 μL 分析柱平衡。

然后，在文本实验方案中提供的 MS 条件下电离游离寡糖。将基于过滤器的纯化方案与标准固相萃取方法进行了比较，两种方案之间检测到的血浆糖丰度没有显著差异。在两种方法中，相同的游离寡糖均在检测限附近发现，但变异性增加。

评估了通过基于过滤器或标准固相萃取方案纯化的血浆 equiM 混合物的互变性。两种协议都具有高斯分布，其均值与零没有显著差异。80% 的聚糖落在两倍的变化范围内。

在新型和传统纯化方案中检测到的游离寡糖的分子量分布没有显著差异，并且覆盖了相同的范围。在定性上，未观察到聚糖之间的偏倚。通过标准过滤辅助样品制备和多种在线方案制备血浆蛋白。

对于各种方案，鉴定的蛋白质数量相似。在微波消解和加标消化不良方案中，非特异性脱酰胺被控制在 10% 以下。在尝试此程序时，重要的是要记住，准确的糖基化位点占用率取决于最大限度地减少热量和暴露时间。

掌握后，英蓝 pecurikene N-糖纯化可在 2 天内完成。通过遵循此程序，可以使用高阶统计技术对准确的蛋白质 N-糖定量和糖基化位点占有率进行整合和建模。该技术能够快速读回癌症生物学所说的复杂语言，定量比较蛋白质治疗学的差异，并真正揭示糖基化在生物学环境中的重要性。