高通量CRISPR载体的构建及DNA修饰的表征番茄毛状根的一代
April 30th, 2016
使用DNA装配，可以并行地构建在单个克隆反应多个CRISPR矢量，使得大量CRISPR的建设矢量a简单的任务。番茄毛状根是一个很好的模型系统来验证CRISPR载体和产生突变体材料。
该克隆和转化程序的总体目标是高效生成 CRISPR 载体并敲除可用于功能基因组研究的突变番茄根。这种方法是植物基因组学领域的有用工具，因为它可以产生大量可用于各种根系过程的敲除突变体。该技术的主要优点是克隆程序可以在一个步骤中完成，从而巩固了可以在短短几周内获得组材料的基础。
首先，设计引导 RNA 或 gRNA 寡核苷酸包括靶基序的 GN19 部分，两侧是 DNA 组装所需的 5 个引物和 3 个引物 20 核苷酸序列。在 37 摄氏度下用限制性内切酶 Spe1 消化 1 至 5 微克 P201N caznine 质粒 2 小时。根据制造商的说明对消化物进行柱纯化后，重新悬浮在 15 微升 10 毫摩尔 Trs HCL 中。
通过紫外分光光度法定量 DNA 的量。用限制性内切酶 Swa1 在 25 摄氏度下进行第二次消化，持续 2 小时。在零点 8% 琼脂糖凝胶上检查 100 至 200 ng 以确认完全消化。
正确消化的质粒在 14， 313 个碱基对处将具有一条带。为了 PCR 扩增苜蓿苜蒿，使用来自冰球 gRNA 穿梭质粒的六个启动子和支架 DNA。在高保真聚合酶中使用引物 Swa1 和 Mtu6F 和 MTU6R，以及 Spe1 支架 R 中的支架 F。
在 1% 琼脂糖凝胶上观察 3 微升 PCR 产物等分铵，以确认扩增。MTU6 扩增子有 377 个碱基对，支架扩增子有 106 个碱基对。色谱柱根据制造商的说明纯化剩余的 PCR 产物。
像以前一样通过 UV 光谱法定量并储存在负 20 摄氏度。接下来，将整管 gRNA 寡核苷酸重悬于实验室级水中至 100 微摩尔。将 1 微升寡核苷酸加入 500 微升 1xNEB 缓冲液中，两点一，并充分混合。
对带有加热盖的热循环仪进行编程，使其保持在 50 摄氏度。将 100 ng 线性化载体、50 ng MtU6 启动子、12 ng 支架和 1 μL 稀释的 gRNA oligo 在水中混合，最终体积为 5 μL。加入 5 μL 2X 高保真 DNA 组装预混液。
充分混合并旋转。在 50 摄氏度热循环仪中孵育反应 60 分钟。在 50 摄氏度下一小时后，将反应物置于冰上，然后使用 2 微升标准技术转化感受态大肠杆菌细胞。
将转化接种在补充有 50 毫克/毫升卡那霉素的 LB 琼脂上，并在 37 摄氏度下孵育过夜。使用引物 StUb3p 218R 和 1Sce1R 的 PCR 筛选菌落。用水 1 至 5 稀释剩余的 DNA 组装反应物的 alequat，并使用 1 μL 作为菌落筛选的阳性对照。
还包括 1 ng 环状 P201N 酪氨酸质粒作为无插入对照。使用实验步骤书面部分中包含的参数进行 PCR 扩增后，在 1% 琼脂糖凝胶上观察 PCR 产物。正确的插入片段具有 725 个条带碱基对，而没有插入片段的载体将具有 310 个碱基对条带。
在 LB Can50 液体培养物中，在 37 摄氏度下培养阳性菌落过夜。第二天，根据制造商的说明使用质粒纯化试剂盒纯化质粒。使用 StuB3P218R 引物对纯化的质粒进行 Sanger 测序后，将色谱图与 MtU6 启动子、靶标和支架序列对齐，以确保在克隆过程中没有引入错误。
通过用 EcoR5 和 Sti1 消化一微克质粒来进行诊断消化。当在 0 点 8 琼脂糖凝胶上观察时，应该可以看到这种条带模式。最后，通过将 1 微升质粒制备物添加到 50 微升电感受态细胞中并在 1 毫升限制器比色皿中电穿孔，将质粒转化为根瘤农杆菌菌株 ARqua1。
加入大约 500 μL SOC 培养基，并在 28 摄氏度下摇晃 2 小时。然后在 LB Can50 板上铺板，并在 28 摄氏度下生长两天。开始这部分程序时，将番茄种子在 20% 的家用漂白剂中消毒 15 分钟，并不断混合。
然后将种子转移到层流罩中。去除漂白剂，用无菌实验室级水洗涤 3 次。将 30 颗种子放在含有半 MS 培养基的 GA7 盒中。
在黑暗中发芽约两天。种子发芽后，将 GA7 盒子移至光照下 转化前一天，在含有 Can50 的固体 LB 上划线 A.rhizogenes 培养物，并在 28 摄氏度下生长过夜。在转化当天，在层流罩中工作，将 25 微升乙酰丁香酮添加到 50 毫升半 MS 中，然后将 6 毫升倒入每个培养管中。
使用弯曲的 200 微升尖端从板中刮出根瘤菌细胞，然后重悬于 6 毫升半 MS 液体中。涡旋试管以完全重悬细胞。从每个载体中重悬细胞后，取 1 毫升细胞并在 600 纳米的固定波长下测量光密度。
将 2 毫升半 MS 液体加入带有无菌滤纸的培养皿中。从幼苗中切除子叶，放在湿润的滤纸上。收集完所有子叶后，从子叶上切下最远端的一厘米，得到具有两个切割端的子叶块。
将前植物添加到 A.rhizogenes 溶液中并混合。孵育 20 分钟，偶尔倒置。在 A.rhizogenes 孵育期间，为每个构建体转化在培养皿中加入一张滤纸。
此外，将层流罩中不含抗生素的半 MS 固体培养基置于干燥状态。使用无菌镊子从 A.rhizogenes 溶液中舀出子叶，并放在干燥的滤纸上。盖上培养皿盖，以确保组织在进行下一次转化时不会变干。
接下来，在滤纸上印迹子叶，并将背面转移至一半 MS 培养基。用手术胶带包裹板，并在室温下在黑暗中共培养两天。共培养后，将子叶背面向上转移到补充的半 MS 培养基中。
用手术胶带包裹。在室温下在荧光灯下保持培养物，光周期为 16 小时。1 点 5 到 2 周后，使用无菌镊子和手术刀从子叶上切除至少 2 厘米长的根，并转移到补充半 MS 培养基的 Ticarcillon/克拉维酸和卡那霉素中。
将 10 到 15 个根转移到一个板中。用记号笔标记根尖的位置。用手术胶带包裹并保存在培养室中。
一周后，可以看到转化根在选择性培养基上生长。使用首选的 DNA 提取方法收获转化根的亚样品，用于 DNA 提取。转化后 11 天可以看到毛状根从子叶中冒出来。
在补充半 MS 培养基的 Ticarcillon/克拉维酸和卡那霉素上选择根约一周。灰色条表示电镀时根尖的位置。这是 PCR 产物克隆和测序的一个例子，用于确定四种不同毛根事件中具有两种不同基因靶标的 DNA 突变。
灰色框表示 GN20 GG 靶序列，delta 表示突变类型。具有指示突变的克隆数显示在右侧。这是用于确定 DNA 突变的聚丙烯酰胺凝胶的一个例子。
大缺失和异链双链条带表明靶序列存在 DNA 突变。12 个独立事件中有 6 个被评分为突变体，如 delta 符号所示。WT 表示野生型对照，NT 表示无模板对照。
一旦掌握，就可以在一周内生产数十到数百个 CRISPR 载体，并在几周内获得趋势化组材料。在尝试此程序时，去除和抑制任何残留农杆菌的生长非常重要。农杆菌的过度生长会抑制和杀死任何根物质。
看完这个视频后，您应该对如何使用 DNA 组装生成 CRISPR 载体，以及如何使用毛根模型系统和番茄测试这些载体有了很好的了解。
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概述
这项研究提出了一种高效生成CRISPR载体和敲除突变番茄根用于功能基因组研究的方法。该技术允许在单一克隆反应中构建多个CRISPR载体，简化了创建大量敲除突变体的过程。
关键研究组成部分
科学领域
- 植物基因组学
- CRISPR技术
- 功能基因组学
背景
- CRISPR技术是一种强大的基因编辑工具。
- 番茄毛状根作为遗传学研究的有效模型。
- 高效的克隆方法对于生成敲除突变体至关重要。
- 这项研究旨在简化CRISPR载体的构建。
研究目的
- 开发一种用于生成CRISPR载体的简化方法。
- 为研究目的创建敲除突变番茄根。
- 提高植物功能基因组研究的效率。
使用的方法
- 为目标基序设计导向RNA（gRNA）寡核苷酸。
- 用限制性内切酶消化质粒DNA。
- 用柱子纯化消化后的DNA。
- 将纯化的DNA重新悬浮以供进一步使用。
主要结果
- 成功在单步中构建多个CRISPR载体。
- 在番茄毛状根中生成敲除突变体。
- 展示了克隆和转化程序的效率。
- 在各种根部过程和功能研究中的潜在应用。
结论
- 该方法显著减少了生成CRISPR载体所需的时间。
- 番茄毛状根被验证为遗传学研究的模型系统。
- 这种方法可以促进植物基因组学研究的进展。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-throughput CRISPR vector construction and rapid generation of transgenic tomato hairy roots enable scalable functional genomics in plant systems. This workflow accelerates target validation and mechanistic de-risking by supporting multiplexed gene editing and efficient mutant production. The approach is positioned to streamline early discovery and assay development for plant trait engineering and pathway elucidation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid interrogation of gene function through targeted knockout mutants.
- Supports biological de-risking by allowing multiplexed editing of candidate genes.
- Facilitates predictive confidence in target selection for plant trait improvement.
Screening & Assay Development
- Prepares validated mutant lines for downstream phenotypic screening workflows.
- Standardizes vector construction and transformation for reproducible assay inputs.
- Enables scalable production of transgenic materials for high-throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional genomics outputs with translational biomarker discovery in plant systems.
- Provides continuity from gene editing to trait validation in precommercial crop development.
- Reduces risk in advancing candidate genes by enabling early functional assessment.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through lead identification in plant biotechnology pipelines, supporting both hypothesis-driven and high-throughput functional studies.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and pathway clarification via efficient mutant generation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative mutant lines for comparative phenotypic analysis.
- Analytics: Provides clear molecular and phenotypic readouts for robust statistical comparison.
- Translational Research: Bridges gene editing outputs to precommercial trait validation in crops.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, reusable platform for CRISPR vector construction across diverse plant targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene function studies.
- Operational Value: Streamlines vector construction and transformation for high-throughput scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency in trait discovery programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of gene targets for advancement in plant pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, plant transformation, and CRISPR design.
- Needs access to high-fidelity DNA assembly, sequencing, and plant tissue culture infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducibility in vector construction and phenotyping.
- Adaptable to a range of plant species but may require protocol optimization per system.
- Careful management of Agrobacterium overgrowth is critical to maintain root viability.
