一种定量糖组学与蛋白质组学结合的纯化策略

本单滤膜法工作流程的总体目标是从生物样本中简便、定量地连续纯化N-糖链和蛋白质，用于质谱分析。该方法具有可扩展性、快速性以及良好的分析重现性，对生物质谱实验室而言，在资源和技能要求方面均易于实现。该技术的主要优势在于，能够在大规模高通量生物研究中，同时开展糖组学、糖基化位点占据率以及蛋白质组学相关问题的研究。

我们通过将该方法与专为质谱设计的衍生化策略相结合，克服了N-糖链检测中的各项挑战，实现了癌症状态与对照状态之间准确的相对定量。由于分析变异性降低，有望揭示糖组与蛋白质组之间新的生物学相互作用，从而深入理解疾病状态，并为生物标志物的发现提供新的机遇。首先，将2.5 µL血浆上样至滤膜上。

然后，向滤器中的每个样品加入 2 µL 的 1 M 二硫苏糖醇溶液。用 200 µL 的 100 mM 碳酸氢铵 PNG 酶消化缓冲液稀释样品。盖紧滤器样品管，轻轻涡旋振荡，注意不要使滤器脱离其位置。

将样品在56摄氏度孵育30分钟，以使蛋白质和糖蛋白变性。为烷基化样品，加入50微升1M碘乙酰胺，使终浓度约为200 mM。然后在37摄氏度孵育60分钟。

将变性后的糖蛋白通过离心浓缩至滤膜上，离心条件为14,000 × g，40分钟，随后弃去滤过液。用100 µL PNGase消化缓冲液洗涤样品。将糖蛋白在滤膜上浓缩，并弃去滤过液。

重复洗涤和浓缩步骤两次，共进行三次，最终在滤膜残留体积中获得浓缩样品。洗涤完成后，弃去所有流出液和收集小瓶。然后，将滤膜转移至新的收集小瓶后，加入 2 µL 无甘油的肽-N-糖苷酶 F（peptide N-glycosidase F）或 PNGase F。

加入98微升PNGase消化缓冲液，使总体积达到100微升，并轻轻吹打滤膜上的溶液以混匀。在消化程序的加标步骤中，将样品于50摄氏度孵育2小时。迅速取出样品，并加入额外的2微升无甘油PNGase F。轻轻涡旋震荡样品1至2秒以混匀。

将样品在 50 摄氏度下继续孵育 2 小时。在 20 摄氏度下通过离心洗脱糖链后，向滤膜中加入 100 微升 PNGase 消化缓冲液，并再次离心。收集含有任何残留 N-连接糖链的洗涤液，与洗脱液一同收集至同一收集管中。

重复两次后，移除滤膜并将其放入新的收集管中，用于蛋白质组学样品制备。接下来，将糖链样品置于80摄氏度的冷冻机中孵育30至60分钟，直至完全冻结。然后，在室温下使用真空浓缩仪干燥4至6小时，直至完全干燥。

用400微升8M尿素缓冲液冲洗含有去氨基化肽段的滤膜。盖紧收集管，轻轻涡旋混匀。在弃去全部滤过液之前，先将肽段在滤膜上浓缩。

再重复尿素缓冲液洗涤两次后，用胰蛋白酶消化缓冲液冲洗含有脱氨肽段的滤膜。盖紧收集管，轻轻涡旋混匀，然后如前所述再次在滤膜上进行浓缩。弃去全部滤过液，并重复此步骤2次，共完成3次胰蛋白酶消化缓冲液洗涤。

将所有后续洗脱液和洗涤液收集到一个新的收集管中。然后，按照胰蛋白酶与蛋白质比例为1:50（用于发现性蛋白质组学）或1:5（用于定量蛋白质组学实验）的比例，加入50微升猪源修饰胰蛋白酶。盖紧收集管，轻轻涡旋混匀。

将样品在 37 摄氏度孵育 2 小时后，迅速取出样品，并按照适当的胰蛋白酶与蛋白质比例加入额外的 50 微升胰蛋白酶。轻轻涡旋样品 1 至 2 秒以混匀。然后在 50 摄氏度继续孵育 2 小时。

按照之前的方法离心20分钟洗脱肽段后，用淬灭缓冲液冲洗滤膜上残留的肽段。再按照之前的方法离心15分钟，将肽段从滤膜上洗脱下来。在测定样品中的肽段浓度后，将肽段样品置于80摄氏度的冷冻箱中孵育至完全冻结。

然后，在真空浓缩仪中于室温下干燥4至6小时，直至完全干燥。随后将胰蛋白酶消化后的蛋白质溶于液相色谱-质谱联用（LCMS）分析所用的流动相A中，调整至所需浓度。由2.5微升血浆获得的胰蛋白酶肽段浓度范围为每微升100至300纳克。

在进行糖链分析之前，将冻干的稳定同位素标记的4-苯乙基苯甲酰肼试剂以及天然P2GPN试剂分别用1毫升衍生化溶液重悬，使其终浓度为0.25毫克/毫升。试剂完全溶解可能需要长达10分钟，需充分涡旋振荡以确保完全溶解。

用200微升稳定同位素标记或未标记的P2GPN试剂标记干燥的N-聚糖。反复吹打以重新悬浮干燥的聚糖。然后涡旋混匀样品，并在台式离心机上离心约5秒，使液体沉降至管底。

在56摄氏度下将糖类与试剂反应3小时。立即将糖类从培养箱转移至真空浓缩仪，并在55摄氏度下干燥3至5小时至完全干燥。在进行液相色谱和质谱分析前，立即将标记的N-糖链重新悬浮于25至50微升水中。

用移液器反复吹打，确保N-糖链完全溶解。将样品同前离心5分钟，弃上清，注意移液器枪头勿接触离心管底部。将一对天然样品与稳定同位素标记样品按1:1比例混合，用于相对定量串联分析。

为蛋白质组学和糖组学工作流程分别准备两种不同的液相色谱-质谱（LCMS）方法。进行蛋白质分析时，将约400纳克蛋白质在NPA中上样至色谱柱。以每分钟300纳升的流速运行样品，预柱平衡体积为1微升，分析柱平衡体积为5微升。

在文本方案提供的质谱条件下使蛋白质离子化。进行糖链分析时，将5微升重悬的P2GPN标记的天然样品和稳定同位素标记的等摩尔样品注入色谱柱。以300纳升/分钟流速运行样品，预柱平衡体积为2微升，分析柱平衡体积为5微升。

然后，在文本方案提供的质谱条件下对糖链进行电离。基于滤膜的纯化方案与标准固相萃取方法进行了比较，两种方案检测到的血浆糖链丰度无显著差异。在两种方法中，接近检测限的糖链均表现出较高的变异性。

通过基于滤膜或标准固相萃取方法纯化的血浆中，equiM混合物的批间变异性被评估。两种方法均呈现正态分布，其均值与零相比无显著差异。80%的糖链变化在两倍范围内。

新式与传统纯化方案中检测到的糖类分子量分布无显著差异，且覆盖相同的范围。定性分析显示，糖类之间无偏倚现象。血浆蛋白采用标准的滤膜辅助样品制备法及多种在线联用方案进行制备。

不同方案鉴定出的蛋白质数量相似。在微波消解和尖峰未消解方案中，非特异性脱酰胺被控制在10%以下。在进行该操作时，需注意准确的糖基化位点占据率依赖于尽量减少热暴露和时间暴露。

一旦掌握，该内联Pecurikene N-聚糖纯化方法可在2天内完成。通过遵循本实验流程，可结合高阶统计技术对蛋白质N-聚糖的定量结果及糖基化位点占有率进行整合与建模分析。该技术能够快速解读癌症生物学所呈现的复杂信息，定量比较蛋白质治疗药物之间的差异，并真正揭示糖基化在生物学背景中的重要意义。