Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

该程序的总体目标是使用细胞移植结合斑马鱼胚胎中的实时成像来分析候选基因在控制体内细胞迁移中的功能。该方法可以帮助解决细胞迁移领域的关键问题，例如确定新候选基因在体内细胞迁移中的作用和重要性。这种技术的主要优点是它会产生马赛克胚胎，从而实现良好的成像和细胞腺肌病。

为了准备细胞移植针，请使用微型移液器拉拔器拉动玻璃帽。然后，用微锻造，在内径为 35 微米的地方切割针尖。使用微型研磨机以 45 度角斜切毛细管的切割端。

为了消除玻璃残留物，将针头插入安装在注射器上的针头支架中，然后使用 2% 氢氟酸将溶液吸入和吸出，冲洗针头内部 3 次。然后用丙酮冲洗针头 3 次。为了准备用于注射或细胞移植的培养皿，通过在微波炉中以全功率加热 50 毫升含有 0.5 克琼脂糖的胚胎培养基 1 分钟来制备 1% 琼脂糖。

将琼脂糖凝胶冷却至约 60 摄氏度，然后将整个体积倒入 90 毫米培养皿中。插入模具以创建注射线或创建细胞移植孔。凝固琼脂糖凝胶后，使用镊子去除霉菌。

为了注射供体胚胎，在立体显微镜下使用镊子轻轻地将收集的转基因胚胎挤压到装满胚胎培养基的注射皿的线条中。用镊子将胚胎定向，使细胞朝向顶部，然后在 28 摄氏度下孵育培养皿，直到胚胎达到四个细胞阶段。接下来，在注射针头上加载两微升先前制备的注射液，该注射液含有与 mcherry 结合的酵母肌动蛋白结合蛋白 140 的肌动蛋白结合结构域。

然后将针头插入连接到显微作器并连接到空气喷射器的持针器中。使用细镊子轻轻触摸针尖或捏住针尖，打开针头。然后将针头插入四个细胞中的一个，并注入溶液以填充 70% 的细胞体积。

以类似的方式注射 30 个胚胎。当胚胎达到球体阶段时，使用塑料牧场移液器将宿主转基因鹅焦类 GFP 胚胎和先前注射的供体胚胎转移到单独的 35 毫米培养皿中，培养皿中涂有 1 毫米琼脂糖的胚胎培养基，并填充有 Pen/Strep 胚胎培养基。使用细镊子手动从绒毛膜中提取胚胎。

然后将胚胎放入 28 摄氏度的培养箱中。当胚胎在荧光显微镜下达到盾期时，选择在绿色盾牌内表达 ABP140 mcherry 的供体胚胎。使用火抛光牧场移液器将宿主胚胎转移到装满 Pen/Strep EM 的细胞移植皿中的一排孔中。然后将供体胚胎放在相邻的行中。

接下来，用睫毛小心地定位胚胎，并向上放置防护罩。然后使用连接到注射器的针架，通过吸入和排出 70% 乙醇来冲洗针尖。将空气吸入针头中以干燥针头。

针头干燥后，将其插入连接到 Hamilton 注射器的针架中，斜面朝上。为了进行盾对盾移植，用移植针进入供体胚胎的盾牌，并抽取大约 10 到 20 个用 ABP140 mcherry 标记的细胞。小心避免吸入蛋黄。

将细胞移植到宿主胚胎的防护罩中，然后重复细胞转移，直到所有宿主胚胎都已移植。移植完成后，使用火抛光牧场移液器去除任何受损的胚胎。将移植的胚胎在 28 摄氏度下孵育约 30 分钟，让它们恢复。

如前所述，要在去绒毛胚胎后移植单个前脊索板前祖细胞，请使用火抛光牧场移液器将三个供体胚胎转移到充满 Pen/Strep 无钙振铃剂的细胞移植皿中。用每个胚胎的细镊子解剖含有注射的 ABP140 mcherry 标记细胞的外植体，并迅速丢弃其余胚胎。用睫毛轻轻搅拌外植体，直到细胞解离。

然后在移植针中抽取一个分离的细胞，并将其移植到宿主胚胎的防护罩中，如视频前面所示。为了更好地控制抽吸和移植，请将空气/水分离保持在距针头末端约 20 厘米的位置。要安装胚胎，请在玻璃底小瓶中加入 1 毫米的热 0.2% 琼脂糖，溶于 EM 中。将样品瓶置于 42 摄氏度的加热块中。

将选定的胚胎转移到琼脂糖溶液中，并从移液管中丢弃多余的胚胎培养基。然后用琼脂糖将胚胎吸入移液管中，并将其与一滴琼脂糖一起转移到先前准备好的成像室中。在凝固琼脂糖之前，通过将透视前脊骨板向上放置以使用正置显微镜进行成像，或放在玻璃底部以使用倒置显微镜进行成像，使用睫毛定位胚胎。

室温，在琼脂糖凝胶凝固之前，将有大约 40 秒的时间来定位胚胎。通过纵胚层而不是非常脆弱的卵黄来快速定位胚胎。安装所有胚胎并凝固琼脂糖后，使用 Pen/Strep EM 填充腔室以防止胚胎干燥。

根据文本协议进行活细胞成像和细胞动力学实验。本视频中演示的技术用于分析 Sin1 的作用，Sin1 是 TOR 复合物 2 的核心组分之一，在控制体内细胞迁移中的作用。这部电影展示了移植的脊索前板前祖细胞的迁移。

肌动蛋白标记允许可视化富含肌动蛋白的细胞质突起。通过频率和方向分析，观察到野生型细胞经常产生大的细胞质突起，这些突起朝向动物极的方向和迁移方向。如图所示，Sin1 的功能丧失导致突起数量急剧减少，剩余突起随机化，表明 Sin1 在控制富含肌动蛋白的突起形成中的重要性。

有趣的是，Sin1 表型可以通过表达 Rac1 的组成型活性形式来挽救，这强烈表明 TOR C2 通过 Rac1 控制肌动蛋白动力学和细胞突起形成。该技术还用于分析 ARP2/3 复合物抑制剂 arpin 在细胞迁移中的作用。如图所示，arpin 的功能丧失导致突起频率增加，这是由于更频繁的突起形成，或者是突起稳定性的增加。

在没有 arpin 的情况下测量突起寿命表明，突起的时间持久性增加了一倍，表明稳定性增加。一旦掌握，大约 30 个胚胎的移植可以在 45 分钟内完成。在尝试此程序时，密切关注胚胎的发育非常重要，因为所有步骤都定时严格。

在此程序之后，可以执行其他方法，如实时共聚焦显微镜，以提供更好的成像并解决有关细胞镜元件、极性标记、添加蛋白或任何其他细胞成分的亚细胞组织的问题。看完这个视频，你应该对如何使用脊索前板前祖细胞移植来分析任何候选基因在体内细胞迁移中的作用有了很好的了解。