Un quantitativo Glycomics e proteomica combinata strategia Purificazione

L'obiettivo generale di questo flusso di lavoro basato su un singolo filtro è quello di purificare facilmente e quantitativamente N-glicani e proteine in tandem da campioni biologici provenienti da analisi di spettrometria di massa. La scalabilità, la velocità e la riproducibilità analitica di questo metodo lo rendono direttamente accessibile per quanto riguarda le risorse e le competenze dei laboratori di spettrometria di massa biologica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente ai ricercatori di studiare contemporaneamente le questioni di glicomiche, di occupazione del sito di glicosilazione e di proteomica in studi biologici ad alto rendimento su larga scala.

Abbiamo superato le sfide delle misure di N-glicani accoppiando questo metodo a una strategia di derivatizzazione su misura per la spettrometria di massa, che consente di ottenere una quantificazione accurata e relativa tra il cancro e gli stati di controllo. Con una ridotta variabilità analitica, nuove interazioni biologiche possono essere chiarite tra il glicoma e il proteoma, fornendo informazioni chiave sugli stati patologici e nuove opportunità per la scoperta di biomarcatori. Per iniziare, caricare 2,5 microlitri di plasma su un filtro.

Quindi, aggiungere 2 microlitri di soluzione di ditiotreitolo 1M a ciascun campione nel filtro. Diluire il campione con 200 microlitri di tampone digestativo PNGasi di bicarbonato di ammonio da 100 mM. Tappare il tubo del campione del filtro e fare un leggero vortice, facendo attenzione a non disturbare il filtro dalla sua sede.

Incubare il campione a 56 gradi Celsius per 30 minuti per denaturare le proteine e le glicoproteine. Per alchilare i campioni, aggiungere 50 microlitri di iodoacetammide 1M per ottenere una concentrazione finale di circa 200 mM. Quindi, incubare a 37 gradi Celsius per 60 minuti.

Concentrare la glicoproteina denaturata sul filtro centrifugando i campioni a 14.000 x g per 40 minuti prima di scartare il flusso. Lavare il campione con 100 microlitri di tampone digestivo PNGase. Concentrare la glicoproteina sul filtro ed eliminare il flusso.

Ripetere la fase di lavaggio e concentrazione due volte per un totale di tre volte, ottenendo un concentrato nel volume morto del filtro. Gettare tutto il flusso e la fiala di raccolta una volta completati i lavaggi. Quindi, aggiungere 2 microlitri di peptide N-glicosidasi F o PNGasi F senza glicerolo al filtro dopo averlo trasferito in una nuova fiala di raccolta.

Aggiungere 98 microlitri di tampone digestativo PNGase portando il volume totale a 100 microlitri e pipettare delicatamente su e giù sul filtro per mescolare. Per il picco nel protocollo di digestione, incubare i campioni a 50 gradi Celsius per 2 ore. Lavorando rapidamente, rimuovere i campioni e aggiungere altri 2 microlitri di PNGase F.Agitare leggermente i campioni per 1 o 2 secondi per mescolarli.

Incubare i campioni a 50 gradi Celsius per altre 2 ore. Dopo aver evitato i glicani centrifugando il campione a 20 gradi Celsius, aggiungere 100 microlitri di tampone digestivo PNGase al filtro e centrifugare nuovamente. Raccogliere il detergente contenente eventuali residui di glicano legato all'azoto nella stessa fiala di raccolta dell'eluente.

Dopo aver ripetuto due volte, rimuovere il filtro e inserirlo in una nuova fiala di raccolta per la preparazione della proteomica. Quindi, incubare i campioni di glicano nel congelatore a 80 gradi Celsius per 30-60 minuti fino a congelarli. Quindi, asciugare fino al completamento a temperatura ambiente in un concentratore sottovuoto per 4-6 ore.

Sciacquare il filtro contenente i peptidi deanimati con 400 microlitri di tampone urea 8M. Tappare la fiala di raccolta e agitare leggermente per mescolare. Concentrare i peptidi sul filtro prima di scartare tutto il flusso attraverso.

Dopo aver ripetuto il lavaggio con tampone ureico altre due volte, sciacquare il filtro contenente i peptidi deanimati con il tampone digest Trypsin. Tappare la fiala di raccolta e agitare leggermente per mescolare prima di concentrarsi nuovamente sul filtro come prima. Scartare tutto il flusso e ripetere altre 2 volte per un totale di 3 lavaggi tampone digestivo con tripsina.

Raccogli tutti gli eluenti e i lavaggi futuri in una nuova fiala di raccolta. Quindi, aggiungere 50 microlitri di tripsina modificata con carne suina in un rapporto tripsina/proteina 1:50 per la proteomica di scoperta o un rapporto tripsina/proteina 1:5 per esperimenti di proteomica quantitativa. Tappare la fiala di raccolta e agitare leggermente per mescolare.

Dopo aver incubato i campioni a 37 gradi Celsius per 2 ore, lavorare rapidamente per rimuovere i campioni e aggiungere altri 50 microlitri di tripsina al rapporto tripsina/proteine appropriato. Agitare leggermente i campioni per 1 o 2 secondi per mescolare. Quindi, incubare a 50 gradi Celsius per altre 2 ore.

Dopo l'eluizione dei peptidi mediante centrifugazione come prima per 20 minuti, sciacquare i peptidi rimanenti dal filtro con tampone Quench. Eluire il filtro centrifugando come prima per 15 minuti. Dopo aver quantificato la concentrazione di peptidi nei campioni, incubare i campioni di peptidi nel congelatore a 80 gradi Celsius fino a congelarli.

Quindi, asciugare fino al completamento a temperatura ambiente in un concentratore sottovuoto per 4-6 ore. Quindi le proteine triptiche appena prima della cromatografia liquida, spettrometria di massa o analisi LCMS in fase Mobile A alla concentrazione desiderata. Le concentrazioni di peptidi triptici da 2,5 microlitri al plasma variano da 100 a 300 nanogrammi per microlitro.

Prima dell'analisi dei glicani, ricostituire i reagenti 4-fenetilbenzoidrazide marcati con isotopi stabili essiccati, nonché i reagenti P2GPN nativi in un millilitro di soluzione di derivatizzazione per una concentrazione finale di 0,25 milligrammi per millilitro. I reagenti impiegheranno fino a 10 minuti per solubilizzarsi completamente. Vortice estensivo per garantire la completa solubilizzazione.

Etichettare gli N-glicani essiccati con 200 microlitri di reagente P2GPN nativo marcato con isotopi stabili. Pipettare su e giù per risospendere i glicani essiccati. Quindi, agitare i campioni e farli girare per circa 5 secondi su una centrifuga da banco.

Far reagire i glicani con il reagente per 3 ore a 56 gradi Celsius. Trasferire immediatamente i glicani dall'incubatore al concentratore sottovuoto e asciugare fino al completamento a 55 gradi Celsius per 3-5 ore. Risospendere l'N-glicano marcato in 25-50 microlitri di acqua appena prima della cromatografia liquida e dell'analisi di spettrometria di massa.

Pipettare su e giù per assicurarsi che gli N-glicani siano completamente solubilizzati. Dopo aver centrifugato i campioni come prima per 5 minuti, rimuovere il surnatante, facendo attenzione a non lasciare che la punta della pipetta tocchi il fondo della provetta da centrifuga. Combina una coppia di campioni nativi e marcati con isotopi stabili in un rapporto 1:1 per l'analisi tandem di quantificazione relativa.

Prepara 2 diversi metodi LCMS per i flussi di lavoro di proteomica e glicomica. Per l'analisi delle proteine, iniettare circa 400 nanogrammi di proteine sulla colonna in NPA. Far funzionare il campione a 300 nanolitri al minuto, con un'equilibratura pre-colonna da 1 microlitro e un'equilibrazione da colonna analitica da 5 microlitri.

Ionizzare le proteine nelle condizioni MS fornite nel protocollo di testo. Per l'analisi dei glicani, iniettare sulla colonna 5 microlitri di campioni equi-M nativi e marcati con isotopi stabili con P2GPN ri-sospeso. Eseguire il campione a 300 nanolitri al minuto con un'equilibratura pre-colonna da 2 microlitri e un'equilibrazione analitica da 5 microlitri.

Quindi, ionizzare i glicani nelle condizioni MS fornite nel protocollo di testo. Il protocollo di purificazione basato su filtro è stato confrontato con il metodo standard di estrazione in fase solida e le abbondanze di glicani plasmatici rilevate tra i 2 protocolli non erano significativamente diverse. In entrambi i metodi, gli stessi glicani si trovano vicino al limite di rilevabilità dove la variabilità aumenta.

È stata valutata l'intervariabilità per le miscele equiM di plasma purificate mediante il protocollo di estrazione in fase solida standard o basato su filtro. Entrambi i protocolli avevano distribuzioni gaussiane le cui medie non erano significativamente diverse da zero. L'80% dei glicani è diminuito di un doppio cambiamento.

Le distribuzioni del peso molecolare dei glicani rilevate nei protocolli di purificazione nuovi e tradizionali non erano significativamente diverse e coprivano lo stesso intervallo. Qualitativamente, non è stata osservata alcuna distorsione tra i glicani. Le proteine plasmatiche sono state preparate mediante preparazione standard del campione assistita da filtro e protocolli multipli in linea.

Il numero di proteine identificate era simile per i vari protocolli. La deamidazione non specifica è stata controllata nei protocolli di digestione a microonde e indigestione spike a meno del 10%. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che l'occupazione accurata del sito di glicosilazione è subordinata alla riduzione al minimo del calore e dell'esposizione al tempo.

Una volta padroneggiata, la purificazione in linea del pecurikene N-glicano può essere completata in 2 giorni. Seguendo questa procedura, è possibile integrare e modellare un'accurata quantificazione degli N-glicani proteici e l'occupazione del sito di glicosilazione utilizzando tecniche statistiche di ordine superiore. Questa tecnica offre la capacità di leggere rapidamente il linguaggio complesso parlato dalla biologia del cancro, confrontare quantitativamente le differenze nelle terapie proteiche e rivelare veramente l'importanza della glicosilazione in un contesto biologico.