Name: 完整的荧光成像定时秒。 venezuelae生命周期使用微流体设备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: 了解荧光延时显微技术用于研究委内瑞拉链霉菌完整生命周期的方法。该技术利用微流控设备实现活细胞成像，可实时观察蛋白质定位、极性生长和孢子形成等关键发育过程。

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作者感谢 Grant Calder 在显微镜技术方面的协助，感谢 Matt Bush 对实验方案提出的建议，以及感谢约翰·英内斯中心资助购买蔡司宽场显微镜。本研究由英国生物技术和生物科学研究生理事会（BBSRC）资助项目 BB/I002197/1（资助 M.J.B.）、BBSRC 研究所战略计划资助项目 BB/J004561/1（资助约翰·英内斯中心）、瑞典研究理事会资助项目 621-2010-4463（资助 K.F.）以及利奥波第那博士后奖学金（资助 S.S.）提供经费支持。

1. 新鲜组织的分离 S. venezuelae 孢子及用后培养基的制备
<ol>
	<li>在30 ml麦芽糖-酵母提取物-麦芽提取物（MYM）培养基中接种10 µl SV60菌株的孢子[attBϕBT1::pSS209 (PdivIVA-divIVA-mcherry PftsZ-ftsZ-ypet)]，并添加60 µl R2微量元素溶液（TE）。为确保细胞生长和产孢的一致性，应使用带挡板的锥形瓶或内置弹簧的锥形瓶，以保证充分通气。</li>
	<li>在30 °C、250 rpm条件下培养细胞35–40小时。</li>
	<li>采用液体封片相差显微镜观察细胞，此时可见菌丝片段和孢子。</li>
	<li>取1 ml细胞在台式离心机中以400 × g离心1分钟，使菌丝体及较大的细胞碎片沉淀。</li>
	<li>将含有孢子悬浮液的约300 µl上清液转移至新的1.5 ml离心管中，置于冰上。剩余的培养基保留用于步骤1.7。</li>
	<li>用MYM-TE培养基将孢子稀释1:20（终浓度：0.5–5 × 107 孢子/ml），冰上保存直至使用（见步骤2.3）。 
	注意：尽管目前尚不完全清楚触发链霉菌（Streptomyces）产孢的确切条件，但使用含前一轮产孢培养物所释放的未知胞外信号分子的耗尽型MYM-TE培养基，可促进产孢。</li>
	<li>将剩余的10 ml培养基经0.22 µm无菌注射器滤器过滤除菌，获得无孢子和菌丝片段的耗尽型MYM-TE培养基，并转移至无菌的15 ml离心管中。</li>
	<li>若需进行类似生长条件的后续实验，可将制备好的耗尽型MYM-TE培养基于4 °C保存数天。</li>
</ol>
2. 微流控装置的制备
注意：每块微流控芯片可支持最多四个独立实验。为避免未使用的流体室受到污染，在设置实验时应使用无菌溶液和无菌操作条件。
<ol>
	<li>从微流控板中移除运输溶液，并用无菌 MYM-TE 冲洗各孔。</li>
	<li>向进样孔 1 中加入 300 µl MYM-TE，向孔 2 至孔 6 中各加入 300 µl 使用过的 MYM-TE。</li>
	<li>将步骤 1.6 中稀释的孢子悬液 40 µl 加入通道 &#34;A&#34; 的细胞加样孔 8 中，并按照制造商说明将流体控制装置密封至微流控板。</li>
	<li>启动微流控控制软件，选择合适的板型，并设置流动程序，以 6 psi 压力使培养基从进样孔 1 至孔 5 依次流过，每孔 2 分钟，以预润流道和培养腔。</li>
	<li>在微流控控制软件中为实验创建流动程序：首先使 MYM-TE 从进样孔 1 流入，持续 6 小时，以支持细胞萌发和营养生长；随后切换至由孔 2 至孔 5 提供使用过的 MYM-TE 进行灌注，维持实验剩余时间。实验过程中保持流速压力恒定在 6 psi（相当于约 9 µl 培养基/小时）。在完成步骤 3.5 后启动流动程序。</li>
</ol>
3. 显微镜设置与延时成像方案
注意：本方法采用配备 sCMOS 相机、金属卤化物灯、硬件自动对焦系统、96 孔板载物台架以及环境培养室的全自动倒置宽场显微镜实施。
<ol>
	<li>提前将环境培养箱预热至 30 °C，以防止实验开始后自动对焦出现问题。所需时间取决于所使用的环境培养箱、显微镜和加热系统。建议在实验前一晚即开始加热系统。</li>
	<li>开启显微镜以及显微成像自动化与控制软件。为获得最佳信号收集效率和空间分辨率，请使用高数值孔径（NA）的油浸物镜，例如 100X、1.46 NA 油镜微分干涉差（DIC）物镜。选择合适的滤光片和二向色镜，以获取微分干涉对比（DIC）图像以及黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白融合蛋白的荧光图像。</li>
	<li>在物镜上滴加一滴浸油，并在微流控芯片成像窗口的底部添加浸没液，以改善图像采集过程中的细胞聚焦效果。小心地将密封好的微流控装置（步骤 2.5）安装到倒置显微镜的载物台上。确保芯片牢固地固定在载物台夹持器中，在整个实验过程中不会发生位移。</li>
	<li>利用嵌入式定位标记确定方向，将微流控培养室的成像窗口调至焦点。将焦点对准第一个流道最左侧的部分（标记为 &#34;A&#34;），该区域的捕获阱尺寸为 5，对应捕获阱高度为 0.7 µm。</li>
	<li>在微流控软件中，从入口孔 8 以 4 psi 压力加载细胞持续 15 秒。通过移动载物台扫描整个成像窗口，检查培养室中的细胞密度。若未捕获到孢子，可重复细胞加载步骤，或适当增加加载压力和/或时间，直至达到理想的细胞密度（每个成像窗口 2,048 x 2,048 像素范围内有 1–10 个孢子）。避免过度加载培养室。 
	注意：我们通常使用尺寸为 5 的捕获阱进行 Streptomyces 成像，但尺寸为 4 和 3 的捕获阱也获得了良好结果。有关优化细胞加载过程的更多建议，请参考供应商提供的操作手册。</li>
	<li>在控制软件中启动步骤 2.5 的流体程序，并让微流控芯片在显微镜载物台上平衡温度 1 小时，然后再开始图像采集。</li>
	<li>在显微镜控制软件中设置多维采集程序，以便在多个时间点对多个载物台位置进行成像：
	<ol>
		<li>对于自动保存：指定图像文件自动保存的目录。</li>
		<li>对于照明设置：预先确定每种特定构建体的最佳照明参数。在本实验中，使用以下曝光时间：DIC 为 150 毫秒，YFP 为 250 毫秒，RFP 为 100 毫秒。</li>
		<li>对于时间序列：设置时间序列，按预定时间点顺序采集图像。为成像 S. venezuelae 的生命周期，选择在 24 小时内每隔 40 分钟采集一次图像。</li>
		<li>对于载物台位置与自动对焦：通过移动载物台扫描培养室，并记录每个感兴趣成像位置的坐标。确保各成像位置之间保持足够距离，以最小化光漂白和光毒性。通常使用最多 12 个位置。为每个时间点运行自动对焦程序，以校正缓慢的焦平面漂移。如果显微镜控制软件支持，请将自动对焦策略设置为 &#34;local surface update by hardware autofocus&#34;。在确认所选载物台位置的 Z 坐标后，启用硬件自动对焦功能。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在显微镜控制软件中启动延时成像实验。</li>
	<li>在后续时间点检查所有载物台位置是否仍保持清晰对焦。对于持续数小时的延时成像实验，即使启用了自动对焦，偶尔仍会观察到载物台漂移。若需要重新对焦，应在合适的时间点暂停实验，调整焦距后在既定的成像时间间隔内（步骤 3.7.3）重新启动实验。参见步骤 4.3 了解如何拼接时间序列图像。</li>
	<li>在 24–30 小时后，或当目标区域的菌丝已分化为孢子时（参见 DIC 图像序列），停止图像采集。在软件中停止流体程序，并拆卸微流控装置。</li>
	<li>为使用过的微流控芯片准备短期储存。将第 1 至第 6 孔中残留的 MYM-TE 和废液移除，清空废液孔 7 和细胞加载孔 8。在无菌条件下，向芯片中已使用的 A 通道各孔以及未使用的通道（“B”至“D”）各孔重新加入无菌磷酸盐缓冲液（PBS）。用封口膜密封芯片以防止干燥，并在 4 °C 下保存。</li>
</ol>
4. 使用 Fiji 软件生成延时成像视频
注意：我们注意到，目前有多种商业和免费软件包可用于处理延时显微镜图像，包括 ZenBlue、Metamorph、ICY、ImagePro 或 ImageJ。本文我们重点介绍 Fiji，它是一款基于 ImageJ 的开源图像处理程序，已预装多种实用插件。
<ol>
	<li>将延时实验的成像数据传输到已安装Fiji的计算机上。</li>
	<li>启动程序并使用以下方式导入成像文件 &#34;文件&#62;导入&#62;Bio-Formats&#34; 或直接将成像文件拖入 Fiji。在 &#34;Bio-Formats 导入选项&#34;，勾选该复选框 &#34;拆分通道&#34; 为每个照明通道（DIC、RFP、YFP）获取独立的图像序列。</li>
	<li>可选：若因重新对焦（步骤 3.9）导致图像采集中断而产生多个独立的时间序列，可打开相应的图像堆栈并运行 &#34;图像&#62;堆叠&#62;工具&#62;连接&#34; 每个通道（DIC、RFP、YFP）。</li>
	<li>通过滚动浏览图像序列来评估延时数据的质量。观察菌丝在一段时间内是否保持聚焦，显示菌丝生长并最终形成孢子（DIC图像序列）。检查DivIVA-mCherry在菌丝尖端的预期亚细胞定位（RFP图像序列），以及FtsZ-YPet在营养菌丝或产孢菌丝中分别形成单个环状结构或多个梯状结构（YFP图像序列）。</li>
	<li>分离出图像的感兴趣区域以进行后续处理。延时显微成像通常会产生较大的文件，可能会导致Fiji处理速度变慢。因此，建议识别并分离出感兴趣区域（ROI），并在该较小的图像序列上执行后续的图像处理步骤。
	<ol>
		<li>选择 &#34;矩形选择&#34; 在菜单中选择工具，并在DIC图像序列中绘制一个矩形感兴趣区域（ROI），确保在整个图像序列中，生长中的菌丝均被该ROI包围。</li>
		<li>复制 ROI-堆栈 &#34;Ctrl&#34;+&#34;移位&#34;+&#34;D&#34;.</li>
		<li>单击YFP图像堆栈的名称栏并选择 &#34;编辑&#62;选择&#62;恢复选择&#34; 在菜单中恢复先前从原始 DIC 图像序列中选取的矩形区域，并将其在 YFP 图像序列中的相同位置重新创建，然后复制该 ROI &#34;Ctrl&#34;+&#34;移位&#34;+&#34;D&#34;.</li>
		<li>对RFP图像序列重复此过程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对三个图像堆栈中的图像进行对齐，以消除随时间在xy平面内的载物台漂移。滚动至DIC堆栈的最后一帧并选择 &#34;插件&#62;注册&#62;StackReg&#62; 刚体&#34; 从菜单中选择。对RFP和YFP图像堆栈重复此步骤。如有必要，通过重复步骤4.5.1–4.5.3裁剪感兴趣区域（ROI）。</li>
	<li>可选：针对每个图像堆栈手动调整亮度和对比度 &#34;调整亮度和对比度工具&#34; (&#34;Ctrl&#34;+&#34;移位&#34;+&#34;C&#34;）或选择 &#34;过程&#62;增强对比度&#34; 从菜单中选择并应用 &#34;标准化&#34; 对图像堆栈中的所有图像执行该命令。需要注意的是，后一个命令会改变像素值，因此可能影响后续的图像分析。</li>
	<li>可选：使用插件将各个堆栈（已转换为 RGB 文件格式，参见 4.11）水平或垂直合并 &#34;图像&#62;堆叠&#62;工具&#62;结合&#34;.</li>
	<li>添加比例尺（&#34;分析&#62;工具&#62;比例尺&#34;）和一个时间戳设备（&#34;图像&#62;堆叠&#62;时间标记器&#34;).</li>
	<li>将修改后的图像序列保存为图像序列文件 &#34;.tiff&#34; 格式。要生成视频，请另存为 &#34;.avi&#34;. 或者，使用 QuickTime 格式导出图像序列 &#34;Bio-Formats&#62;Bio-Formats 导出器&#34; 插件并选择 &#34;.mov&#34; 文件类型。</li>
	<li>要从单个帧中获取图片，请选择感兴趣的帧并复制该图像 &#34;Ctrl&#34;+&#34;移位&#34;+&#34;D&#34;. 将生成图像的类型更改为 &#34;RGB&#34; 或 &#34;8位&#34; 在……下方 &#34;图像&#62;类型&#62;RGB 颜色或 8 位&#34; 并将其保存为图像 &#34;.tiff&#34;. 
	注意：Fiji 提供多种附加功能，可用于进一步标注或处理延时成像序列。有关详细信息，请访问 Fiji 在线支持（http://fiji.sc/Fiji）。</li>
</ol>

<ol><li>Bush, M. J., Tschowri, N., Schlimpert, S., Flärdh, K., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-di-GMP+signalling+and+the+regulation+of+developmental+transitions+in+streptomycetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">c-di-GMP signalling and the regulation of developmental transitions in streptomycetes.</a> Nat. Rev. Microbiol. 13, 749-760 (2015).</li>
<li>Jakimowicz, D., van Wezel, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+division+and+DNA+segregation+in+Streptomyces.%3A+how+to+build+a+septum+in+the+middle+of+nowhere%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cell division and DNA segregation in Streptomyces.: how to build a septum in the middle of nowhere?</a> Mol. Microbiol. 85, 393-404 (2012).</li>
<li>McCormick, J. R., Flärdh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+and+regulators+that+govern+Streptomyces+development%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Signals and regulators that govern Streptomyces development.</a> FEMS Microbiol. Rev. 36, 206-231 (2012).</li>
<li>Flärdh, K., Richards, D. M., Hempel, A. M., Howard, M., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+apical+growth+and+hyphal+branching+in+Streptomyces%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of apical growth and hyphal branching in Streptomyces.</a> Curr. Opin. Microbiol. 15, 737-743 (2012).</li>
<li>Hempel, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ser%2FThr+protein+kinase+AfsK+regulates+polar+growth+and+hyphal+branching+in+the+filamentous+bacteria+Streptomyces%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The Ser/Thr protein kinase AfsK regulates polar growth and hyphal branching in the filamentous bacteria Streptomyces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 109, E2371-E2379 (2012).</li>
<li>Fuchino, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+gradients+of+an+intermediate+filament-like+cytoskeleton+are+recruited+by+a+polarity+landmark+during+apical+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamic gradients of an intermediate filament-like cytoskeleton are recruited by a polarity landmark during apical growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, E1889-E1897 (2013).</li>
<li>Holmes, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coiled-coil+protein+Scy+is+a+key+component+of+a+multiprotein+assembly+controlling+polarized+growth+in+Streptomyces%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Coiled-coil protein Scy is a key component of a multiprotein assembly controlling polarized growth in Streptomyces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, E397-E406 (2013).</li>
<li>McCormick, J. R., Su, E. P., Driks, A., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+viability+of+Streptomyces+coelicolor.+mutant+for+the+cell+division+gene+ftsZ%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growth and viability of Streptomyces coelicolor. mutant for the cell division gene ftsZ.</a> Mol. Microbiol. 14, 243-254 (1994).</li>
<li>Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtsZ+and+the+division+of+prokaryotic+cells+and+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">FtsZ and the division of prokaryotic cells and organelles.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 862-871 (2005).</li>
<li>Grantcharova, N., Lustig, U., Flärdh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+FtsZ+assembly+during+sporulation+in+Streptomyces+coelicolor+A3%282%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of FtsZ assembly during sporulation in Streptomyces coelicolor A3(2).</a> J. Bacteriol. 187, 3227-3237 (2005).</li>
<li>Richards, D. M., Hempel, A. M., Flärdh, K., Buttner, M. J., Howard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+basis+of+branch-site+selection+in+filamentous+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic basis of branch-site selection in filamentous bacteria.</a> PLoS Comput. Biol. 8, e1002423(2012).</li>
<li>Hempel, A. M., Wang, S. B., Letek, M., Gil, J. A., Flärdh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assemblies+of+DivIVA+mark+sites+for+hyphal+branching+and+can+establish+new+zones+of+cell+wall+growth+in+Streptomyces+coelicolor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Assemblies of DivIVA mark sites for hyphal branching and can establish new zones of cell wall growth in Streptomyces coelicolor.</a> J. Bacteriol. 190, 7579-7583 (2008).</li>
<li>Wolanski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replisome+trafficking+in+growing+vegetative+hyphae+of+Streptomyces+coelicolor+A3%282%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Replisome trafficking in growing vegetative hyphae of Streptomyces coelicolor A3(2).</a> J. Bacteriol. 193, 1273-1275 (2011).</li>
<li>Jyothikumar, V., Tilley, E. J., Wali, R., Herron, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+microscopy+of+Streptomyces+coelicolor.growth+and+sporulation%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Time-lapse microscopy of Streptomyces coelicolor.growth and sporulation.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 6774-6781 (2008).</li>
<li>Willemse, J., Borst, J. W., de Waal, E., Bisseling, T., van Wezel, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+control+of+cell+division%3A+FtsZ+is+recruited+by+SsgB+during+sporulation+of+Streptomyces%5BTitle%5D)+AND+%22Genes.+Dev%22%5BJournal%5D)">Positive control of cell division: FtsZ is recruited by SsgB during sporulation of Streptomyces.</a> Genes. Dev. 25, 89-99 (2011).</li>
<li>Glazebrook, M. A., Doull, J. L., Stuttard, C., Vining, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+of+Streptomyces+venezuelae.+in+submerged+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sporulation of Streptomyces venezuelae. in submerged cultures.</a> J. Gen. Microbiol. 136, 581-588 (1990).</li>
<li>Bibb, M. J., Domonkos, A., Chandra, G., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+chaplin+and+rodlin+hydrophobic+sheath+proteins+in+Streptomyces+venezuelae.is+controlled+by+sigma%28BldN%29+and+a+cognate+anti-sigma+factor%2C+RsbN%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Expression of the chaplin and rodlin hydrophobic sheath proteins in Streptomyces venezuelae.is controlled by sigma(BldN) and a cognate anti-sigma factor, RsbN.</a> Mol. Microbiol. 84, 1033-1049 (2012).</li>
<li>Al-Bassam, M. M., Bibb, M. J., Bush, M. J., Chandra, G., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+regulator+heterodimer+formation+controls+a+key+stage+in+Streptomyces+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Response regulator heterodimer formation controls a key stage in Streptomyces development.</a> PLoS Genet. 10, e1004554(2014).</li>
<li>Bush, M. J., Bibb, M. J., Chandra, G., Findlay, K. C., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+required+for+aerial+growth%2C+cell+division%2C+and+chromosome+segregation+are+targets+of+WhiA+before+sporulation+in+Streptomyces+venezuelae%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Genes required for aerial growth, cell division, and chromosome segregation are targets of WhiA before sporulation in Streptomyces venezuelae.</a> MBio. 4, e00684-e00613 (2013).</li>
<li>Tschowri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrameric+c-di-GMP+mediates+effective+transcription+factor+dimerization+to+control+Streptomyces+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tetrameric c-di-GMP mediates effective transcription factor dimerization to control Streptomyces development.</a> Cell. 158, 1136-1147 (2014).</li>
<li>Mirouze, N., Ferret, C., Yao, Z., Chastanet, A., Carballido-Lòpez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MreB-Dependent+Inhibition+of+Cell+Elongation+during+the+Escape+from+Competence+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">MreB-Dependent Inhibition of Cell Elongation during the Escape from Competence in Bacillus subtilis.</a> PLoS Genet. 11, e1005299(2015).</li>
<li>Zopf, C. J., Maheshri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquiring+fluorescence+time-lapse+movies+of+budding+yeast+and+analyzing+single-cell+dynamics+using+GRAFTS%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Acquiring fluorescence time-lapse movies of budding yeast and analyzing single-cell dynamics using GRAFTS.</a> J. Vis. Exp. (e50456), (2013).</li>
<li>Meniche, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subpolar+addition+of+new+cell+wall+is+directed+by+DivIVA+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Subpolar addition of new cell wall is directed by DivIVA in mycobacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 111, E3243-E3251 (2014).</li>
<li>Donovan, C., Schauss, A., Kramer, R., Bramkamp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+segregation+impacts+on+cell+growth+and+division+site+selection+in+Corynebacterium+glutamicum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chromosome segregation impacts on cell growth and division site selection in Corynebacterium glutamicum.</a> PLoS One. 8, e55078(2013).</li>
<li>Rojas, E., Theriot, J. A., Huang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+Escherichia+coli.+growth+rate+to+osmotic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Response of Escherichia coli. growth rate to osmotic shock.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 111, 7807-7812 (2014).</li>
<li>Flärdh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+DivIVA+in+polar+growth+and+morphogenesis+in+Streptomyces+coelicolor+A3%282%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Essential role of DivIVA in polar growth and morphogenesis in Streptomyces coelicolor A3(2).</a> Mol. Microbiol. 49, 1523-1536 (2003).</li>
<li>Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+subpixel+precision+analysis+of+bacterial+morphogenesis+and+intracellular+spatio-temporal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">High-throughput subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics.</a> Mol. Microbiol. 80, 612-627 (2011).</li>
<li>Young, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+single-cell+gene+expression+dynamics+in+bacteria+using+fluorescence+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy.</a> Nat. Protoc. 7, 80-88 (2012).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100(2006).</li>
<li>Kuru, E., Tekkam, S., Hall, E., Brun, Y. V., Van Nieuwenhze, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+fluorescent+D-amino+acids+and+their+use+for+probing+peptidoglycan+synthesis+and+bacterial+growth+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Synthesis of fluorescent D-amino acids and their use for probing peptidoglycan synthesis and bacterial growth in situ.</a> Nat. Protoc. 10, 33-52 (2015).</li>
<li>Szafran, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+I+%28TopA%29+is+recruited+to+ParB+complexes+and+is+required+for+proper+chromosome+organization+during+Streptomyces+coelicolor.+sporulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase I (TopA) is recruited to ParB complexes and is required for proper chromosome organization during Streptomyces coelicolor. sporulation.</a> J. Bacteriol. 195, 4445-4455 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

过去，对链霉菌（Streptomyces）生命周期进行延时显微观察在技术上一直具有挑战性。本文介绍了一种可靠的活细胞成像实验方案，通过将荧光蛋白与细胞极性标记蛋白 DivIVA 和细胞分裂蛋白 FtsZ 融合，实现对整个生命周期的可视化，并追踪其发育进程（图2）。
该方法的核心是在微流控装置中培养 S. venezuelae，该装置可实现培养基的持续灌注，并能将正常生长培养基（MYM-TE）更换为用过的培养基（spent MYM-TE）。培养条件的改变对该实验方案至关重要，因为营养水平的降低以及用过的培养基中可能存在的尚未明确的胞外信号（例如群体感应信号）均能促进孢子形成；而持续供应营养丰富的培养基则会促进菌体的营养生长，几乎不产生孢子（数据未显示）。因此，与在琼脂糖上培养相比，该微流控系统具有更高的实验灵活性，并可实现对细菌生长在不同培养条件下动态变化的长期监测，因而更具优势。尽管微流控芯片设计为一次性使用，但未接种细胞的流道可在后续实验中重复利用。我们建议在开包装后一周内使用微流控芯片上的所有通道，因为若芯片暴露时间过长，后续与流体控制装置的密封会出现问题。
在设置实验时，我们发现新制备的孢子在接种到流动室后两小时内即可萌发，而来自冷冻甘油保存液的孢子则至少需要6小时才会出现萌发管（数据未显示）。这种萌发延迟会延长实验周期，并可能影响设备使用和实验条件的稳定性。此外，实验开始时需用MYM-TE培养基灌注至少3小时，以提供足够的营养支持萌发管的发育和延伸。如果实验旨在研究营养生长阶段，MYM-TE的灌注时间可超过初始的3小时。尽管孢子是首选的起始材料，但较短的菌丝片段也可接种至微流控板中。然而，使用剪切菌丝时的接种效率显著较低，通常需要多次接种，这在研究不产孢突变株时可能构成限制。无论使用何种接种物，均应注意避免在培养室中接种过多孢子或菌丝片段，否则会导致快速过度拥挤，影响培养基扩散并增加图像分析的难度。
在进行荧光延时成像时，报告蛋白的构建需谨慎规划 链霉菌属目标蛋白与荧光报告分子之间的连接子长度，以及N端或C端融合的选择，可能至关重要。此外，对于每一种荧光标记的蛋白，均需预先确定最佳实验条件，包括成像频率和曝光时间。 S. venezuelae 菌丝在绿色/黄色通道中表现出自发荧光，这在对低水平表达的荧光标记蛋白进行成像时可能造成干扰。此外，需要注意的是，在萌发及初始营养生长阶段， S. venezuelae 对短波长光特别敏感（例如 （在使用与CFP的蛋白融合时）。
尽管活细胞成像技术和荧光报告系统在细菌成像方面不断取得进展，但大多数用于后续自动化处理此类数据集的软件包（例如 MicrobeTracker、Schnitzelcells、CellProfiler）尚不支持对具有多细胞生活方式的丝状细菌图像进行分析27-29。因此，亟需开发一种适用于链霉菌（Streptomyces）及其他丝状细菌成像数据的定量高通量分析算法。
总之，本文所述工作表明，S. venezuelae 因其能够在液体中产孢，成为该属一个新的极具潜力的发育研究模型系统。Streptomyces 微流控培养装置操作简便，即使无经验的用户也能轻松使用。该装置为研究链霉菌生命周期中关键的细胞生物学过程提供了优良平台，包括蛋白质动态定位、极性生长，以及多细胞菌丝向单基因组孢子链的形态学分化。此外，该实验体系还为研究需要交替培养条件的发育事件提供了诱人的起点，也可用于结合荧光染料开展研究，例如使用荧光D-氨基酸监测肽聚糖合成，或使用碘化丙啶和4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）观察染色体结构30,31。

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Mark Buttner
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Mark J. Buttner

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Erratum: Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

链霉菌是一类生活在土壤中的细菌，其特征是具有复杂的发育周期，包括从多细胞、用于获取营养的菌丝体形态分化为休眠的单基因组孢子1-3。
在适宜的生长条件下，典型的 Streptomyces 孢子通过伸出一至两条萌发管开始萌发（图1）。这些萌发管通过顶端延伸而伸长，并发育成称为营养菌丝的分支菌丝网络。极性生长和菌丝分支由关键蛋白 DivIVA 所调控。这种卷曲螺旋蛋白是极化体（polarisome）这一大型细胞质复合物的一部分，该复合物对于在延伸的菌丝顶端插入新的细胞包膜物质至关重要4-7。在营养生长过程中，菌丝细丝通过不频繁形成的所谓横隔（cross-walls）实现区室化8。这些横隔的形成需要 FtsZ 蛋白，FtsZ 是一种类微管蛋白的细胞骨架蛋白，在大多数细菌的细胞分裂中具有关键作用9。然而，在 Streptomyces 中，这些营养期横隔不会导致细胞缢缩和细胞分离，因此菌丝体保持为多个相互连接的合胞体区室组成的网络。当受到营养限制及其他尚未完全明确的信号刺激时，特化的气生菌丝会从营养菌丝中脱离并向空气中生长3。这些结构的竖立标志着发育进入生殖阶段，在此阶段，长而多基因组的气生菌丝被分割成数十个大小相等、单基因组的前孢子区室。这一大规模的细胞分裂过程由单个产孢菌丝内多个 FtsZ 环同步缢缩所驱动2,10。最终，通过释放休眠的、厚壁的、带有色素的孢子完成形态分化。
<img alt="真菌生活周期示意图：孢子萌发、营养菌丝、气生菌丝、产孢隔膜。" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1： 链霉菌属 固体培养基上的生命周期。 这是基于经典研究建立的生命周期模型 S. coelicolor 在琼脂平板上生长。孢子的细胞发育始于一个或两个萌发管的形成，这些萌发管通过顶端延伸生长，形成分支菌丝网络。营养菌丝的极性生长和分支由 DivIVA（红色）引导。营养菌丝横隔的形成需要 FtsZ（绿色）。在营养限制及其他信号刺激下，菌体竖立起气生菌丝。气生菌丝生长的停滞与一系列 FtsZ 环的组装紧密协调，这些 FtsZ 环形成孢子隔膜，将产孢菌丝分隔成盒状的前孢子区室。这些区室组装出厚实的孢子壁，最终释放为成熟的有色孢子。
关键发育事件 链霉菌属 生活周期特征明确 1,3然而，目前仍缺乏利用荧光延时显微技术来揭示分化过程中亚细胞事件（如蛋白质定位动态、染色体运动以及发育调控的细胞分裂）的细胞生物学研究。活细胞成像 链霉菌属 由于该生物体生命周期的复杂性及其生理特征，其发育研究一直具有挑战性。以往关于营养生长及孢子形成初期隔膜形成阶段的研究，采用了透氧成像室或琼脂糖支撑生长的方法 Streptomyces coelicolor 在显微镜载物台上 11-15然而，这些方法受到多种因素的限制。某些系统仅能在细胞因氧气供应不足或菌丝三维生长导致偏离焦平面之前，对细胞生长和荧光蛋白进行短期成像。在能够实现长期成像的情况下，使用琼脂糖垫培养细胞会限制实验的灵活性，因为无法对细胞施加不同的生长条件或应激处理，同时琼脂糖垫中培养基产生的背景荧光严重干扰了对较弱荧光信号的监测。
本文介绍了一种以高精度和高灵敏度对Streptomyces完整生命周期进行活细胞成像的实验方案。通过在连接荧光宽场显微镜的微流控装置中培养Streptomyces（图2），我们能够连续监测其萌发、营养生长以及产孢隔膜形成过程，持续时间可达30小时。这一进展得益于新型模式生物Streptomyces venezuelae的应用，该菌株在液体培养中几乎可完成全部产孢过程，从而克服了经典模式菌株S. coelicolor仅能在固体培养基上产孢的局限性16-20。为了更清晰地观察营养生长和产孢过程，我们共同表达了荧光标记的细胞极性标记蛋白DivIVA和关键细胞分裂蛋白FtsZ。
我们正在使用一种市售的微流控装置，该装置已成功用于分枝杆菌、大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、枯草芽孢杆菌以及酵母菌21-25。该系统可将细胞固定在单一焦平面上，并允许从不同储液池中连续灌注培养基。在详细的操作方案中，我们将利用这一特性，使委内瑞拉链霉菌的营养菌丝经历营养水平下降，以促进其孢子形成。
所述方案适用于对整个Streptomyces生命周期进行活细胞成像，但如果特定发育阶段尤为关注，也可选择其他培养基条件或显微镜设置。
<img alt="样品制备、S. venezuelae 培养及使用 Fiji 进行光学分析的微流控装置示意图。" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2：实验工作流程示意图。图中展示了本方案中描述的三个主要步骤。首先，从处于稳定期的培养物中制备孢子和用过的培养基。其次，将新鲜孢子加载到微流控系统中，并使用配备孵育腔室的全自动倒置显微镜，在恒定适宜生长温度条件下，对 S. venezuelae 的整个发育生命周期进行成像。第三，利用开源软件 Fiji 对获得的时间序列图像进行分析和处理。

<table><tbody><tr><td>B04A CellAsic ONIX 细菌细胞培养板</td><td>Merck-Millipore</td><td>B04A-03-5PK</td><td>微流控培养板</td></tr><tr><td>CellAsic ONIX 微流控灌注系统与 ONIX FG（版本 5.0.2）</td><td>默克-密理博</td><td>EV-262</td><td>最新的 ONIX 版本（2015 年 7 月）及该程序的使用说明可在此处获取：http://www.merckmillipore.com</td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1 显微镜</td><td>Zeiss</td><td>431007-9902-000</td><td>全自动倒置宽场显微镜</td></tr><tr><td>Incubator XL multi S1 配备 Temperature Module S1 和 Heating unit XL S2</td><td>Zeiss</td><td>411857-9061-000</td><td>显微镜周围的环境培养室</td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 100×/1.46 油镜 DIC 物镜</td><td>Zeiss</td><td>420792-9800-000</td><td></td></tr><tr><td>Ocra FLASH 4 V2</td><td>滨松光子株式会社</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Illuminator HXP 120V</td><td>Zeiss</td><td>423013-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>FL滤光片组46 HE YFP无漂移</td><td>Zeiss</td><td>489046-9901-000</td><td>荧光滤光片组，激发光 500/25 nm，发射光 535/30 nm</td></tr><tr><td>FL滤光片组 63 HE RFP 无移位</td><td>Zeiss</td><td>489063-0000-000</td><td>荧光滤光片组，激发光 572/25 nm，发射光 629/30 nm</td></tr><tr><td>多孔板用K-M型安装架</td><td>Zeiss</td><td>000000-1272-644</td><td>微流控板载物台</td></tr><tr><td>ZEN pro 2012</td><td>Zeiss</td><td>410135-1002-120</td><td>显微镜控制软件</td></tr><tr><td>ZEN模块 时间序列</td><td>Zeiss</td><td>410136-1031-110</td><td>用于设置延时显微镜实验的软件模块</td></tr><tr><td>ZEN 模块图块/位置</td><td>Zeiss</td><td>410136-1025-110</td><td>用于保存特定载物台位置（xzy）的软件模块</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>开源软件包</td><td>&lt;u&gt;http://fiji.sc/Fiji&lt;/u&gt;</td><td>时间序列电影的生成</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;麦芽糖-酵母提取物-麦芽提取物（MYM）&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 4 g 麦芽糖&lt;br/&gt; 4 g 酵母提取物&lt;br/&gt; 10 克麦芽提取物&lt;br/&gt; 加入1 L H2O，其中50 %为自来水，50 %为反渗透水，灭菌后每100 ml添加200 ml R2微量元素溶液</td><td></td><td></td><td>用于培养的孢子形成培养基 &lt;em&gt;S. venezuelae&lt;/em&gt; SV60</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;R2 微量元素溶液（TE）&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 8 mg ZnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 40 mg FeCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;-6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 2 mg CuCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 2 mg MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 2 mg Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;B&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;-10H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 2 mg (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;活细胞成像技术在单细胞水平上对生物过程的研究，极大地促进了我们对细菌细胞亚细胞结构组织的理解。然而，由于技术上的困难，时间延时显微镜在研究产孢丝状细菌链霉菌（Streptomyces）发育过程中所涉及的细胞生物学过程方面的应用一直受到限制。本文介绍了一种通过在市售的微流控装置中培养新型模式菌种委内瑞拉链霉菌（Streptomyces venezuelae），并将其连接至倒置荧光宽场显微镜以克服这些限制的实验方案。与经典的模式菌种天蓝链霉菌（Streptomyces coelicolor）不同，S. venezuelae 可在液体环境中产孢，从而可利用微流控培养室对 S. venezuelae 的细胞发育与分化过程进行长期培养和显微观察。除了监测形态学变化外，还可通过时间延时显微镜观察荧光标记目标蛋白的时空分布。此外，该微流控平台具备实验操作的灵活性，可更换培养基，本详细方案中即利用此特性在微流控室中诱导 S. venezuelae 的产孢过程。整个 S. venezuelae 生命周期的图像以特定时间间隔采集，并在开源软件 Fiji 中进行处理，以生成记录的时间序列动态影像。&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;24&lt;/sub&gt;-4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 加入 200 ml H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 高压灭菌并在 4℃ 保存 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C</td><td></td><td></td><td>加入 0.002 倍体积的 MYM</td></tr><tr><td>PBS（磷酸盐缓冲液）</td><td>Sigma</td><td>P4417-100TAB</td><td>用于补充 B04A 板中未使用通道的进样孔，以便准备进行短期储存的板。</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m 注射器滤器</td><td>Satorius stedim</td><td>16532-K</td><td>准备用过的 MYM-TE 培养基</td></tr><tr><td>SV60</td><td>约翰·英纳斯中心菌种保藏库</td><td></td><td>&lt;em&gt;S. venezuelae&lt;/em&gt; 表达的菌株 &lt;em&gt;divIVA-mcherry&lt;/em&gt; 以及 &lt;em&gt;ftsZ-ypet&lt;/em&gt;</td></tr></tbody></table>

使用微流控装置对委内瑞拉链霉菌（s. venezuelae）完整生命周期进行荧光延时成像

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

活细胞成像技术在单细胞水平上对生物过程的研究，极大地促进了我们当前对细菌细胞亚细胞结构的理解。然而，由于技术上的困难，时间序列显微镜技术在研究形成孢子的丝状细菌Streptomyces发育过程中所涉及的细胞生物学过程方面的应用一直受到限制。
本文介绍了一种通过培养新型模式物种以克服上述局限性的实验方案， Streptomyces venezuelae，连接至倒置荧光宽场显微镜的市售微流控装置中。与经典模式物种不同， Streptomyces coelicolor，S. venezuelae 在液体中形成孢子，可利用微流控培养室来培养并显微观察细胞的发育与分化过程 S. venezuelae 长时间段内。除了监测形态变化外，还可以通过延时显微镜观察荧光标记的目标蛋白在时空分布上的动态变化。此外，该微流控平台具备实验操作的灵活性，可更换培养基，详细方案中利用这一特性来诱导孢子形成 S. venezuelae 微流控腔室中的整体图像 S. venezuelae 生命周期的图像在特定时间间隔采集，并使用开源软件Fiji进行处理，以生成记录的时间序列视频。

成功实现对整个 S. venezuelae 生命周期的活细胞成像，获得包含萌发、营养生长和孢子形成等关键发育阶段的连续时间序列图像（图3，视频1）。通过 DivIVA-mCherry 和 FtsZ-YPet 特异的亚细胞定位，可进一步清晰观察生命周期的动态进程（图4A）。在萌发和营养生长阶段，DivIVA-mCherry 仅在菌丝生长尖端富集，或标记新形成的分支位点，该结果与先前报道的 DivIVA 亚细胞定位一致12,26。相比之下，FtsZ-YPet 在生长菌丝中以不规则间距形成单个环状结构（图4B），这些结构为非收缩性营养隔膜的合成提供支架，从而形成相互连通的菌丝区室8。菌丝由营养生长向产孢分化的过程表现为：顶端 DivIVA-mCherry 荧光焦点消失、极性生长停止，同时伴随 FtsZ-YPet 荧光信号的显著增强（图4C）。在产孢菌丝中，FtsZ-YPet 的定位模式发生显著变化：首先，FtsZ-YPet 螺旋丝状结构沿菌丝滚动前进；随后，在几乎同步的突发事件中，这些螺旋结构聚集成间距规则的 FtsZ-YPet 环状阵列，形似梯状结构。在本研究所描述的实验条件下，这种均匀分布的 FtsZ-YPet 梯状结构可维持约 2 小时。最终，在微分干涉差（DIC）图像中可清晰观察到孢子隔膜的形成，并最终释放出新的孢子（图4D）。
以下方案详细描述了如何使用 Fiji 软件进行图像处理，逐步说明如何将获得的时间序列图像（影片 1）制作成可用于发表的动态视频。
<img alt="微生物生命周期延时摄影；萌发、生长、孢子形成；显微镜图像系列。" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3：代表性延时荧光显微成像序列中S. venezuelae表达荧光标记FtsZ（绿色）和DivIVA（红色）的快照图像。 图中显示了合并图像的选定帧（上图：RFP-YFP-DIC，下图：DIC），展示了Streptomyces的生命周期，包括萌发、营养生长和孢子形成。图像来源于视频1。时间为小时:分钟。比例尺 = 5 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53863/53863fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞分裂过程；DivIVA-mCherry、FtsZ-YPet 蛋白定位；荧光图像，显微镜。" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4：成功拍摄 链霉菌 生命周期延时序列的代表性结果。（A）DivIVA-mCherry 的定位。显示的是视频 1 中两个连续时间点的快照，为 RFP 与 DIC 通道的合并图像。DivIVA-mCherry 标记新的菌丝分支位点（实心箭头），并在菌丝顶端定位以引导极性生长（空心箭头）。比例尺 = 10 µm。（B）营养生长期中的 FtsZ-YPet 定位（箭头）。FtsZ-YPet 形成单个环状结构（上图），在 DIC 图像中（下图）未发生收缩。（C）孢子形成期隔膜生成过程中 FtsZ-YPet（绿色）的定位。DivIVA-mCherry 荧光点以红色显示，下方标注了经过的时间（时:分）。比例尺：5 µm。（D）对应于（C）的孢子形成菌丝的 DIC 图像，显示了前孢子区室的形成，可见孢子隔膜（左图），最终成熟为一串孢子（右图）。时间为时:分。比例尺 = 5 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53863/53863fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜，细胞结构，比较，绿色/红色染色，细胞成像研究。" src="/files/ftp_upload/53863/53863mov1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="影片1的帧"> 
影片1：Streptomyces venezuelae 生命周期的时间延时荧光显微镜图像序列。该影片由合并的RFP-YFP图像（左）和相应的微分干涉差（DIC）图像（右）组成。DivIVA-mCherry以红色显示，FtsZ-YPet以绿色显示。单帧之间的时序间隔为40 min。比例尺 = 10 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53863/movie1.mov" target="_blank">请点击此处观看该影片。</a>

Streptomyces 具有复杂的生活周期，通过细胞生物学手段对其进行研究在实验上具有挑战性。本文介绍了一种利用微流控装置培养 Streptomyces venezuelae，以实现其完整生活周期荧光延时显微观察的实验方案。

使用微流控装置对委内瑞拉链霉菌（S. venezuelae）完整生命周期进行荧光延时成像

活细胞成像技术在单细胞水平上对生物过程的观察，对我们当前理解细胞内结构的组织方式起到了关键作用……

本荧光延时显微镜实验方案的总体目标是提供一种方法，用于研究丝状放线菌——委内瑞拉链霉菌（Streptomyces venezuelae）孢子形成过程中所涉及的发育及细胞分化相关的生物学细胞过程。所述方法为研究链霉菌生命周期中关键的细胞生物学过程提供了优良平台，包括蛋白质动态定位、极性生长以及孢子隔膜形成。该技术的主要优势在于委内瑞拉链霉菌可在液体培养基中完成孢子形成，使我们能够在微流控装置中培养细胞，并通过显微镜全程监测其整个生命周期。该方法展示了委内瑞拉链霉菌（Streptomyces venezuelae）作为该属新发育系统所具备的巨大潜力，因为它能够实现对多细胞菌丝分化为孢子链过程的活细胞成像。首先，取30毫升添加补充物的生长培养基，加入待成像的委内瑞拉链霉菌（S. venezuelae）菌株的10微升孢子进行接种。为了获得稳定一致的细胞生长与孢子形成，应使用带挡板的锥形瓶或内置弹簧的锥形瓶，以确保充分通气。在30摄氏度、250转/分钟条件下培养细胞35至40小时。准备就绪时，应可通过液体封片相差显微镜观察到菌丝片段和孢子。取1毫升培养物，在台式离心机中以400 × g离心1分钟，使菌丝体及较大的细胞碎片沉淀。然后将约 300 微升含有孢子悬浮液的上清液转移至新的 1.5 毫米离心管中，并将该管置于冰上。保留剩余的培养基以用于后续步骤。接下来，用添加了补充物的生长培养基将孢子稀释一至二十倍，并将稀释后的孢子置于冰上保存，直至后续使用。将剩余的培养基倒入一个50毫升的烧杯中，然后用注射器吸取10毫升，并使用无菌的22微米注射器滤器对剩余培养基进行过滤除菌，以获得不含孢子和菌丝片段的用过补充培养基。若需在相似生长条件下进行后续实验，可将过滤后的用过补充培养基在4摄氏度下保存数天。每块微流控板可用于最多四个独立的实验。为避免污染未使用的流室，请在建立实验时确保使用无菌溶液和无菌操作条件。首先从微流控板中移除运输溶液。然后用无菌的补充培养基冲洗各孔。冲洗后，向第一孔的入口加入300微升补充培养基，向第二至第六孔加入300微升用过的补充培养基。接着，将40微升稀释后的孢子液加入A通道第八孔，并按照制造商说明书将多通道接头密封至板上。启动微流控系统的控制软件，并选择合适的芯片类型。设置一个流体程序，使培养基以每平方英寸六磅的压力，依次从第一至第五进样孔流入，每孔持续两分钟，以预润流道和培养腔。随后，使添加了补充物的生长培养基以每平方英寸六磅的压力流入第一进样孔，持续六小时。这将促进萌发和营养生长。程序在六小时后切换至用过的补充生长培养基，并以六 psi 的压力将其流入第 2 至第 5 孔，直至实验结束。提前将环境室预热至 30 摄氏度。然后打开显微镜及显微镜控制软件。安装高数值孔径的油浸物镜，并确认用于获取微分干涉差（DIC）图像的相应滤光片和示意图反射镜已就位，同时确保用于获取黄色荧光和红色荧光蛋白融合图像的滤光组件也已正确设置。在物镜上滴加一滴浸油，同时在微流控板成像窗口的底部也滴加浸油。小心地将密封的微流控装置安装到倒置显微镜的载物台上并固定到位。利用内嵌的位置标记，使微流控培养室的成像窗口进入焦点。首先对准标记为 A 的第一个流道最左侧部分，然后移动载物台至第五个捕获区域，对应捕获高度为 7 微米。在微流控软件中，将系统设置为从入口孔八以 4 psi 压力加载细胞，持续 15 秒。运行过程后，通过移动载物台穿过成像窗口来检查培养室中的细胞密度。若未捕获孢子，需重复细胞加载步骤；或者，可提高加载压力和/或时间，直至达到每个成像窗口 1 至 10 个孢子的理想细胞密度。注意避免过度加载培养室。接下来，在控制软件中启动先前准备好的流体程序，并在开始图像采集之前，让微流控板在显微镜载物台上加热平衡一小时。在显微镜控制软件中，首先指定图像文件自动保存的目录，然后设置多维采集程序，以在多个时间点和多个载物台位置获取多幅图像。接下来，进入照明设置，为每种特定的构建体输入预先确定的最佳照明参数。然后设置时间序列，以每40分钟采集一次图像，持续24小时。为了确定载物台位置并设置自动对焦，需扫描培养腔室，并为每个感兴趣的成像位置保存相应的载物台位置。确保单步位置之间保持足够距离，以尽量减少光漂白和光毒性。确认所选阶段位置的Z坐标后，启动硬件自动对焦功能，然后在显微镜控制软件中开始延时成像实验。在24至30小时后或当目标区域的菌丝已分化为孢子时，停止图像采集。然后在软件中停止流体程序，并拆卸微流控装置。通过从入口孔、废液孔和细胞加样孔中移除残留的培养基，对使用过的微流控板进行短期储存前的准备。然后用无菌 PBS 补充加样通道 A 中已使用的孔以及未使用通道中的孔。最后，用封口膜密封培养板，防止其干燥，并将培养板置于 4°C 保存。成功对S.venezuela生命周期的全部过程进行活细胞成像，获得了包含萌发、营养生长和产孢等关键发育阶段的连续时间序列图像。在萌发或营养生长期间，DivIVA-mCherry特异性地聚集于生长中的菌丝尖端，或标记新形成的菌丝分枝位点。相比之下，FtsZ-YPet则在生长的菌丝体中以不规则间隔形成单个环状结构。这些结构为非生殖性营养隔膜的合成提供了支架，从而形成相互连接的菌丝区室。在产孢菌丝中，FtsZ-YPet 的定位模式发生显著变化：首先，FtsZ-YPet 螺旋丝状结构沿菌丝滚动移动；随后，在一个突然且近乎同步的事件中，这些螺旋结构聚集成一系列规则排列的 FtsZ-YPet 环状结构。最后，在微分干涉对比图像中可以观察到孢子形成隔膜，随后新孢子被释放。该技术为完整观察链霉菌生命周期的活细胞成像提供了可靠的实验方案。该微流控系统操作简便。它提供了实验灵活性，并允许对这些实验设置进行长期监测，同时也是研究特定发育事件的一个极好起点，可用于响应培养条件的变化，或利用荧光染料监测肽聚糖合成，或观察染色体的结构组织。

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