Name: Un quantitativo Glycomics e proteomica combinata strategia Purificazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Scopri un protocollo ad alto rendimento per la purificazione simultanea di N-glicani e proteine dal plasma mediante LC-MS/MS. Questo metodo migliora la quantificazione accurata e supporta la ricerca su biomarcatori.

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Questa ricerca è stata generosamente finanziata dal NIH NCI IMAT Program Grant R33 (CA147988-02), dal NIH NIGMS Graduate Training in Molecular Biotechnology presso NC State Grant (T32GM008776), dal Dipartimento dell'Istruzione degli Stati Uniti GAANN Fellowship Program in Molecular Biotechnology presso NC State Grant (P200A140020), dalla W.M. Keck Foundation e dalla North Carolina State University. Il plasma di gallina è stato ottenuto con l'assistenza del Dr. James N. Petitte e Rebecca Wysocky del Dipartimento di Scienze avicole della NC State University.

<ol><li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).</li>
<li>Preston, R. J. S., Rawley, O., Gleeson, E. M., O'Donnell, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+role+of+carbohydrate+determinants+in+regulating+hemostasis%3A+insights+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Elucidating the role of carbohydrate determinants in regulating hemostasis: insights and opportunities.</a> Blood. 121, 3801-3810 (2013).</li>
<li>Hasnain, S. Z., Gallagher, A. L., Grencis, R. K., Thornton, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+role+for+mucins+in+immunity%3A+Insights+from+gastrointestinal+nematode+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A new role for mucins in immunity: Insights from gastrointestinal nematode infection.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 45, 364-374 (2013).</li>
<li>Roseman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reflections+on+glycobiology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Reflections on glycobiology.</a> J. Biol. Chem. 276, 41527-41542 (2001).</li>
<li>Laine, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+calculation+of+all+possible+oligosaccharide+isomers+both+branched+and+linear+yields+1.05+x+10%2812%29+structures+for+a+reducing+hexasaccharide%3A+The+isomer+barrier+to+development+of+single-method+saccharide+sequencing+or+synthesis+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">A calculation of all possible oligosaccharide isomers both branched and linear yields 1.05 x 10(12) structures for a reducing hexasaccharide: The isomer barrier to development of single-method saccharide sequencing or synthesis systems.</a> Glycobiology. 4, 759-767 (1994).</li>
<li>Zaia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+and+glycomics%5BTitle%5D)+AND+%22Omics%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry and glycomics.</a> Omics. 14, 401-418 (2010).</li>
<li>Hirabayashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lectin-based+structural+glycomics%3A+Glycoproteomics+and+glycan+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+J%22%5BJournal%5D)">Lectin-based structural glycomics: Glycoproteomics and glycan profiling.</a> Glycoconjugate J. 21, 35-40 (2004).</li>
<li>Nilsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+glycopeptides+for+glycan+structure+and+attachment+site+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Enrichment of glycopeptides for glycan structure and attachment site identification.</a> Nat. Methods. 6, 809-811 (2009).</li>
<li>Redmond, J. W., Packer, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+solid-phase+extraction+with+graphitised+carbon+for+the+fractionation+and+purification+of+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohyd.+Res%22%5BJournal%5D)">The use of solid-phase extraction with graphitised carbon for the fractionation and purification of sugars.</a> Carbohyd. Res. 319, 74-79 (1999).</li>
<li>Ruhaak, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+chromatography-based+high-throughput+sample+preparation+method+for+N-glycan+analysis+from+total+human+plasma+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction chromatography-based high-throughput sample preparation method for N-glycan analysis from total human plasma glycoproteins.</a> Anal. Chem. 80, 6119-6126 (2008).</li>
<li>Kim, Y. -G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+high-throughput+analysis+of+N-glycans+from+ovarian+cancer+serum+using+a+96-well+plate+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rapid and high-throughput analysis of N-glycans from ovarian cancer serum using a 96-well plate platform.</a> Anal. Biochem. 391, 151-153 (2009).</li>
<li>Zielinska, D. F., Gnad, F., Wiśniewski, J. R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+mapping+of+an+in+vivo+N-glycoproteome+reveals+rigid+topological+and+sequence+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Precision mapping of an in vivo N-glycoproteome reveals rigid topological and sequence constraints.</a> Cell. 141, 897-907 (2010).</li>
<li>Abdul Rahman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filter-aided+N-glycan+separation+%28FANGS%29%3A+a+convenient+sample+preparation+method+for+mass+spectrometric+N-glycan+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Filter-aided N-glycan separation (FANGS): a convenient sample preparation method for mass spectrometric N-glycan profiling.</a> J. Proteome Res. 13, 1167-1176 (2014).</li>
<li>Walker, S. H., Carlisle, B. C., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+reverse+phase+and+hydrophilic+interaction+liquid+chromatography+platforms+for+the+analysis+of+N-linked+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of reverse phase and hydrophilic interaction liquid chromatography platforms for the analysis of N-linked glycans.</a> Anal. Chem. 84, 8198-8206 (2012).</li>
<li>Walker, S. H., Taylor, A. D., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individuality+normalization+when+labeling+with+isotopic+glycan+hydrazide+tags+%28INLIGHT%29%3A+A+novel+glycan-relative+quantification+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectr%22%5BJournal%5D)">Individuality normalization when labeling with isotopic glycan hydrazide tags (INLIGHT): A novel glycan-relative quantification strategy.</a> J. Am. Soc. Mass Spectr. 24, 1376-1384 (2013).</li>
<li>Walker, S. H., Lilley, L. M., Enamorado, M. F., Comins, D. L., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+derivatization+of+N-linked+glycans+for+increased+ion+abundance+in+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass.+Spectr%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic derivatization of N-linked glycans for increased ion abundance in electrospray ionization mass spectrometry.</a> J. Am. Soc. Mass. Spectr. 22, 1309-1317 (2011).</li>
<li>Baldwin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permethylation+and+tandem+mass+spectrometry+of+oligosaccharides+having+free+hexosamine%3A+Analysis+of+the+glycoinositol+phospholipid+anchor+glycan+from+the+scrapie+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Permethylation and tandem mass spectrometry of oligosaccharides having free hexosamine: Analysis of the glycoinositol phospholipid anchor glycan from the scrapie prion protein.</a> Anal. Biochem. 191, 174-182 (1990).</li>
<li>Harvey, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivatization+of+carbohydrates+for+analysis+by+chromatography%3B+electrophoresis+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B%22%5BJournal%5D)">Derivatization of carbohydrates for analysis by chromatography; electrophoresis and mass spectrometry.</a> J. Chromatogr. B. 879, 1196-1225 (2011).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitive+screening+design+optimization+of+mass+spectrometry+parameters+for+sensitive+comparison+of+filter+and+solid+phase+extraction+purified%2C+inlight+plasma+N-glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Definitive screening design optimization of mass spectrometry parameters for sensitive comparison of filter and solid phase extraction purified, inlight plasma N-glycans.</a> Anal. Chem. 87, 7305-7312 (2015).</li>
<li>Nepomuceno, A. I., Gibson, R. J., Randall, S. M., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+identification+of+deamidated+peptides+in+global+proteomics+using+a+quadrupole+orbitrap+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Accurate identification of deamidated peptides in global proteomics using a quadrupole orbitrap mass spectrometer.</a> J. Proteome Res. 13, 777-785 (2013).</li>
<li>Yen, T. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+challenges+and+opening+new+opportunities+in+glycoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Overcoming challenges and opening new opportunities in glycoproteomics.</a> Biomolecules. 3, 270-286 (2013).</li>
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<li>Gonzalez-Galarza, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+appraisal+of+techniques%2C+software+packages%2C+and+standards+for+quantitative+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Omics%22%5BJournal%5D)">A critical appraisal of techniques, software packages, and standards for quantitative proteomic analysis.</a> Omics. 16, 431-442 (2012).</li>
<li>Spivak, M., Weston, J., Bottou, L., Käll, L., Noble, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+to+the+Percolator+Algorithm+for+Peptide+Identification+from+Shotgun+Proteomics+Data+Sets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Improvements to the Percolator Algorithm for Peptide Identification from Shotgun Proteomics Data Sets.</a> J Proteome Res. 8, 3737-3745 (2009).</li>
<li>Collier, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+stable-isotope+labeling+with+amino+acids+in+cell+culture+and+spectral+counting+for+relative+quantification+of+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Sp%22%5BJournal%5D)">Comparison of stable-isotope labeling with amino acids in cell culture and spectral counting for relative quantification of protein expression.</a> Rapid Commun Mass Sp. 25, 2524-2532 (2011).</li>
<li>Kronewitter, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+retrosynthetic+glycan+libraries+to+profile+and+classify+the+human+serum+N-linked+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The development of retrosynthetic glycan libraries to profile and classify the human serum N-linked glycome.</a> Proteomics. 9, 2986-2994 (2009).</li>
<li>Sheeley, D. M., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+carbohydrate+sequence%2C+linkage%2C+and+branching+in+a+quadrupole+ion+trap+mass+spectrometer%3A+Neutral+oligosaccharides+and+N-linked+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of carbohydrate sequence, linkage, and branching in a quadrupole ion trap mass spectrometer: Neutral oligosaccharides and N-linked glycans.</a> Anal. Chem. 70, 3053-3059 (1998).</li>
</ol>

Abbiamo un rapporto di collaborazione con Cambridge Isotope Laboratories (CIL) per diffondere il reagente e la tecnologia P2GPN alla più ampia comunità scientifica sotto forma di prodotto (GTK-1000). Tuttavia, non riceviamo alcun ricavo in base alla vendita di questo prodotto.

Sono necessari metodi quantitativi ad alto rendimento per facilitare l'analisi di routine dei glicani. Negli ultimi trent'anni, l'analisi della glicomica è stata limitata a un sottoinsieme di gruppi di ricerca, nonostante la sua importanza nelle malattie, nelle applicazioni cliniche e nei prodotti farmaceutici. Il metodo di purificazione e marcatura FANGS-P2GPN per glicomica e proteomica esegue la stessa analisi su una singola aliquota di campione, riducendo il costo delle forniture e la quantità di materiale necessario (particolarmente importante negli studi sull'uomo e sui topi). Inoltre, gli sforzi per ridurre al minimo la variabilità nelle preparazioni sono di fondamentale importanza, poiché ogni passaggio aggiuntivo contribuisce all'errore, mascherando potenzialmente cambiamenti importanti ma poco abbondanti negli studi caso-controllo. L'accoppiamento di FANGS alla marcatura idrofobica dell'idrazide consente di eseguire campioni di proteine e glicani sulla stessa colonna RPLC, migliora la ionizzazione dei glicani, fornisce una quantificazione relativa e può essere applicato quantitativamente al plasma.
Per l'analisi degli N-glicani, è fondamentale utilizzare il livello suggerito di PNGasi F per ottenere la completa deglicosilazione. Sebbene i glicani siano esposti ai solventi, la denaturazione delle proteine e l'eccesso di enzimi aiutano a garantire una scissione efficiente e completa. Per una quantificazione accurata dei glicani, è necessario assicurarsi che siano completamente essiccati dopo la derivatizzazione per estinguere la reazione e prevenire reazioni crociate quando si mescolano le specie NAT e SIL. Infine, quando si estende il flusso di lavoro all'analisi dei glicositi, la tempistica dei passaggi è fondamentale per ridurre al minimo la deamidazione non specifica. I protocolli modificati previsti per l'analisi combinata di glicomica e proteomica funzionano in modo coerente se eseguiti di conseguenza.
Il flusso di lavoro consente di ottenere un'accurata quantificazione relativa degli N-glicani dal plasma rispetto al metodo SPE gold standard. Non vi è alcuna distorsione apparente nei tipi di glicani estratti in termini di peso molecolare, idrofilia e struttura composizionale. Sebbene non abbiamo esplorato l'analisi qualitativa dei glicani legati all'O, ci aspettiamo che le FANGS possano accogliere l'aggiunta di una fase di eliminazione β dopo la digestione della PNGasi F dei glicani legati all'N. Tuttavia, le procedure richiederebbero modifiche significative per la pulizia dei reagenti prima della spettrometria di massa e l'analisi dei peptidi ne risentirà in modo significativo. Per la proteomica, si ottiene la stessa profondità di copertura del proteoma rispetto ai metodi FASP tradizionali. È importante sottolineare che i metodi raggiungono un tasso minimo di false scoperte per la deamidazione di N-glicano. Sebbene il metodo sia compatibile con la marcatura con 18O di Asn durante la fase di digestione PNGasi22,23, il basso tasso di falsa scoperta del sito di glicosilazione suggerisce che potrebbe non essere necessario, riducendo ulteriormente i costi e la complessità.
Il proteoma non è arricchito per le glicoproteine in questo metodo, il che presenta sia vantaggi che svantaggi. Alcune glicoproteine a basso contenuto di abbondanza possono non essere rilevate nell'analisi. Tuttavia, l'occupazione di siti glicosilati per proteina può essere confrontata tra campioni biologici. Inoltre, vengono eliminati l'errore e la distorsione introdotti dalla purificazione dell'affinità delle lectine o dall'arricchimento chimico. In conclusione, l'accoppiamento di FANGS alla normalizzazione dell'individualità durante la marcatura con la strategia dei tag con glicano idrazide si traduce in un metodo semplificato, quantitativo e ad alto rendimento per l'analisi tandem del glicoma e del proteoma con un grande potenziale per l'applicazione in studi clinici caso-controllo.

Nel campo della proteomica, filtro aided preparazione del campione (FASP) è stato ampiamente adottato per la sua capacità di ridurre la quantità di materiale di partenza, ridurre artefatti preparazione del campione, e massimizzare la produttività del campione 1. Tuttavia, un tale metodo è ancora emergere e guadagnare trazione per il campo di glycomics. Lo sviluppo di high-throughput, flussi di lavoro quantitativi sono necessari a causa del ruolo fondamentale di glicosilazione in difesa biologica e la sua modulazione da cancro o malattie 2,3. Nei mammiferi, N -glycans sono composti di ripetere unità saccaridiche (esosi (Hex), esosamine (HexNac), acidi sialico (NeuAc), e fucoses (FUC)), che decorano una struttura di base (hex 3 HexNac 2) 4 a legame covalente a asparagina. Sebbene il glycospace è considerevolmente grande quando isomeri sono contati (&gt; 10 12), è piuttosto modesto in termini di composizione e peso molecolare tipicamente variano da 1,000-8,000 Da 5 &lt;/ Sup&gt;. L&#39;omogeneità compositiva della classe e l&#39;idrofilia dei glicani pongono sfide uniche per la purificazione, la separazione, e spettrometria di massa (MS) dei flussi di lavoro 6. Tradizionalmente, N -glycans vengono digeriti da proteine ​​o peptidi da peptide- N -glycosidase F (PNGase F) e poi arricchite da lectina cromatografia di affinità 7, catturati da perline idrazide 8, o purificati mediante estrazione in fase solida (SPE) 9,10. Mentre questi metodi sono tutti altamente efficaci, introducono passaggi aggiuntivi per dissalazione e limitare il numero di campioni trattati simultaneamente. Negli ultimi dieci anni, sono stati proposti una serie di piattaforme high-throughput per glycomics. Kim et al. Pubblicato un metodo semi-automatico utilizzando una piastra SPE 96 pozzetti a depressione 11. In alternativa, un metodo di affinità-filtro (N--glyco FASP) è stato sviluppato dal gruppo di Mann, che ha richiesto la derivatizzazione iniziale del filtro con un composito di lectine 12. Infine, il gruppo di Thomas-Oates ha proposto un metodo semi-quantitativo, il filtro Aided N -Glycan di separazione (ZANNE), che ha sfruttato la dimensione composizione ristretta del glycospace 13. Basandosi su filtri cut-off peso molecolare, piccoli contaminanti sono stati lavati per i rifiuti e poi i -glycans N sono stati digeriti e eluiti. proteine ​​deglicosilata rimangono sul filtro in questo protocollo e possono essere sottoposti a FASP in linea. L&#39;identificazione e la quantificazione dei glicani per ionizzazione elettrospray (ESI) MS richiede separazioni off-line per la risoluzione (parziale) di isomeri e derivatizzazione per il rilevamento di specie a basso abbondanti. Etichettatura nella individualità, quando la normalizzazione con la strategia glycan tag idrazide conferisce compatibilità con cromatografia liquida in fase inversa (RPLC) 14,15. Il 4-fenetil-benzohydrazide (P2PGN) tag idrofobo media la idrofilia dei glicani, ENHarbitrare la ionizzazione da, in media, quattro volte 16. Anche altre tecniche, come permethylation 17 o ammina reattiva chimiche codifica 18, offrono vantaggi simili, nella reazione idrazide, glicani vengono fatti reagire 1: 1 stechiometricamente in condizioni facili. Quantificazione relativa è ottenuta mediante l&#39;analisi di campioni tandem derivatizzati con nativo (NAT) o 13 C 6 etichette stabile isotopi (SIL). Il seguente metodo si evolve ZANNE per le applicazioni di plasma e le coppie con la variabile idrofobico P2GPN per un&#39;accurata quantificazione relativa. Inoltre, è stato progettato per eseguire proteomica tiro-gun, deamidation profilatura e glycomics quantitativi una singola aliquota di campione, senza compromettere l&#39;integrità delle analisi.

<table><tbody><tr><td>Acido acetico (50%)</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>45754</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile, grado HPLC</td><td>Burdick & Jackson</td><td>AH015-4</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di ammonio</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Reagente Bradford</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6916</td><td>Alternativa: Kit acido bicinconinnico (Sigma Aldrich BCA1)</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>Centrifuga C1016</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf</td><td></td><td>5804 R</td><td>Le centrifughe alternative che raggiungono i 14.000 x g sono adatte</td></tr><tr><td>DL-Ditiotreitolo, 1&nbsp; M in soluzione</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>646563</tr><tr><td>Easy-nLC 1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>LC120</td><td>Alternate nano o ultra high pressure LC produrranno dati simili, come ad esempio: 1. Dionex UltiMate 3000 LC (Thermo Scientific); 2. Acquity UPLC (Acque).</td></tr><tr><td>Portaprovette galleggiante</td><td>TedPella</td><td>20831-20</td><td></td></tr><tr><td>Fetuin</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>P6042S</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Isotemp Standard Forni da laboratorio</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-625F</td><td>Incubatori alternativi che raggiungono i 56&nbsp; &deg; C sono adatti</td></tr><tr><td>Acido Formico</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>56302</td><td></td></tr><tr><td>GE Forno a microonde General</td><td>Electric</td><td>57B5 E82904</td><td>Qualsiasi forno a microonde con impostazioni di potenza regolabili è adatto</td></tr><tr><td>INLIGHT Glycan Tagging Kit&nbsp;</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>GTK-1000</td><td>Il kit INLIGHT fornisce le versioni NAT e SIL del reagente P2GPN.</td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3221</td><td></td></tr><tr><td>Kinetix 2.6 mM, 100 &Aring;, C18 fase stazionaria di massa</td><td>Phenomenex&nbsp;</td><td>Alternativa ai supporti sfusi</td><td>: Qualsiasi C18 fase stazionaria 5&nbsp; </td></tr><tr><td>mM Mascot Daemon Software e Server</td><td>Matrix Science</td><td></td><td>Alternativa: Proteome Discoverer Software (Thermo Scientific)</td></tr><tr><td>Metanolo, grado HPLC</td><td>Burdick & Jackson</td><td>AH230-4</td><td></td></tr><tr><td>PicoFrit Colonna autoimballante: 360&nbsp; &#956; m, OD 75&nbsp; &#956; m ID, 15&nbsp; &#956; punta m, non rivestita, 5 per scatola, 50 cm</td><td>Nuovo obiettivo</td><td>1 5 PF360-75-15-N-5</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F (senza glicerolo), 75.000&nbsp; unità/ml</td><td>New England BioLabs</td><td>P0705L</td><td></td></tr><tr><td>Q Spettrometro di massa ibrido HF exattivo quadrupolo-orbitrap</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Precisione di massa alternata (5&nbsp; ppm) forniranno dati simili</td></tr><tr><td>RNasi B</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>P7817S</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina dal pancreas suino</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>T6567-5X</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>51456</td><td></td></tr><tr><td>Concentratore a vuotoSavant SPD131DDA Concentratore SpeedVac</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD131DDA</td><td>I concentratori a vuoto alternativi sono adatti</td></tr><tr><td>Filtri Vivacon 500 30 kDa&nbsp;</td><td>Sartorius Stedim Biotech</td><td>VN01H22</td><td>alternativa: unità filtranti centrifughe Amicon Ultra 0.5 con Ultracel-10&nbsp; Membrana kDa (Millipore UFC501096)</td></tr><tr><td>Acqua, grado HPLC</td><td>Burdick & Jackson</td><td>AH365-4</td><td></td></tr><tr><td>Acqua, 18O</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>OLM-240-97-1</td><td>L'aggiunta di 18O nella fase di digestione PNGase F è facoltativa e potrebbe non essere necessaria per gli studi di deamidazione completati con un'affidabilità del 95%</td></tr><tr><td>Xcalibur 2.0</td><td>Thermo Scientific</td><td>XCALIBUR20</td><td></td></tr><tr><td>Zwittergent Test Kit</td><td>Merck Millipore</td><td>693030</td><td></td></tr></tbody></table>

un quantitativo glycomics e proteomica combinata strategia purificazione

A Quantitative Glycomics and Proteomics Combined Purification Strategy

C'è un crescente desiderio nelle scienze biologiche e cliniche di integrare e correlare più classi di biomolecole per svelare la biologia, definire percorsi, migliorare il trattamento, comprendere la malattia e aiutare la scoperta di biomarcatori. La glicosilazione legata all'N è una delle più importanti e robuste modificazioni post-traduzionali delle proteine e regola le funzioni cellulari critiche come la segnalazione, l'adesione e la funzione enzimatica. Le tecniche analitiche per purificare e analizzare gli N-glicani sono rimaste relativamente statiche nell'ultimo decennio. Sebbene accurati ed efficaci, richiedono comunemente competenze e risorse significative. Sebbene siano stati sviluppati alcuni schemi di purificazione ad alto rendimento, devono ancora trovare un'adozione diffusa e spesso si basano sull'arricchimento di glicopeptidi. Un metodo promettente, sviluppato da Thomas-Oates et al., la separazione N-glicano assistita da filtro (FANGS), è stato dimostrato qualitativamente sui tessuti. In questo caso, abbiamo adattato FANGS al plasma e lo abbiamo accoppiato alla normalizzazione dell'individualità durante la marcatura con la strategia dei tag di glicano idrazide al fine di ottenere un'accurata quantificazione relativa mediante cromatografia liquida, spettrometria di massa e ionizzazione elettrospray migliorata. Inoltre, abbiamo progettato nuove funzionalità per il protocollo ottenendo tandem, proteomica shotgun e analisi del sito di glicosilazione su plasma di gallina. Abbiamo dimostrato che gli N-glicani purificati sul filtro e derivatizzati dai tag idrazide idrofobici erano paragonabili in termini di abbondanza e classe a quelli per estrazione in fase solida (SPE); Quest'ultimo è considerato un gold standard nel campo. È importante sottolineare che la variabilità nei due protocolli non era statisticamente diversa. I dati proteomici raccolti in linea con i dati glicomici avevano la stessa profondità rispetto a un digestato standard di tripsina. La deamidazione peptidica è minimizzata nel protocollo, limitando la deammidazione non specifica rilevata nei motivi di glicosilazione. Ciò ha consentito l'analisi diretta del sito di glicosilazione, sebbene il protocollo possa ospitare anche la marcatura del sito a 18O. Nel complesso, abbiamo dimostrato un nuovo protocollo in linea ad alto rendimento, imparziale, basato su filtri per l'analisi quantitativa della glicomica e della proteomica.

<img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig1.jpg" /> Figura 1:. È dato Lo schema del metodo ZANNE-P2GPN codifica idrofobica accoppiato (Metodo A) per combinate proteomica e glycomics analisi passaggi che differiscono tra di lavorazione e tandem glycomics glicomica-only e di analisi proteomica, con l&#39;individuazione dei siti di glicosilazione, sono evidenziati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig1large.jpg" target="_blank">clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> L&#39;in-linea proteomica e glycomics, filtro a base di P2GPN metodo di codifica idrofobica (Metodo A) è stato convalidato per l&#39;identificazione, quantificazione e pregiudizi peso molecolare utilizzando campioni di plasma pool gallina (Figura 1). Per esclusivamente esperimenti glicomica, inter-comparazioni nelle abbondanze di N -glycans estratti con il metodoA Carbograph SPE (gold standard, Metodo B) sono state effettuate (Figura 2). Non ci sono state differenze significative nei abbondanze dei glicani tra i due metodi. La variabilità intra-è stata valutata anche attraverso la quantificazione della SIL: NAT rapporto tra glicani estratte con lo stesso metodo. I log 2 -distributions di entrambi i metodi erano Gaussiana, centrata sullo zero, e non significativamente diverso (Figura 3A-B). Il peso molecolare compreso tra i due protocolli completamente sovrapposti, suggerendo che il filtro non discrimina N -glycans riferiscono al range di peso molecolare e idrofilicità (Figura 4). <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig2.jpg" /> Figura 2: una miscela equimolare di NAT e SIL N -glycans estratto secondo il metodo A o il metodo B è stata preparata da 2,5 ml di plasma gallina (n = 4) I campioni sono stati anale.yzed da UPLC-MS secondo i parametri raccomandati suggeriti nella sezione 6. Le abbondanze per ogni glicani, in ogni canale NAT / SIL, sono stati calcolati integrando l&#39;area sotto il cromatogramma ionico estratto (MMA = 3 ppm), la correzione per il molecolare sovrapposizione peso e regolazione dal TGNF. Questi rapporti sono indicati con i loro errori standard. Le abbondanze di Metodo B: Metodo A N -glycans non erano significativamente differenti (p&gt; 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig3.jpg" /> Figura 3: Il intra-variabilità nella (A) Metodo A (N = 133) o (B) Metodo B (N = 123) è stata confrontata strategie. NAT e SIL miscele equimolari di N -glycans, dello stesso schema di estrazione, Sono stati analizzati più di tre repliche tecniche. I log 2 -distributions sono stati centrati sullo zero e non erano significativamente differenti tra i due flussi di lavoro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig4.jpg" /> Figura 4: Gli intervalli di peso molecolare di glicani da ogni strategia stati confrontati. I due flussi di lavoro ha prodotto glicani che attraversa lo stesso intervallo di peso molecolare. N -glycans rilevato in un protocollo contro l&#39;altro è caduto appena sopra il limite di rilevazione (1 × 10 5 abbondanza) e non riflettono distorsione sistematica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per visualizzare un più grande versione di questa figura.</a> <p class="jove_content" fo:keep-together.all&#39;interno-page = &quot;1&quot;&gt; Mantenimento delle proteine ​​deglicosilate dal filtro peso molecolare abilitati in linea proteoma ampia analisi e sito di glicosilazione identificazione. Protocolli multipli per la purificazione combinato di glicani e proteine ​​sono stati confrontati con una preparazione FASP tradizionale senza deglycosylation (Tabella 5). Il nostro tipico filtro 18 ore basato PNGase F digestione, seguito da FASP tripsina digest (protocollo Std) ha portato a livelli significativi di deamidation non specifici, che possono interferire con l&#39;identificazione di glycosites. Pertanto, un metodo che utilizza un tempo di incubazione più breve ad elevata temperatura (50 ° C) ed una fase picco-in PNGase F (SPI protocollo) è stato esplorato in alternativa, con un protocollo di digestione a microonde (protocollo MD), per ridurre al minimo non deamidation specifica. I glicani osservati nei nuovi metodi di digestione non erano significativamente differenti in composizioni o abbondanze dallo standard 18 ore, 37 ° C filtro PNGase F digest ( <strong&gt; Figura 5). In combinazione con una breve incubazione tripsina, deamidation non specifica è risultata significativamente ridotta, con un tasso di falsi positivi per glycosites &lt;5% (Tabella 5). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"></td><td colspan="4"> proteine </td><td></td><td colspan="4"> peptidi </td><td></td><td colspan="4"> Peptidi Deamidated </td><td></td><td colspan="4"> Glycosites </td><td></td><td colspan="4"> glicoproteine </td></tr><tr><td colspan="2"></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td><td></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td><td></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td><td></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td><td></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td></tr><tr><td colspan="2"> FASP </td><td colspan="2"></td><td colspan=&quot;2&quot;&gt; 249 </td><td></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"> 3083 </td><td></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"> 795 </td><td></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"> 5 </td><td></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"> 5 </td></tr><tr><td colspan="2"> 18hr </td><td colspan="2"> 217 </td><td colspan="2"> 304 </td><td></td><td colspan="2"> 6013 </td><td colspan="2"> 5086 </td><td></td><td colspan="2"> 1029 </td><td colspan="2"> 733 </td><td></td><td colspan="2"> 257 </td><td colspan="2"> 24 </td><td></td><td colspan="2"> 112 </td><td colspan="2"> 18 </td></tr><tr><td colspan="2"> MD </td><td colspan="2"> 270 </td><td colspan="2"> 266 </td><td></td><td colspan="2"> 5190 </td><td colspan="2"> 5125 </td><td></td><td colspan="2"> 465 </td><td colspan="2"> 455 </td><td></td><td colspan="2"> 254 </td><td colspan="2"> 8 </td><td></td><td colspan="2"> 102 </td><td colspan="2"> 7 </td></tr><tr><td colspan="2"> SPI </td><td colspan="2"> 281 </td><td colspan="2"> 288 </td><td></td><td colspan="2"> 4729 </td><td colspan="2"> 4482 </td><td></td><td colspan="2"> 602 </td><td colspan="2"> 573 </td><td></td><td colspan="2"> 232 </td><td colspan="2"> 10 </td><td></td><td colspan="2"> 145 </td><td colspan="2"> 8 </td></tr></tbody></table> . Tabella 5: confronto dei dati di proteomica da un tripsina standard di digerire rispetto al metodo di codifica in linea ZANNE-P2GPN sono stati fatti i preparativi sono stati eseguiti con (+) e senza (-) PNGase F per determinare i tassi di non-specifica deamidation e stima di fondo glycosite tassi di falsi positivi. Le proteine ​​sono state identificate con 1% false discovery rate (FDR); peptidi sono stati filtrati in base a &quot;alto&quot; fiducia peptide in Proteome Discoverer 1.4 (q &lt;0.01); glycosites sono stati identifiEd in base a sequenze uniche che contengono deamidation del motivo glicosilazione conservata (NXS / T); e glicoproteine ​​sono stati definiti come proteine ​​identificate contenenti almeno un glycosite identificato. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig5.jpg" /> Figura 5: accorciato protocolli per glicani sono stati sviluppati per ridurre al minimo deamination nei campioni e rispetto al 18hr ZANNE PNGase F digest. Le differenze medie di abbondanze erano il 10% e il 5% per il MD (2.2.3) e (2.2.2) protocolli SPI, rispettivamente. Dei 48 glicani individuati, il 90% appare meno variazione di 1,5 volte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig5large.jpg" target="_blank">Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

È stato sviluppato un protocollo ad alto rendimento per la purificazione combinata di proteomica e glicomica e la quantificazione LC-MS/MS nel plasma. L'analisi della deamidazione dei motivi di glicosilazione legati all'N era specifica per i siti deglicosilati. La quantificazione accurata degli N-glicani è stata ottenuta accoppiando la separazione degli N-glicani assistita dal filtro alla normalizzazione dell'individualità durante la marcatura con la strategia dei tag glicano idrazide.

Un quantitativo Glycomics e proteomica combinata strategia Purificazione

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define ...

L'obiettivo generale di questo flusso di lavoro basato su un singolo filtro è quello di purificare in modo semplice e quantitativo N-glicani e proteine in tandem da campioni biologici per l'analisi mediante spettrometria di massa. La scalabilità, la velocità e la riproducibilità analitica di questo metodo lo rendono direttamente accessibile, in termini di risorse e competenze, ai laboratori di spettrometria di massa biologica. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente ai ricercatori di indagare simultaneamente domande relative a glicomica, occupazione dei siti di glicosilazione e proteomica in studi biologici ad alta capacità e di grande portata.Abbiamo superato le sfide legate alle misurazioni dei glicani N accoppiando questo metodo a una strategia di derivatizzazione personalizzata per spettrometria di massa, ottenendo una quantificazione relativa accurata tra stati tumorali e controlli. Grazie alla ridotta variabilità analitica, potranno essere chiarite nuove interazioni biologiche tra glicoma e proteoma, fornendo informazioni fondamentali sugli stati patologici e nuove opportunità per la scoperta di biomarcatori. Per iniziare, caricare 2,5 microlitri di plasma su un filtro.Quindi, aggiungere 2 microlitri di soluzione di ditiotreitolo 1 M a ciascun campione nel filtro. Diluire il campione con 200 microlitri di tampone digestivo di bicarbonato di ammonio 100 mM per PNGasi. Chiudere il tubo del campione con il filtro e vortexare delicatamente, avendo cura di non spostare il filtro dalla sua sede.Incubare il campione a 56 gradi Celsius per 30 minuti per denaturare le proteine e le glicoproteine. Per alchilare i campioni, aggiungere 50 microlitri di Iodoacetamide 1 M per ottenere una concentrazione finale di circa 200 mM. Successivamente, incubare a 37 gradi Celsius per 60 minuti.Concentrare la glicoproteina denaturata sul filtro centrifugando i campioni a 14.000 x g per 40 minuti prima di scartare il flusso passante. Lavare il campione con 100 microlitri di tampone per la digestione con PNGasi. Concentrare la glicoproteina sul filtro e scartare il flusso passante.Ripetere due volte il passaggio di lavaggio e concentrazione, per un totale di tre ripetizioni, ottenendo un concentrato nel volume morto del filtro. Scartare tutto il flusso passante e il vial di raccolta al termine dei lavaggi. Successivamente, aggiungere 2 microlitri di peptidasi N-glicosidasi F priva di glicerolo o PNGase F al filtro dopo averlo trasferito in un nuovo vial di raccolta.Aggiungere 98 microlitri di tampone per la digestione PNGase portando il volume totale a 100 microlitri, quindi pipettare delicatamente su e giù sul filtro per omogeneizzare. Per il protocollo di digestione con aggiunta a picco, incubare i campioni a 50 gradi Celsius per 2 ore. Rimuovere rapidamente i campioni e aggiungere a picco ulteriori 2 microlitri di PNGase F priva di glicerolo. Vortexare leggermente i campioni per 1-2 secondi per favorire il mescolamento.Incubare i campioni a 50 gradi Celsius per ulteriori 2 ore. Dopo l'eluzione dei glicani mediante centrifugazione del campione a 20 gradi Celsius, aggiungere 100 microlitri di buffer per la digestione con PNGase sul filtro e centrifugare nuovamente. Raccogliere il lavaggio contenente eventuali glicani N-legati rimanenti nello stesso contenitore di raccolta utilizzato per l'eluente.Dopo aver ripetuto due volte, rimuovere il filtro e collocarlo in un nuovo vial di raccolta per la preparazione alla proteomica. Successivamente, incubare i campioni di glicani nel congelatore a 80 gradi Celsius per 30-60 minuti fino al congelamento completo. Quindi, asciugare completamente a temperatura ambiente in un concentratore sotto vuoto per 4-6 ore.Risciacquare il filtro contenente i peptidi deaminati con 400 microlitri di tampone urea 8 M. Chiudere la provetta di raccolta e vortexare delicatamente per mescolare. Concentrare i peptidi sul filtro prima di scartare tutto il flusso passante.Dopo aver ripetuto il lavaggio con tampone urea altre due volte, risciacquare il filtro contenente i peptidi deanimati con tampone digestivo per la tripsina. Chiudere la provetta di raccolta e vortexare delicatamente per favorire il mescolamento, quindi concentrare nuovamente sul filtro come in precedenza. Scartare tutto il flusso in eccesso e ripetere altre 2 volte, per un totale di 3 lavaggi con tampone digestivo per la tripsina.Raccogliere tutti gli eluenti e i lavaggi futuri in una nuova provetta di raccolta. Quindi, aggiungere 50 microlitri di tripsina modificata da suino in un rapporto tripsina-proteina di 1:50 per esperimenti di proteomica esplorativa o di un rapporto tripsina-proteina di 1:5 per esperimenti di proteomica quantitativa. Chiudere la provetta con il tappo e vortexare leggermente per mescolare.Dopo aver incubato i campioni a 37 gradi Celsius per 2 ore, procedere rapidamente a rimuovere i campioni e aggiungere 50 microlitri aggiuntivi di tripsina nel rapporto tripsina-proteina appropriato. Vortexare leggermente i campioni per 1-2 secondi per favorire il mescolamento. Successivamente, incubare a 50 gradi Celsius per ulteriori 2 ore.Dopo l'eluzione dei peptidi mediante centrifugazione come in precedenza per 20 minuti, risciacquare i peptidi rimanenti dal filtro con tampone di arresto. Eluire dal filtro mediante centrifugazione come in precedenza per 15 minuti. Dopo aver quantificato la concentrazione dei peptidi nei campioni, incubare i campioni di peptidi nel congelatore a 80 gradi Celsius fino a quando non saranno congelati.Quindi, asciugare completamente a temperatura ambiente in un concentratore sotto vuoto per 4-6 ore. Successivamente, risospendere le proteine trattate con tripsina appena prima dell'analisi mediante spettrometria di massa con cromatografia liquida (LCMS) nella fase mobile A alla concentrazione desiderata. Le concentrazioni dei peptidi triptici ottenuti da 2,5 microlitri di plasma variano da 100 a 300 nanogrammi per microlitro.Prima dell'analisi dei glicani, ricostituire i reagenti di 4-fenetil benzoidrazide marcati con isotopi stabili e i reagenti P2GPN nativi in un millilitro di soluzione di derivatizzazione per ottenere una concentrazione finale di 0,25 milligrammi per millilitro. I reagenti possono richiedere fino a 10 minuti per solubilizzarsi completamente. Eseguire un'energica vortexazione per garantire una completa solubilizzazione.Etichettare gli N-glicani essiccati con 200 microlitri di reagente P2GPN marcato con isotopi stabili o nativo. Pipettare su e gi&ugrave; per ri-sospendere gli glicani essiccati. Successivamente, vortexare i campioni e centrifugare per circa 5 secondi su una centrifuga da banco.Fare reagire i glicani con il reagente per 3 ore a 56 gradi Celsius. Trasferire immediatamente i glicani dall'incubatrice al concentratore sotto vuoto ed essiccare completamente a 55 gradi Celsius per 3-5 ore. Ri-sospendere il N-glicano marcato in 25-50 microlitri di acqua poco prima dell'analisi mediante cromatografia liquida e spettrometria di massa.Pipettare su e gi&ugrave; per assicurare che gli N-glicani siano completamente solubilizzati. Dopo aver centrifugato i campioni come in precedenza per 5 minuti, rimuovere il soprannatante, avendo cura di non far toccare la punta della pipetta al fondo del tubo da centrifuga. Combinare una coppia di campioni nativi e marcati con isotopi stabili in un rapporto 1:1 per l'analisi tandem di quantificazione relativa.Preparare 2 diversi metodi LCMS per i flussi di lavoro di proteomica e glicomica. Per l'analisi delle proteine, iniettare circa 400 nanogrammi di proteina sulla colonna in NPA. Eseguire il campione a 300 nanolitri al minuto, con un'equilibratura della colonna pre-colonna di 1 microlitro e un'equilibratura della colonna analitica di 5 microlitri.Ionizzare le proteine nelle condizioni di spettrometria di massa indicate nel protocollo. Per l'analisi dei glicani, iniettare 5 microlitri di campioni equi-M nativi e marcati con isotopi stabili di P2GPN risospesi sulla colonna. Eseguire il campione a 300 nanolitri al minuto con un'equilibratura pre-colonna di 2 microlitri e un'equilibratura della colonna analitica di 5 microlitri.Quindi, ionizzare i glicani nelle condizioni di spettrometria di massa indicate nel protocollo del testo. Il protocollo di purificazione basato su filtro è stato confrontato con il metodo standard di estrazione in fase solida e le abbondanze dei glicani plasmatici rilevati tra i due protocolli non sono risultate significativamente diverse. In entrambi i metodi, gli stessi glicani sono stati trovati vicino al limite di rilevazione, dove la variabilità aumenta.È stata valutata l'intervariabilità per miscele equiM di plasma purificato mediante il protocollo di estrazione in fase solida basato su filtro o quello standard. Entrambi i protocolli presentavano distribuzioni gaussiane le cui medie non differivano significativamente da zero. L'80 percento dei glicani rientrava in un intervallo di variazione entro il doppio.Le distribuzioni dei pesi molecolari dei glicani rilevati nei nuovi protocolli di purificazione e in quelli tradizionali non presentavano differenze significative e coprivano lo stesso intervallo. Qualitativamente, non è stato osservato alcun bias tra i glicani. Le proteine plasmatiche sono state preparate mediante il comune metodo di preparazione del campione assistito da filtro e con protocolli multipli in linea.Il numero di proteine identificate è stato simile per i vari protocolli. La dealchidazione non specifica è stata controllata nei protocolli di digestione a microonde e di aggiunta di peptidi non digeribili al di sotto del 10 percento. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare che un'accurata occupazione dei siti di glicosilazione dipende dalla minimizzazione dell'esposizione a calore e tempo.Una volta padroneggiata, la purificazione in linea dei N-glicani pecurikene può essere completata in 2 giorni. Seguendo questa procedura, è possibile integrare e modellare mediante tecniche statistiche di ordine superiore la quantificazione accurata dei N-glicani proteici e l'occupazione dei siti di glicosilazione. Questa tecnica consente di decifrare rapidamente il linguaggio complesso utilizzato dalla biologia del cancro, di confrontare quantitativamente le differenze nei farmaci proteici e di rivelare pienamente l'importanza della glicosilazione in un contesto biologico.

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Qui si descrive una nuova tecnica di proteomica quantitativa per identificare i complessi proteici in Saccharomyces cerevisiae. In questo studio, abbiamo utilizzato il metodo SILAC insieme purificazione di affinità seguita dalla spettrometria di massa tandem per identificare con elevata specificità dei partner legame di una proteina ER, Scs2p.

L&#39;identificazione di complessi proteici con la proteomica quantitativa in S. cerevisiae

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Estrazione basata sull'immunoaffinità di peptidi ubiquitinilati: una tecnica per estrarre selettivamente peptidi marcati con ubiquitina da frazioni peptidiche purificate

Proteine ​​di superficie cellulare sono biologicamente importante e ampiamente glicosilata. Vi presentiamo qui un approccio glicopeptide-capture per solubilizzare, arricchire, e deglycosylate queste proteine ​​per facili analisi proteomica basati LC-MS.

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Miglioramento in gel riduttive solfo-glycomics β-eliminazione completa per O-linked e di spettrometria di massa

Presentiamo un metodo per la purificazione, il rilevamento e l'identificazione di peptidi diGly che provengono da proteine ubiquitinate da campioni biologici complessi. Il metodo presentato è riproducibile, robusto e supera i metodi pubblicati rispetto al livello di profondità dell'analisi dell'ubiquitinome.

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