包装艾滋病毒或FIV的基于Lentivector表达结构与VSV-G假型病毒颗粒转导
2012年4月8日
慢病毒表达载体的稳定表达不同的效应分子的分裂和非分裂哺乳动物细胞和整个生物体或记者构造最有效的车辆。在这里，我们提供了关于如何打包pseudoviral颗粒lentivector表达结构和转导靶细胞使用pseudoviral颗粒协议。
该程序的总体目标是了解慢病毒包装。一个为期五天的协议。在第一天，2 9 3，TN 生产细胞以计算的密度接种。
第二天，用含有目标基因和病毒包装质粒混合物的所选 lenti 载体构建体转染细胞。第 4 天，收获病毒浆液并通过添加 PEG 病毒沉淀溶液进行浓缩。该程序的最后一步是收获 PEG 浓缩病毒，分装病毒，并用浓缩病毒感染细胞以进行病毒滴度。
最终，使用稳定整合基因的定量 PCR 来计算稳定整合构建体的数量。与血浆转染或逆转录病毒转导等现有方法相比，该技术的主要优势在于，FBI 优化的慢病毒包装方案可产生高滴度的功能活性病毒，从而能够高效递送到几乎任何哺乳动物细胞中，包括难以转染的细胞（如干细胞和非分裂原代细胞）。通常，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为他们不熟悉小的方案细节，而这些细节对于成功生产高滴度病毒至关重要。
这种方法的视觉演示非常有用，因为转染过程中通过显微镜观察的细胞密度决定了病毒包装的效率，从而决定了最终的病毒滴度。在适用的荧光报告基因表达决定转染效率的情况下，转染效率对最终病毒滴度有重大影响。此外，该方法的可视化演示有助于研究人员熟悉方案中微妙但重要的部分，例如在整个过程中保持无菌的最佳实践，以及如何避免在收获的病毒中包含细胞碎片。
高效的慢病毒包装依赖于三个组分。首先，慢病毒表达载体必须包含病毒包装和稳定整合所需的一些元件，以及用于表达目标基因的元件。短发夹、RNA、micro RNA 或报告盒。
其次，慢病毒包装质粒必须提供将表达构建体的 RNA 拷贝包装成重组假病毒颗粒以及随后在感染时进行逆转录和病毒整合所必需的蛋白质。第三，2 9 3 TN 生产细胞必须与表达和包装载体瞬时 cot 切割。这些细胞产生高滴度的假病毒颗粒，可从培养基中收获。
最终，靶细胞的成功转导主要取决于给定细胞类型每个细胞的病毒颗粒数量。换句话说，感染的多重性始于 2 9 3 个 TN 细胞的生长。在 15 cm 细胞培养板中放置 18 至 24 小时，以获得 60% 至 80% 的 co flulic度。
转染时，每个板将产生大约 1400 万个细胞，以提高病毒产量。第二天，当 2 9 3 个 TN 细胞汇合 60% 至 80% 时，可以使用多个板，即可进行转染。对于每板细胞，向 15 mL falcon 管中加入 1.6 mL 无血清 DMEM。
然后向 DMEM 中加入 22.5 μg ppac H one 或 Ppac F1 和 4.5 μg 慢蛋白载体构建体，并通过上下吹打混合。接下来，将 55 μL Pure Fection 加入同一管中并涡旋 10 秒，然后在室温下孵育 15 分钟。15 分钟后，向每个培养板中加入 1 管。
然后逐滴轻轻旋转板，然后在 48 小时后将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 48 小时。如果 lenti 载体构建体表达 GFP 等荧光基因，请在显微镜下检查细胞，转染成功后将产生 50% 至 90% 以上的绿色荧光细胞，现在将细胞培养上清液收集到 50 mL 锥形管中。上清液含有感染性假病毒颗粒。
从板中拉出的任何细胞都不会对病毒的产生产生负面影响。为了去除碎片，将病毒上清液在 1500 G 室温下离心 15 分钟。然后在不干扰沉淀的情况下，收集病毒上清液，确保留下约 500 μL 上清液的缓冲液，然后进行下一步，即在转染后 72 小时浓缩病毒颗粒。
在收集病毒状态后，可以使用相同的技术进行可选的病毒上质的第二次收集。通过在 50 mL聚丙烯离心管中向每四体积的上清液中加入一体积的冰冷的 PEG 病毒沉淀溶液进行浓缩。倒置溶液以混合。
切勿使用涡旋，然后将溶液在 4 摄氏度下储存长达 96 小时，无需搅拌。冷藏至少 12 小时后，将混合物在 4 摄氏度下以 1500 G 离心 30 分钟。离心后，peggo 沉淀的慢病毒颗粒将在试管底部显示为米色或白色颗粒。
现在，通过小心抽吸去除所有痕量液体，而不会干扰沉淀物中沉淀的慢病毒颗粒。或者，去除大部分 supra natin 并将沉淀重悬于剩余的 supinate 中。然后将悬浮液转移至无菌的 2 ml 浓度管中，并在冷微量离心管中离心 2 分钟。
以 14， 000 RPM 移液除去剩余的上清液，并将慢病毒颗粒沉淀重悬于冰、冷、无菌缓冲液中，浓度为 10 分之一至 100 分之一。原始体积小心地将沉淀移液到溶液中，不产生任何气泡，始终保持低温。确保沉淀完全重悬。
最后，制作 15 至 25 微升等分试样墨水，在冰上无菌低温小瓶，并将小瓶储存在零下 70 摄氏度。成功的包装运行将产生每毫升 1000 万至 10 亿个 IFU，用于在 24 孔培养板中进行病毒转导，每孔 50， 000 个细胞，并在指定的培养条件下培养过夜。细胞的汇合度应在 50% 至 70% 之间，以便进行转导以进行滴度测定。
HT 10 80 细胞可用作易于转导的对照细胞系，第二天从细胞中吸出培养基。然后将培养基与浓鸭溶液混合。所以反式鸭子的最终浓度为 1 x，将半毫升转导的试剂加入每个孔中，目标细胞以 50% 至 70% Co 流度的正确密度向每个孔中加入病毒，稀释度为 1 至 100,1 至 10，并直接一对一稀释。
病毒可以与靶细胞保持接触长达 72 小时，而无需更换培养基。72 小时后，前病毒将稳定整合到宿主基因组中并表达目标基因。如果现有的荧光标志物表达可用于估计不同病毒稀释度的转导效率，则可以通过 QPCR 量化感染单位的数量。
一旦知道病毒滴度，计算适当的病毒体积，以达到其他靶细胞所需的感染复数。测量滴度和控制 MOI 可确保实验和不同病毒制备之间的一致性。该病毒现在已准备好用于其他实验。
2 9 3 个 TN 细胞的起始密度对于转染当天成功的病毒包装至关重要。这 2 9 3 个 TN 细胞的汇合度在 60% 到 80% 之间。用表达 GFP 的 Lenti 载体成功转染 24 小时后，发现至少 90% 的 2 9 3 TN 细胞显示绿色荧光。
转导后 72 小时，GFP 在 HT 10 80 宿主细胞中继续表达。这表明稳定整合到宿主基因组中的慢病毒构建体以 10 倍稀释度转导相同的宿主细胞，成比例地降低了 GFP 的表达。因为病毒滴度和慢病毒介导的基因表达之间的关系是成正比的。
一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在五天内完成，每天大约一到两个小时。观看此视频后，您应该对如何高效、安全地包装具有功能性的病毒颗粒有很好的了解，并成功地用病毒转导的细胞。不要忘记使用慢病毒可能很危险，以及在 BSL 两个组织培养罩中工作等预防措施。
执行此程序时应始终穿着实验服和手套。
概述
本文介绍了一种详细的协议，用于将慢病毒表达构建体包装成伪病毒颗粒，以高效地转导哺乳动物细胞。该方法旨在增强效应分子和报告基因构建体在分裂和非分裂细胞中的传递。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 基因递送
背景
- 慢病毒载体对于稳定基因表达非常有效。
- 它们可以转导广泛的哺乳动物细胞，包括难以转染的细胞。
- 理解慢病毒包装对于优化病毒滴度至关重要。
- 视觉演示有助于理解协议的细微差别。
研究目的
- 提供一个全面的慢病毒包装协议。
- 促进高滴度病毒生产用于研究应用。
- 提高基因递送到目标细胞的效率。
使用的方法
- 用慢病毒构建体转染293TN生产者细胞。
- 使用PEG沉淀收集和浓缩病毒颗粒。
- 定量PCR评估基因的稳定整合。
- 通过荧光标记物显微镜评估转染效率。
主要结果
- 成功的转染产生高比例的荧光标记细胞。
- 优化条件导致高滴度病毒生产。
- 协议细节显著影响病毒包装的效率。
- 视觉辅助工具增强了对关键程序步骤的理解。
结论
- 所描述的协议有效用于产生慢病毒颗粒。
- 协议中的细节关注对成功至关重要。
- 该方法为各种哺乳动物细胞中的基因递送提供了可靠的方法。
常见问题
Executive Industry Relevance
Lentiviral packaging enables high-efficiency transduction of difficult-to-transfect cells, supporting stable gene expression for target validation and lead identification. This method reduces biological risk by providing quantitative, reproducible delivery of effector molecules across diverse mammalian cell types. It enhances predictive confidence in preclinical models by ensuring consistent multiplicity of infection and stable genomic integration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through stable expression of shRNA, cDNA, or reporter genes in primary and stem cells.
- Operational Value: Supports functional target validation in hard-to-transfect systems where plasmid transfection fails.
- Predictive Value: Provides quantitative readouts via qPCR of stably integrated constructs for dose-response modeling.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, high-titer pseudoviral particles for reliable compound screening in relevant cellular models.
- Operational Value: Enables scalable, reproducible viral production using 293TN cells and PEG-it concentration for assay readiness.
- Assay Quality: Delivers quantitative transduction efficiency measurements via fluorescent reporter expression or proviral integration.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports stable effector expression in differentiated and non-dividing cells, bridging discovery to preclinical validation.
- Risk Mitigation: Avoids transfection-related cytotoxicity, improving cell viability and data integrity in long-term studies.
- Model Fidelity: Enables use of physiologically relevant cells (e.g., stem, primary) that maintain disease-relevant phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, enabling consistent delivery of genetic modulators.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing via stable knockdown or overexpression in disease-relevant cell systems.
- Screening: Produces concentrated, titered viral stocks for high-throughput screening with controlled MOI.
- Analytics: Uses qPCR to quantify proviral integration, enabling precise normalization of genetic perturbation effects.
- Translational Research: Supports preclinical studies in primary and stem cells where transient transfection is inadequate.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable viral production platform for multiple projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target modulation through stable, long-term expression.
- Operational Value: Standardized production, concentration, and titering workflows ensure batch-to-batch consistency.
- Strategic Value: Reduces attrition by enabling early assessment of target effects in physiologically relevant models.
- Portfolio Impact: Supports go/no-go decisions based on robust target engagement data from difficult-to-transfect cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture, sterile technique, and lentiviral biosafety (BSL-2).
- Depends on 293TN producer cells, transfection reagents, and PEG-it for viral concentration.
- Necessitates standardization of cell confluence (60–80%) and transfection ratios for reproducible titers.
- Requires adaptation of MOI based on target cell type and susceptibility to transduction.
- Limited by the need for precise avoidance of cell debris during harvest to maintain infectious particle quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:00
Intro
2:28
Background on Efficient Lentiviral Packaging
5:47
Concentrating the Viral Supernatant
3:31
Transfecting 293TN Cells with Packaging Plasmids and Expression Constructs
7:36
Transduction of HT1080 Control Cells for Viral Titering
9:21
Successful Transfection and Transduction
10:19
Conclusion
