完整的荧光成像定时秒。 venezuelae生命周期使用微流体设备

这种荧光延时显微镜方案的总体目标是提供一种研究生物细胞过程的方法，这些过程支撑着孢子丝状细菌 Streptomyces venezuelae 的发育和细胞分化。describe 方法为研究链霉菌生命周期的核心细胞生物过程提供了一个很好的平台，包括动态蛋白质定位、极化生长和孢子分离。这项技术的主要优点是委内瑞拉链霉菌在液体中形成孢子，这使我们能够在微流体装置中培养细胞并在显微镜下监测整个生命周期。

这种方法证明了委内瑞拉链霉菌作为该属新发育系统的巨大潜力，因为它允许对多中心菌丝体分化为孢子链的活细胞成像。首先，用 10 微升来自委内瑞拉葡萄球菌菌株的孢子接种 30 毫升补充的生长培养基进行成像。为了使细胞一致地生长和孢子形成，请使用带挡板的培养瓶或包含弹簧的培养瓶，以便充分通气。

在 30 摄氏度和 250 RPM 下将细胞培养 35 至 40 小时。准备好后，您应该能够通过液体安装的相差显微镜看到菌丝片段和孢子。在台式离心机中以 400 倍 G 离心 1 毫升培养物 1 分钟，以沉淀菌丝体和较大的细胞片段。

然后将大约 300 微升含有孢子悬浮液的上清液转移到新的 1.5 毫米试管中，并将试管置于冰上。保留剩余的培养基以备后续步骤使用。接下来，在补充的生长培养基中将孢子稀释 1 到 20 个，并将稀释的孢子放在冰上，直到需要为止。

将剩余的培养基倒入 50 毫升烧杯中，然后用注射器吸取 10 毫升，并使用无菌 22 微米注射器过滤器过滤剩余的培养基。获得不含孢子和菌丝片段的用过的补充生长培养基。如果要使用类似的生长条件进行额外的实验，请将过滤后的用过的补充剂生长培养基在 4 摄氏度下保存几天。

每个微流控板最多可用于四个独立实验。为避免污染未使用的流通室，请确保在设置实验时使用无菌溶液和工作条件。首先从微流体板上取出运输溶液。

然后用无菌补充的生长培养基冲洗孔。冲洗后，将 300 微升补充的生长培养基添加到一号孔的入口处，将 300 微升用过的补充生长培养基添加到二至六孔中。接下来，将 40 微升稀释的孢子加载到泳道 A 的第 8 孔中，并按照制造商的说明将歧管密封到板上。

启动微流体的控制软件并选择合适的板类型。设置一个流速程序，使介质以 6 psi 的压力从入口孔 1 到 5 流出，每孔 2 分钟，以灌注流道和培养室。然后让它以 6 psi 的浓度将补充的生长培养基流入 1 号入口井中 6 小时。

这将允许发芽和营养生长。让程序在 6 小时后切换到用过的补充生长培养基，并在实验的剩余时间内以 6 psi 将其流入 2 至 5 孔。提前将环境室预热至 30 摄氏度。

然后打开显微镜和显微镜控制软件。将高数值孔径油浸物镜安装到位，并确认为获取微分干涉对比图像以及黄色荧光和红色荧光蛋白融合的图像而设置的适当滤光片和示意图镜已就位。将一滴浸油放入物镜中，并滴到微流体板上成像窗口的底部。

小心地将密封的微流体装置安装到倒置显微镜的载物台上，并将其固定到位。使用嵌入式位置标记物聚焦微流体培养室的成像窗口。聚焦于第一个标记为 A 的流通室的最左侧，然后将载物台移动到捕集阱尺寸 5，对应于捕集阱高度 7 微米。

在微流体软件中，将系统设置为以 4 psi 的压力从入口井 8 加载传感器 15 秒。该过程运行后，通过在成像窗口上移动载物台来检查培养室中的细胞密度。如果没有捕获孢子，则重复细胞加载步骤，或者增加加载压力和/或时间，直到达到每个成像窗口 1 至 10 个孢子的所需细胞密度。

注意避免培养室超载。接下来，在控制软件中启动先前准备好的流程程序，并在开始图像采集之前让微流体板在显微镜载物台中热平衡一小时。在显微镜控制软件中，通过首先指定用于自动保存图像文件的目录，设置多维采集以随时间在多个载物台位置拍摄多张图像。

接下来，转到照明设置并为每个特定构建体输入预定的最佳照明设置。然后设置一个时间序列，在 24 小时内每 40 分钟采集一次图像。为了确定载物台位置并设置自动对焦，请扫描培养室并存储每个感兴趣的成像位置的载物台位置。

确保单级位置相距足够远，以尽量减少光漂白和光毒性。验证所选载物台位置的 Z 坐标后，激活硬件自动对焦。然后在显微镜控制软件中开始延时实验。

24 至 30 小时后，或者当感兴趣区域中的菌丝分化为孢子时，停止图像采集。然后停止软件中的流程程序，拆卸微流控装置。通过从入口孔、废液孔和细胞加载孔中去除任何剩余的培养基，准备用过的微流体板以进行短期储存。

然后用无菌 PBS 填充泳道 A 的用过的孔和未使用的泳道的孔。最后，用梨膜密封板，以防止其变干。并将盘子存放在 4 摄氏度。

委内瑞拉血吸虫整个生命周期的成功活细胞成像产生了一个连续的时间序列，包括发芽、营养生长和孢子形成的关键发育阶段。在发芽或营养生长过程中，DivIVA-mCherry 仅在生长的菌丝尖端积累或标记新形成的菌丝分支点。相反，FtsZ-YPet 在生长的菌丝体中以不规则的间隔形成单环状结构。

这些结构为合成非建设性营养横墙提供了支架，导致形成相互连接的菌丝隔室。在孢子菌丝中，FtsZ-YPet 的定位模式发生巨大变化。首先，螺旋状 FtsZ-YPet 细丝沿着菌丝翻滚，然后在突然的、几乎同步的事件中，这些螺旋聚结成一个规则间隔的 FtsZ-YPet 环的阶梯。

最后，孢子形成隔膜在微分干涉对比图像中变得可辨别，最终释放出新的孢子。该技术提供了一种可靠的方案，用于对链霉菌的整个生命周期进行活细胞成像。微流体系统易于使用。

它提供了实验灵活性，并允许长期监测该实验设置还提供了一个很好的起点，以研究响应不断变化的文化条件的特定发育事件或使用荧光染料来监测肽聚糖合成或可视化染色体组织。