分析 在体 内 利用细胞移植和延时成像技术研究斑马鱼胚胎中的细胞迁移

本实验的总体目标是通过细胞移植结合斑马鱼胚胎的活体成像，分析候选基因在调控体内细胞迁移中的功能。该方法有助于解决细胞迁移领域中的关键问题，例如确定新候选基因在体内细胞迁移过程中的作用与重要性。该技术的主要优势在于能够产生嵌合胚胎，从而实现良好的成像效果和细胞示踪观察。

制备细胞移植针时，使用微量移液器拉制仪拉制玻璃毛细管。然后，利用显微操作仪在毛细管内径为35微米处切断针尖。使用微研磨仪将毛细管切割端以45度角进行斜面打磨。

为去除玻璃残留物，将针头插入固定在注射器上的针头架中，然后用2%氢氟酸通过吸入和推出的方式冲洗针头内部三次。随后用丙酮冲洗针头三次。为准备用于显微注射或细胞移植的培养皿，取50毫升胚胎培养基加入0.5克琼脂糖，在微波炉中全功率加热一分钟，制备1%琼脂糖溶液。

将琼脂糖凝胶冷却至约 60 摄氏度，然后将全部体积倒入 90 毫米的培养皿中。插入模具以制备用于注射的凹槽或用于细胞移植的加样孔。当琼脂糖凝胶凝固后，使用镊子小心移除模具。

注射供体胚胎时，在体视显微镜下用镊子将收集到的转基因胚胎轻轻挤入装有胚胎培养基的注射板凹槽中。用镊子调整胚胎方向，使细胞朝上，然后将注射板置于28摄氏度条件下孵育，直至胚胎发育至四细胞期。接着，用注射针吸取2 µL预先配制的注射溶液，该溶液含有与mCherry融合的酵母肌动蛋白结合蛋白140的肌动蛋白结合结构域。

然后将针头插入连接至微操作仪并连接空气注射装置的持针器中。使用精细镊子轻轻触碰针尖或夹捏其末端以打开针头。随后将针头插入四个细胞中的任意一个，注入溶液至细胞体积的70%。

以相似方式注射30个胚胎。当胚胎发育至球形期时，使用塑料移液管将转基因goosecoid GFP宿主胚胎和先前已注射的供体胚胎分别转移至涂有一毫米琼脂糖并加入青霉素/链霉素胚胎培养基的35毫米培养皿中。使用精细镊子手动将胚胎从其绒毛膜中取出。

然后将胚胎放入28摄氏度的培养箱中。在荧光显微镜下观察，当胚胎发育至盾形期时，选择绿色盾状结构中表达ABP140-mCherry的供体胚胎。使用火焰抛光的巴斯德移液管，将受体胚胎转移至细胞移植培养皿中的一排水滴孔内，孔中预先加入含青霉素/链霉素的EM培养基。随后将供体胚胎放置于相邻的一排孔中。

接下来，用一根睫毛小心地将胚胎调整方向，使盾板朝上。然后使用连接注射器的持针器，通过吸入并推出70%乙醇来冲洗针尖。通过吸入空气将针头干燥。

当针头干燥后，将其插入与 Hamilton 注射器相连的针座中，并使针尖斜面朝上。进行盾片对盾片移植时，将移植针进入供体胚胎的盾片部位，吸取约 10 至 20 个标记有 ABP140 mcherry 的细胞，注意避免吸入卵黄。

将细胞移植到宿主胚胎的盾片中，并重复细胞转移操作，直至所有宿主胚胎均完成移植。移植完成后，使用火焰抛光的巴斯德移液管去除任何受损的胚胎。将移植后的胚胎在28摄氏度下孵育约30分钟，以使其恢复。

在去壳胚胎后移植单个前脊索板前体细胞，具体操作如前所述：使用火焰抛光的巴斯德移液管将三个供体胚胎转移至含有青霉素/链霉素无钙林格液的细胞移植培养皿中。用精细镊子对每个胚胎进行解剖，分离出包含注射了ABP140 mCherry标记细胞的外植体，并迅速丢弃胚胎其余部分。使用睫毛轻轻搅拌外植体，直至细胞解离。

然后用移植针吸取一个单独且孤立的细胞，并将其移植到宿主胚胎的盾片中，具体操作如视频前面部分所示。为了更好地控制吸液和移植过程，应使空气/水界面距离针尖约20厘米。为固定胚胎，先在玻璃底小瓶中加入1毫米厚的热0.2%琼脂糖EM溶液，并将小瓶置于42摄氏度的加热块中。

将选定的胚胎转移至琼脂糖溶液中，并弃去移液管中多余的胚胎培养基。随后，用移液管吸取含有胚胎的琼脂糖，并将其连同一滴琼脂糖转移至预先准备好的成像腔室中。在琼脂糖凝固之前，使用睫毛工具调整胚胎方向：若使用正置显微镜成像，则使胚胎的前脊索板朝上；若使用倒置显微镜成像，则使其朝向玻底。

根据室温的不同，在琼脂糖凝胶凝固之前大约有40秒的时间用于调整胚胎的方向。调整胚胎方向时，应操作胚盘而非卵黄，因为卵黄非常脆弱。所有胚胎固定完毕且琼脂糖完全凝固后，使用青霉素/链霉素培养基（Pen/Strep EM）填充腔室，以防止胚胎干燥。

根据文字方案进行活细胞成像和细胞动态实验。本视频展示的技术用于分析Sin1在体内细胞迁移调控中的作用，Sin1是TOR复合物2的核心组分之一。该影片显示了移植的前脊索板前体细胞的迁移过程。

肌动蛋白标记可使富含肌动蛋白的细胞质突起可视化。通过频率和方向分析发现，野生型细胞常产生大量细胞质突起，且这些突起朝向动物极方向及迁移方向排列。如图所示，Sin1 功能缺失会导致突起数量显著减少，且残余突起的方向呈现随机化，表明 Sin1 在调控富含肌动蛋白的细胞质突起形成过程中具有重要作用。

有趣的是，通过表达一种组成型活性形式的 Rac1 可以挽救 Sin1 表型，这强烈表明 TORC2 通过 Rac1 调控肌动蛋白动态和细胞突起的形成。该技术还被用于分析 arpin（一种 ARP2/3 复合物抑制因子）在细胞迁移中的作用。如图所示，arpin 功能的丧失会导致突起频率增加，这可能是由于突起形成更频繁，或突起稳定性增强所致。

在缺失 arpin 的情况下测量突起寿命，结果显示突起的时间持续性延长了一倍，表明其稳定性增加。熟练掌握后，大约 30 个胚胎的移植可在 45 分钟内完成。进行该操作时，需密切关注胚胎的发育情况，因为所有步骤都具有严格的时间要求。

完成此操作后，可进一步开展其他方法，例如活细胞共聚焦显微镜观察，以获得更清晰的成像结果，并解答有关胞吞作用元件、极性标记物、附加蛋白或任何其他细胞组分在细胞内亚结构定位方面的问题。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用前脊索板前体细胞的移植技术，来分析任何候选基因在体内细胞迁移过程中的作用。