Name: 高通量CRISPR载体的构建及DNA修饰的表征番茄毛状根的一代 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: 学习利用CRISPR技术构建高通量载体并生成番茄毛状根突变体的方法。该技术通过单步克隆反应实现多载体构建，显著提升植物功能基因组学研究效率，为根系发育研究提供可靠模型。

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本研究由美国国家科学基金会资助（项目编号：IOS-1025642，GBM）。我们感谢Maria Harrison提供了ARqua1菌株。

1. 向导RNA设计与载体构建
<ol>
	<li>确定目的基因的靶序列。有多种在线 CRISPR 靶点查找程序适用于此步骤13,14. 
	注意：此处我们使用 GN20GG靶向基序，但其他设计可能也适用，具体取决于所用的应用或载体系统。</li>
	<li>设计60碱基gRNA寡核苷酸，包含GN19 由5'和3'端各20个核苷酸序列侧翼包围的目标基序片段，该片段用于DNA组装。最终的60聚体基序为：5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN19-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3' 
	注意：标准的脱盐引物即可满足要求。</li>
	<li>准备用于组装的四种DNA（图1）。DNA序列详见补充文件。
	<ol>
		<li>消化1 - 5 µg p201N:Cas910 用限制性内切酶处理质粒 光谱在37 °C下，将样品于1× Buffer 4中孵育2小时。按照制造商说明书进行柱纯化。用约15 µl的10 mM Tris-HCl缓冲液重悬，并通过紫外分光光度法定量。</li>
		<li>用限制性内切酶进行第二次消化 斯瓦在25 °C下用1x Buffer 3.1孵育2小时。取100–200 ng样品在0.8%琼脂糖凝胶上电泳，以确认消化完全。 
		注意：正确消化的质粒将在14,313 bp处显示单一条带。注意：无需进行酶的热失活和去磷酸化处理。消化后的质粒可保存于-20 °C。</li>
		<li>PCR 扩增 Medicago truncatula (Mt) U6 启动子和来自 pUC gRNA 载体的支架 DNA10 使用引物扩增质粒 斯瓦I_MtU6F / MtU6R 和 ScaffoldF / SpeI_ScaffoldR。使用高保真聚合酶进行PCR扩增，反应条件为：95 °C预变性3 min；31个循环（98 °C变性20 sec，60 °C退火15 sec，72 °C延伸30 sec）；72 °C最终延伸5 min。
		<ol>
			<li>在1%琼脂糖凝胶上电泳检测约3 µl PCR产物，以确认扩增效果。MtU6扩增片段为377 bp，支架序列扩增片段为106 bp。根据制造商说明书对剩余PCR产物进行柱纯化，通过紫外分光光度法定量后，于-20 °C保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将整管gRNA寡核苷酸用实验级水重悬至100 µM。取1 µl 100 µM寡核苷酸加入500 µl 1x Buffer 2.1中，充分混匀。若需混合多个寡核苷酸，将每种100 µM寡核苷酸各取1 µl加入同一管1x Buffer 2.1中。稀释后的寡核苷酸可于-20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用带加热盖的PCR仪，设置程序在50 °C下保温。将100 ng（0.011 pmol）线性化载体、50 ng（0.2 pmol）MtU6启动子、12 ng（0.2 pmol）支架序列、1 µl（0.2 pmol）稀释后的gRNA寡核苷酸以及水混合，总体积为5 µl。加入5 µl 2x高保真DNA组装预混液，充分混匀后离心。将反应体系置于50 °C PCR仪中孵育60分钟，随后置于冰上。 
	注意：可根据DNA得率较低的情况适当增加反应体系体积。</li>
	<li>转化 2 µl&#160;反应转入感受态细胞 E. coli 使用标准技术处理细胞，并接种于添加50 mg/L抗生素的LB培养基中-1 卡那霉素（Kan50在37 °C下过夜培养已铺板的细胞。将剩余的DNA组装反应产物保存于-20 °C。</li>
	<li>使用引物 StUbi3P218R 和 ISceIR 通过 PCR 进行菌落筛选。将剩余 DNA 组装反应产物的等分试样用 ddH₂O 按 1:5 比例稀释，取 1 µl 使用。&#160;作为菌落筛选的阳性对照，以及1 ng环状p201N:Cas9质粒作为无插入片段的对照。
	<ol>
		<li>PCR扩增条件：95 °C 预变性3 min；31个循环（95 °C 变性30 sec，58 °C 退火30 sec，72 °C 延伸30 sec）；最后72 °C 延伸5 min。将PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检测。确保含有正确插入片段的样品在725 bp处出现条带，而无插入片段的载体（例如未切割的载体）将出现一条310 bp的条带。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在LB卡那霉素培养基中培养阳性菌落50 在37 °C下过夜培养液体培养物，并根据制造商说明纯化质粒。使用StUbi3P218R引物对质粒进行Sanger测序，将测序色谱图与MtU6启动子、靶序列和支架序列比对，以确认克隆过程中未引入错误。</li>
	<li>通过使用限制性内切酶消化约 1 µg 质粒进行诊断性酶切 生态右心室和 风格I. 在0.8%琼脂糖凝胶上进行可视化。片段大小（bp）分别为：4192、2001、1743、1544、1381、995、831、702、460、423、318和174。</li>
	<li>使用DNA组装技术构建含多个gRNA的载体。
	<ol>
		<li>构建含有两个gRNA表达盒的载体时，使用引物对第一个位置的gRNA进行PCR扩增 斯瓦I_MtU6F / UNS1_ScaffoldR 以及第二位点gRNA对应的引物UNS1_MtU6F / Spe使用1.1–1.8步构建的各质粒中分别提取的1 ng作为模板，进行I_ScaffoldR扩增。PCR反应条件参照1.3.3步。取约3 µl PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检测，以确认扩增效果。扩增片段大小约为500 bp。</li>
		<li>将未纯化的PCR产物各取约等量（通常每种3–4 µl）混合于一个200 µl离心管中。进行连接时，加入1 µl混合后的PCR产物和50 ng的 斯瓦我与 光谱将p201N:Cas9线性化，加入2.5 µl实验室级水和2.5 µl 2x高保真DNA组装预混液，于50 °C恒温循环仪中孵育15分钟。 
		注意：DNA 组装说明书建议 2–3 个片段的孵育时间为 15 分钟。</li>
		<li>将1 - 2 µl转化至感受态细胞中 E. coli 细胞并在LB卡那霉素平板上培养50在37 °C下培养接种的细胞过夜。将剩余的反应物保存在-20 °C。</li>
		<li>使用引物 StUbi3P218R 和 ISceIR，按照与步骤 1.6 相同的条件进行菌落 PCR 筛选。正确克隆将产生 1,200 bp 的扩增片段。将阳性菌落接种于 LB 卡那霉素培养基中培养50 过夜培养液体培养物并纯化质粒。</li>
		<li>使用引物 StUbi3P218R（覆盖第一位点 gRNA）和 p201R（覆盖第二位点 gRNA）对质粒进行 Sanger 测序。将测序峰图与 MtU6 启动子、靶序列及支架序列比对。进行诊断性酶切消化， 生态右心室和 风格将产生以下片段（单位：bp）：4192、2476 1743，1544，1381，995，831，702，460，423，318，174。加粗片段包含第二个gRNA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在满足所有质量控制要求后，将质粒转化进入 根癌农杆菌 菌株 ARqua115将1 µl质粒加入50 µl电转感受态细胞中，用1 mm比色皿在以下参数下进行电穿孔：2.4 kV、25 µF、200 Ω。加入约500 µl SOC培养基复苏细胞，28 °C振荡培养2小时。涂布于LB卡那霉素平板50 在28 °C下培养2天。使用与步骤1.3.3相同的引物和PCR条件进行菌落筛选。从阳性克隆制备甘油菌保存液。</li>
</ol>
2. 毛状根转化
<ol>
	<li>用20%家用次氯酸钠溶液对番茄种子进行15分钟的灭菌处理，并持续搅拌。在超净工作台中去除次氯酸钠溶液，并用无菌实验室级水清洗种子3次。</li>
	<li>将30粒种子接种于含有½ MS培养基（2.22 g L-1 MS盐 + Gamborg维生素，10 g L-1 蔗糖，3 g L-1 胶凝剂，pH 5.8）的GA-7培养盒中。先在黑暗条件下萌发约2天，然后将GA-7培养盒转移至光照条件下，再继续培养幼苗约4天。</li>
	<li>转化前一天，将A. rhizogenes菌株在含Kan50的固体LB培养基上划线接种，并于28 °C过夜培养。</li>
	<li>转化当天，在超净工作台中准备好以下无菌材料：12 ml培养管、50 ml锥形管、½ MS液体培养基（不含胶凝剂）、200 µM乙酰丁香酮、滤纸、培养皿、镊子和手术刀、移液器及枪头。向50 ml ½ MS液体培养基中加入25 µl乙酰丁香酮，并将约6 ml该溶液分装至每根培养管中。</li>
	<li>使用弯头200 µl枪头从平板上刮取A. rhizogenes菌体，并重悬于6 ml ½ MS液体培养基中。涡旋振荡培养管以充分重悬菌体。每种载体对应的菌液重悬后，取1 ml菌液在600 nM固定波长下测定光密度（O.D.），确保O.D.值在0.2至0.4之间；必要时进行稀释或添加菌体。对每种构建体重复此步骤。</li>
	<li>在培养皿中加入约2 ml ½ MS液体培养基和一张无菌滤纸。切取幼苗子叶并放置于湿润滤纸上。待所有子叶收集完毕后，切除子叶远端约1 cm，得到两端均被切割的子叶片段。将外植体加入A. rhizogenes菌液中，混匀后于室温下孵育20分钟，期间偶尔轻轻翻转。 
	注：通常每种构建体使用约12个外植体，但最多可在6 ml A. rhizogenes菌液中接种80个外植体。</li>
	<li>在A. rhizogenes孵育期间，为每种待转化的构建体准备一个含有滤纸的培养皿。同时将不含抗生素的½ MS固体培养基置于超净工作台中晾干表面。</li>
	<li>用无菌镊子将子叶从A. rhizogenes菌液中取出，放置于干燥滤纸上。用培养皿盖覆盖以防止组织干燥，直至完成下一轮转化操作。用滤纸轻轻吸干子叶表面液体，然后将其腹面朝上转移至½ MS固体培养基上。用外科胶带封口，在室温黑暗条件下共培养2天。</li>
	<li>共培养结束后，将子叶腹面朝上转移至添加了300 mg L-1 替卡西林/克拉维酸（Tim300，用于抑制残留A. rhizogenes生长）和Kan50（用于植物筛选）的½ MS培养基上，用外科胶带封口。将培养物置于室温下，以16小时光照/8小时黑暗的光周期在荧光灯下培养。</li>
	<li>约1.5至2周后，使用无菌镊子和手术刀切下长度至少为2 cm的根，并转移至½ MS Kan50 Tim300培养基中。每块平板接种10至15条根。用记号笔标记根尖位置，封口后置于培养室中继续培养。</li>
	<li>一周后可在选择性培养基上观察到转化根的生长。选取部分转化根用于DNA提取（采用常规DNA提取方法）。注：含子叶的培养皿可进行2至3次每周采收，之后根系会缠绕成团，难以分离。未采收的根组织可长期维持培养。可对分离的DNA样本进行多种检测，以确定DNA突变频率和类型。以下描述了部分检测结果。</li>
</ol>

<ol><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li>
<li>Zhou, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+a+CRISPR%2FCas9+library+for+functional+genomics+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells.</a> Nature. 509 (509), 487-491 (2014).</li>
<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), (2014).</li>
<li>Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Patron, N. J., Nekrasov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editing+plant+genomes+with+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Editing plant genomes with CRISPR/Cas9.</a> Current Opinion in Biotechnology. 32, 76-84 (2015).</li>
<li>Bortesi, L., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR%2FCas9+system+for+plant+genome+editing+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond.</a> Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).</li>
<li>Jia, H. G., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+editing+of+sweet+orange+using+Cas9%2FsgRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Targeted genome editing of sweet orange using Cas9/sgRNA.</a> Plos One. 9, (2014).</li>
<li>Upadhyay, S. K., Kumar, J., Alok, A., Tuli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Guided+Genome+Editing+for+Target+Gene+Mutations+in+Wheat%5BTitle%5D)+AND+%22G3-Genes+Genomes+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-Guided Genome Editing for Target Gene Mutations in Wheat.</a> G3-Genes Genomes Genetics. 3 (12), 2233-2238 (2013).</li>
<li>Ron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hairy+root+transformation+using+Agrobacterium+rhizogenes.+as+a+tool+for+exploring+cell+type-specific+gene+expression+and+function+using+tomato+as+a+model%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hairy root transformation using Agrobacterium rhizogenes. as a tool for exploring cell type-specific gene expression and function using tomato as a model.</a> Plant Physiology. 166 (2), 455-U4442 (2014).</li>
<li>Jacobs, T. B., LaFayette, P. R., Schmitz, R. J., Parrott, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+modifications+in+soybean+with+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Targeted genome modifications in soybean with CRISPR/Cas9.</a> BMC Biotechnology. 15, (2015).</li>
<li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).</li>
<li>Zhou, X., Jacobs, T. B., Xue, L. J., Harding, S. A., Tsai, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+SNPs+for+biallelic+CRISPR+mutations+in+the+outcrossing+woody+perennial+Populus+reveals+4-coumarate%3ACoA+ligase+specificity+and+redundancy%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Exploiting SNPs for biallelic CRISPR mutations in the outcrossing woody perennial Populus reveals 4-coumarate:CoA ligase specificity and redundancy.</a> New Phytologist. , (2015).</li>
<li>Stemmer, M., Thumberger, T., Keyer, M. D., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCTop%3A+An+Intuitive%2C+Flexible+and+Reliable+CRISPR%2FCas9+Target+Prediction+Tool%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">CCTop: An Intuitive, Flexible and Reliable CRISPR/Cas9 Target Prediction Tool.</a> Plos One. 10, (2015).</li>
<li>Lei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-P%3A+A+Web+Tool+for+Synthetic+Single-Guide+RNA+Design+of+CRISPR-System+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">CRISPR-P: A Web Tool for Synthetic Single-Guide RNA Design of CRISPR-System in Plants.</a> Molecular Plant. 7 (9), 1494-1496 (2014).</li>
<li>Quandt, H. J., Puhler, A., Broer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRANSGENIC+ROOT-NODULES+OF+VICIA-HIRSUTA+-+A+FAST+AND+EFFICIENT+SYSTEM+FOR+THE+STUDY+OF+GENE-EXPRESSION+IN+INDETERMINATE-TYPE+NODULES%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">TRANSGENIC ROOT-NODULES OF VICIA-HIRSUTA - A FAST AND EFFICIENT SYSTEM FOR THE STUDY OF GENE-EXPRESSION IN INDETERMINATE-TYPE NODULES.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 6, 699-706 (1993).</li>
<li>Zhu, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+genotyping+method+for+genome-modified+animals+and+human+cells+generated+with+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system.</a> Scientific Reports. 4 (8), (2014).</li>
<li>Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Nekrasov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+genome+editing+made+easy%3A+targeted+mutagenesis+in+model+and+crop+plants+using+the+CRISPR%2FCas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system.</a> Plant Methods. 9 (1), 39(2013).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Li, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+and+homologous+recombination-mediated+genome+editing+in+Arabidopsis+and+Nicotiana+benthamiana+using+guide+RNA+and+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9.</a> Nat Biotech. 31 (8), 688-691 (2013).</li>
<li>Fu, Y. F., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+CRISPR-Cas+nuclease+specificity+using+truncated+guide+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 279-284 (2014).</li>
<li>Torella, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+nucleotide+sequence-guided+assembly+of+repetitive+DNA+parts+for+synthetic+biology+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Unique nucleotide sequence-guided assembly of repetitive DNA parts for synthetic biology applications.</a> Nat Protoc. 9 (9), 2075-2089 (2014).</li>
<li>Ono, N. N., Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multiplicity+of+hairy+root+cultures%3A+Prolific+possibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">The multiplicity of hairy root cultures: Prolific possibilities.</a> Plant Science. 180 (3), 439-446 (2011).</li>
<li>Tepfer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+several+species+of+higher+plants+by+Agrobacterium+rhizogenes.%3A+sexual+transmission+of+the+transformed+genotype+and+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transformation of several species of higher plants by Agrobacterium rhizogenes.: sexual transmission of the transformed genotype and phenotype.</a> Cell. 37 (3), 959-967 (1984).</li>
<li>Li, H., Deng, Y., Wu, T. L., Subramanian, S., Yu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Misexpression+of+miR482%2C+miR1512%2C+and+miR1515+Increases+Soybean+Nodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Misexpression of miR482, miR1512, and miR1515 Increases Soybean Nodulation.</a> Plant Physiology. 153 (4), 1759-1770 (2010).</li>
<li>Boisson-Dernier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+rhizogenes-transformed+roots+of+Medicago+truncatula+for+the+study+of+nitrogen-fixing+and+endomycorrhizal+symbiotic+associations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (6), 695-700 (2001).</li>
<li>Collier, R., Fuchs, B., Walter, N., Kevin Lutke, W., Taylor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vitro.+composite+plants%3A+an+inexpensive%2C+rapid+method+for+root+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Ex vitro. composite plants: an inexpensive, rapid method for root biology.</a> Plant Journal. 43 (3), 449-457 (2005).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

由于DNA组装可用于重组任意重叠的DNA序列，该克隆方法可应用于任何CRISPR载体构建。大多数CRISPR克隆方案使用gRNA的基因合成、IIS型限制性内切酶17,18或重叠延伸PCR19。这些技术各自具有固有的优缺点，但通常需要多个手动操作的克隆步骤。本文所介绍克隆方法的主要优势在于整个过程在一个小时内完成，且gRNA寡核苷酸可混合使用，从而进一步简化克隆流程。此外，该DNA组装机制不依赖限制性内切酶，因此该方法几乎适用于任何DNA序列。方便的是，可将不变的DNA组分（线性化载体、MtU6启动子和支架序列）预先配制成主混合液，并于-20 °C保存，用于后续的组装反应。
尽管我们使用 GN20GG gRNA 靶标序列，但也有多种其他可选的 gRNA 靶标序列可供使用17。已有研究表明，较短的 gRNA 可提高动物细胞中的特异性20。在 gRNA 序列中使用 5' G 与 U6 启动子（或在使用 U3 启动子时使用 A），无论其是否与预期靶序列匹配，均可采用更常见的靶标序列...

利用 CRISPR/Cas9 实现靶向 DNA 修饰的能力在功能基因组学研究中具有巨大潜力。CRISPR/Cas9 系统包含两个组分：来源于 Staphylococcus pyogenes 的 Cas9 核酸酶，以及一段长约 100 个核苷酸的向导 RNA（gRNA）分子，后者可将 Cas9 引导至特定的 DNA 靶位点1。靶位点的识别由 gRNA 的前约 20 个核苷酸决定，这使得靶向载体能够实现高通量制备2,3。目前大多数可进行基因工程改造的生物均已应用 CRISPR/Cas9 技术完成改造4,5。
在植物中，通常使用组成型启动子（如CaMV 35S启动子）来驱动Cas9核酸酶的表达6。gRNA则利用RNA聚合酶III的U6或U3启动子进行表达，这些启动子要求gRNA的第一个碱基必须是G（U6启动子）或A（U3启动子），以实现高效转录。然而，也有研究使用不受这些限制的RNA聚合酶II启动子7,8。
不同的gRNA诱导DNA突变的效率不同，因此在进行全植株转化或建立大规模表型筛选之前，首先验证CRISPR载体的有效性非常重要。通过农杆菌渗入法等方法在植物中瞬时表达CRISPR构建体，通常导致的DNA修饰频率低于稳定转化植株6，使得突变检测困难，且此类方法难以用于表型分析。所谓的毛状根则是一种便捷的替代系统，因为可在数周内获得大量独立的稳定转化材料，而稳定植株的获得通常需要数月时间。CRISPR载体在毛状根中诱导DNA突变非常有效9,10。
DNA 组装方法能够高效连接具有重叠末端的 DNA 片段11。某些 DNA 组装方法的一个主要优势是可将单链 DNA（即，寡核苷酸）整合到组装产物中。由于 gRNA 长度仅约 20 个核苷酸，且新的靶点可通过合成寡核苷酸制备，因此这些 DNA 组装方法非常适用于 CRISPR 克隆。本文所述方案基于 p201 系列 CRISPR 载体，该载体已成功应用于大豆10、杨树12以及目前的番茄。所介绍的克隆流程相较于当前的克隆方法10具有多项优势：可在单次克隆反应中于一天内构建出完全功能化的载体。此外，载体构建过程还可进行混合操作，以平行方式同时生成多个 CRISPR 载体，进一步减少操作时间和材料成本。我们还提供了一种用于生成番茄毛状根的实验方案，作为一种高效产生具有靶向基因缺失的转基因材料的方法。毛状根可用于验证 CRISPR 载体的有效性，并为后续实验提供材料。

<table><tbody><tr><td>NEBuilder&amp;reg;（HiFi DNA 组装混合物）</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>E5520</td><td></td></tr><tr><td>p201N:Cas9</td><td>Addgene</td><td>59175</td><td>p201H:Cas9 质粒（59176）也适用于所报道的重叠序列和酶。</td></tr><tr><td>pUC gRNA 载体</td><td>Addgene</td><td>47024</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Swa&lt;/em&gt;I</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>R0604S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Spe&lt;/em&gt;I</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>Zymo 清洁与浓缩-5 柱纯化试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>D4003</td><td></td></tr><tr><td>NEB Buffer 2.1</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>B7202S</td><td></td></tr><tr><td>NEB CutSmart（Buffer 4）</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>NEB Buffer 3.1</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>B7203S</td><td></td></tr><tr><td>EconoSpin Mini Spin Column（质粒制备）</td><td>Epoch Life Sciences</td><td>1910-050/250</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV-HF&amp;reg;</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>R3195S</td><td></td></tr><tr><td>StyI-HF&amp;reg;</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>R3500S</td><td></td></tr><tr><td>MS 盐 + Gamborg 维生素</td><td>Phytotechnology Laboratories</td><td>M404</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel&amp;trade;（结冷胶）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>GA-7 培养盒</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V8505</td><td></td></tr><tr><td>Micropore&amp;trade; 外科胶带</td><td>3M</td><td>1535-0</td><td></td></tr><tr><td>Timentin&amp;reg;（羧苄西林/克拉维酸）</td><td>多个供应商</td><td>0029-6571-26</td><td></td></tr><tr><td>引物 5' &amp;#8594; 3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SwaI_MtU6F&amp;nbsp;</td><td>&lt;strong&gt;GATATTAATCTCTTCGATGA&lt;br/&gt;AATTT&lt;/strong&gt;ATGCCTATCTTATAT&lt;br/&gt;GATCAATGAGG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MtU6R&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>AAGCCTACTGGTTCGCTTG&lt;br/&gt;AAG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ScaffoldF&amp;nbsp;</td><td>GTTTTAGAGCTAGAAATAGC&lt;br/&gt;AAGTT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Spe&lt;/em&gt;I_Scaffold R</td><td>&lt;strong&gt;GTCATGAATTGTAATACGACTC&lt;br/&gt;A&lt;/strong&gt;AAAAAAAGCACCGACTCGGTG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StUbi3P218R&amp;nbsp;</td><td>ACATGCACCTAATTTCACTA&lt;br/&gt;GATGT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISceIR</td><td>GTGATCGATTACCCTGTTAT&lt;br/&gt;CCCTAG</td><td>由于质粒上存在第二个结合位点，不能用于 Sanger 测序</td><td></td></tr><tr><td>UNS1_Scaffold R&amp;nbsp;</td><td>GAGAATGGATGCGAGTAATGAA&lt;br/&gt;AAAAAGCACCGACTCGGTG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UNS1_MtU6 F&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>CATTACTCGCATCCATTCTCAT&lt;br/&gt;GCCTATCTTATATGATCAATGAGG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p201R&amp;nbsp;</td><td>CGCGCCGAATTCTAGTGATCG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>加粗序列表示与线性化 p201N:Cas9 的 20-nt 重叠区域。</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

高通量crispr载体构建及通过番茄毛状根生成对dna修饰的表征

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

利用含有成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9 技术的载体所介导的靶向DNA突变，已被证明在功能基因组学研究中具有重要应用价值。尽管大多数克隆策略操作简便，但通常需要多个步骤，且构建最终载体往往耗时数天。本文所介绍的方法基于DNA组装技术，可在单次克隆反应中直接生成完全具有功能的CRISPR载体。此外，该方法支持载体构建的混合操作，从而进一步提高实验效率与实用性。通过对该方法进行适当改进，还可用于构建可靶向多个基因的CRISPR载体。随后将CRISPR载体转化至番茄毛状根中，以获得具有特异性DNA修饰的转基因材料。毛状根系统在验证载体功能方面具有显著优势，因其技术操作简便，并易于实现大规模培养。本文所述方法具有广泛的应用前景，可用于构建多种类型的CRISPR载体，并适用于多种植物物种。

利用DNA组装进行CRISPR载体构建通常会产生数十至数百个独立克隆。通过PCR进行菌落筛选可轻松鉴定正确克隆，并能区分含有与不含插入片段的质粒（图2A），这在故障排查中具有实用价值。通常情况下，所有克隆均含有插入片段，因此用户可选择完全跳过菌落筛选步骤。诊断性酶切（图2B）和Sanger测序用于质量控制。当出现错误时，通常发生在DNA重叠区域，即MtU6启动子的5'端、gRNA序列或支架序列的3'端。i.e.。若将多个gRNA寡核苷酸混合物加入同一反应体系中，需通过Sanger测序确定具体gRNA序列。各个gRNA的整合分布均匀，大多数gRNA均可从单次转化子中获得（图2C）。建议优先选用高保真DNA组装试剂盒，而非标准DNA组装试剂盒，因为高保真版本的错误率更低（图2C）。
转化后约一至两周可观察...

利用DNA组装技术，可在一次克隆反应中并行构建多个CRISPR载体，从而使大量CRISPR载体的构建变得简单。番茄毛状根是验证CRISPR载体和创制突变体材料的优良模型系统。

高通量CRISPR载体构建及通过番茄毛状根生成对DNA修饰的表征

由携带成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9技术的载体产生的靶向DNA突变已被证明可用于……

本克隆与转化实验的总体目标是高效构建CRISPR载体，并获得可用于功能基因组学研究的敲除突变番茄根系。该方法在植物基因组学领域具有重要应用价值，因其可生成大量敲除突变体，用于研究多种根系生物学过程。该技术的主要优势在于克隆过程可在单一步骤中完成，使得研究团队仅需数周时间即可获得所需材料。首先，设计包含目标序列中GN19区域的向导RNA（gRNA）寡核苷酸，其两侧需加上用于DNA组装的5'端和3'端各20个核苷酸序列。取1至5微克P201N caznine质粒，用限制性内切酶Spe1在37摄氏度下消化2小时。根据生产商说明书通过柱纯化回收消化产物后，溶于15微升10毫摩尔Tris HCl溶液中。通过紫外分光光度法测定DNA的含量。使用限制性内切酶Swa1在25摄氏度条件下进行第二次消化，持续两小时。取100至200纳克样品在0.8%琼脂糖凝胶上电泳，以确认消化完全。正确消化的质粒将在14,313个碱基对处显示一条单一条带。为通过PCR扩增截形苜蓿（medicago truncatula）的启动子和支架DNA，请使用来自puck gRNA穿梭质粒的六个启动子和支架DNA。使用引物Swa1、Mtu6F和MTU6R，以及Spe1支架R中的支架F，在高保真聚合酶中进行扩增。通过1%琼脂糖凝胶电泳观察3 µL PCR产物，以确认扩增效果。MTU6扩增片段为377个碱基对，支架扩增片段为106个碱基对。根据制造商说明书，对剩余的PCR产物进行柱纯化。使用紫外分光光度法进行定量，方法同前，并于负20摄氏度保存。接下来，用实验室级水将整管gRNA寡核苷酸重新悬浮至100微摩尔浓度。取1微升寡核苷酸加入500微升1×NEB缓冲液2.1中，充分混匀。将带有加热盖的热循环仪程序设置为50摄氏度并保持。在水中加入100纳克线性化载体、50纳克MtU6启动子、12纳克支架序列和1微升稀释后的gRNA寡核苷酸，总体积为5微升。再加入5微升2X高保真DNA组装预混液。充分混匀后离心。将反应体系置于50 °C的PCR仪中孵育60分钟。在50 °C孵育1小时后，将反应管置于冰上冷却，随后取2 μL用于按照标准方法转化感受态E. coli细胞。将转化产物涂布于添加了50毫克/毫升卡那霉素的LB琼脂平板上，37摄氏度过夜培养。使用引物StUb3p 218R和1Sce1R通过PCR筛选菌落。取剩余DNA组装反应液适量，用水按1:5稀释，取1微升作为菌落筛选的阳性对照。同时加入一纳克的环状P201N casnine质粒作为无插入片段的对照。根据方案书面部分所述的参数进行PCR扩增后，将PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳观察。正确插入的产物显示为725个碱基对的条带，而无插入片段的载体则显示为310个碱基对的条带。将阳性克隆在LB Can50液体培养基中于37摄氏度过夜培养。次日，根据生产商说明书，使用质粒提取试剂盒纯化质粒。使用StuB3P218R引物对纯化的质粒进行Sanger测序后，将测序峰图与MtU6启动子、靶序列及支架序列进行比对，以确认克隆过程中未引入错误。通过用EcoR5和Sti1酶切一微克质粒进行诊断性酶切。在0.8%琼脂糖凝胶上观察时，应出现此条带模式。最后，将质粒转化至农杆菌Rhizobium rhizogenes菌株ARqua1中，方法是将一微升质粒样品加入50微升电转化感受态细胞中，并在1毫米比色皿中进行电穿孔。加入约 500 微升 SOC 培养基，于 28 摄氏度振荡培养两小时。随后涂布于 LB Can50 平板，于 28 摄氏度培养两天。开始本实验步骤时，将番茄种子置于 20% 家用次氯酸钠溶液中持续混匀消毒 15 分钟。然后将种子转移至超净工作台，去除次氯酸钠溶液，并用无菌实验室级水清洗三次。将30粒种子接种于含½ MS培养基的GA7培养盒中。在黑暗条件下萌发约两天。种子萌发后，将GA7培养盒转移至光照条件下。转化前一天，在含有卡那霉素50的固体LB培养基上划线接种根癌农杆菌（A.rhizogenes）菌种，并于28摄氏度过夜培养。转化当天，在超净工作台中操作，向50毫升½MS培养基中加入25微升乙酰丁香酮，混匀后将6毫升该培养基分装至每支培养管中。使用弯曲的 200 微升枪头从平板上刮取 A.rhizogenes 细胞，并重悬于 6 毫升的 1/2 MS 液体培养基中。涡旋振荡管子，使细胞完全重悬。每种载体的细胞重悬后，取 1 毫升细胞悬液，在 600 纳米波长下测定光密度。向含有无菌滤纸的培养皿中加入两毫升1/2 MS液体培养基。从幼苗上切下子叶，并放置于湿润的滤纸上。待所有子叶收集完毕后，切除子叶最远端的一厘米，得到两端均被切割的子叶片段。将外植体加入 A.rhizogenes 溶液中并混匀。偶尔倒置，于 A.rhizogenes 溶液中孵育 20 分钟。在 A.rhizogenes 孵育期间，为每个构建体转化准备一个含有滤纸的培养皿。同时，在超净工作台中将不含抗生素的一半MS固体培养基放置至干燥。使用无菌镊子将子叶从根癌农杆菌（A.rhizogenes）溶液中取出，并置于干燥的滤纸上。在进行下一步转化时，用培养皿盖覆盖，以确保组织不会干燥。接下来，将子叶在滤纸上吸干，然后转移到一半 MS 培养基上，背面朝上。用外科胶带包裹培养皿，在室温下避光共培养两天。共培养后，将子叶背面朝上转移至添加补充物的一半 MS 培养基中。用手术胶带包裹。将培养物置于室温下，以荧光灯提供每日16小时光照周期进行培养。培养1.5至2周后，使用无菌镊子和手术刀从子叶处切取长度不少于2厘米的根，转移至添加了替卡西林/克拉维酸和卡那霉素的1/2 MS培养基中。将10至15条根转移至一个培养皿中。用记号笔标记根尖的位置。用医用胶带封口，置于培养室中培养。一周后，可在选择性培养基上观察到转化根的生长。选取部分转化根样品，采用 preferred DNA 提取方法进行 DNA 提取。转化后11天，可观察到毛状根从子叶处萌发。在添加了替卡西林/克拉维酸和卡那霉素的一半MS培养基上筛选根，时间约为一周。灰色条带表示接种时根尖的位置。这是克隆和测序PCR产物以检测DNA突变的示例，该实验针对四个不同的毛状根事件中的两个不同基因靶点。灰色框表示 GN20 GG 靶序列，delta 表示突变类型。右侧显示了具有指定突变的克隆数量。这是用于检测 DNA 突变的聚丙烯酰胺凝胶示例。大片段缺失和杂合双链条带表明靶序列存在DNA突变。12个独立事件中有6个被判定为突变体，以delta符号表示。WT表示野生型对照，NT表示无模板对照。一旦掌握该技术，可在一周内构建出数十至数百个CRISPR载体，且可在数周内获得大量分组材料。在进行该操作时，关键步骤是彻底清除并抑制任何残留农杆菌的生长。农杆菌过度生长将抑制根组织的发育并导致其死亡。观看本视频后，您应能充分理解如何利用DNA组装技术构建CRISPR载体，以及如何通过毛状根模型系统和番茄进行载体功能验证。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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