受体放射自显影协议血管紧张素Ⅱ受体的本地化的可视化

该程序的总体目标是利用受体放射自显影和脑结构的组织学鉴定，在解剖学上定位和量化脑切片中血管紧张素 II 受体的表达。该方法确定了血管紧张素 II 影响行为、认知功能和心血管系统的大脑区域，为开发治疗神经退行性和心血管疾病的新疗法提供了见解。该技术的主要优点是它是定量的、定性的，并且允许以比其他方法更高的特异性鉴定血管紧张素 II 的功能受体。

该方法还可以表征全身其他激素受体系统的功能，例如与滥用药物相关的受体。收获后，立即将脑组织放入模拟颅骨内部的脑模具中，并用铝箔包裹模具，在零下 20 摄氏度下储存。30 分钟后，将组织转移到可密封的冷冻储存袋中，并将袋子存放在零下 80 摄氏度。

切片前，轻轻地从脑模具中取出大脑。要对脑组织进行切片，请将感兴趣的标本转移到设置在零下 10 至零下 18 摄氏度之间的低温恒温器中。当组织平衡到新温度时，使用基于乙二醇和树脂的培养基将样品的一小部分垂直嵌入组织支架中，以便对冠状平面进行切片。

将组织加载到切片机上并将支架牢固地拧紧到位，然后开始以所需的厚度切割大脑，然后将切片以垂直方向安装在显微镜载玻片上，以将更大的组织表面积施加到载玻片上。按顺序收集 5 个部分。收集完所有切片后，让载玻片风干长达 1 小时。

然后将样品放入自密封冷冻袋中的塑料载玻片盒中，在零下 20 摄氏度下储存。要对标本进行无线电标记，请从每组 5 张载玻片中取出第一张和第二张载玻片，并安装到市售或 3D 打印的载玻片夹具中。破折号一张幻灯片用于非特异性治疗组，破折号两张幻灯片用于总治疗组。

适当的预孵育 Coplin 罐中，将载玻片倒置在 35 至 40 mL 室温 AM5 及其各自的抑制剂中。运行多组幻灯片可能会让人不知所措。因此，将玻片每隔 4 分钟放入预孵育罐中，以确保在干燥步骤中没有重叠，这一点非常重要。

30 分钟后，将玻片转移到含有 10 毫升 AM5 并补充适当浓度的 I125 SI 血管紧张素 II 和相应治疗组抑制剂的孵育玻片邮寄袋中，在室温下放置 60 至 90 分钟。确定 125I SI Ang II 的确切浓度对于每天比较血管紧张素 II 受体至关重要。孵育结束时，将玻片放回玻片夹具上，盖住玻片，然后在两个装有 400 毫升蒸馏水的单独容器中轻轻旋转 1 到 2 秒。

第二次水洗后，用 30 至 40 mL AM5 连续洗涤 4 次，每次 1 分钟，冲洗玻片。第四次洗涤后，在四次冰冷的蒸馏水中轻轻旋转切片 1 到 2 秒。然后使用四个不同角度的吹风机用冷空气吹干玻片 4 分钟。

当所有切片都干燥后，将玻片转移到纸巾上。然后使用双面胶带将载玻片组织面朝上安装在一块用于 X 射线胶片的纸板上，每组至少包括一张碘 125 校准标准玻片。要拍摄曝光切片，请在暗室中将纸板载玻片放入带背 X 射线盒内并关灯。

打开保险箱灯，小心地打开一盒 X 光胶片。将一张有光泽的一面朝上且右下角有锯齿状边缘的胶片放在暗盒载玻片的顶部。然后小心地关闭暗盒，扭动锁条以阻挡光线，并将暗盒存放在零下 20 摄氏度。

适当的曝光期后，将胶片转移到显影液中 2 分钟，然后在终止浴中 30 秒，用乙酸双蒸水，然后在定影液中 5 分钟。在装有流水的托盘中清洗胶片 20 分钟。将其转移到消毒剂中约 10 秒钟，然后将薄膜挂起来晾干。

对于脑组织切片的组织学分析，在载玻片架中解冻破折号三个切片。接下来，在去离子水中洗涤切片 1 分钟，然后在硫氨酸染色溶液中孵育 10 分钟，并在一个去离子水容器中浸泡 3 次。将玻片浸入水中，再进行 30 秒的去离子水清洗。

然后按照指示在连续乙醇洗涤中洗涤载玻片。最后一次 100% 乙醇洗涤后，在两个二甲苯容器中连续洗涤玻片 3 分钟和 5 分钟。在第二次二甲苯洗涤结束时，用树脂基、无机溶剂封固剂一次覆盖一个玻片的上边缘。

将 24 x 60 毫米的盖玻片安装在载玻片上，并让载玻片干燥 48 小时。然后以 2400 DPI 灰度将幻灯片和胶片扫描到计算机中。为了通过光密度测定法分析薄膜，扫描后，凭经验勾勒出每张薄膜上的感兴趣区域。

这是在图像分析程序中打开扫描的胶片后生成的伪彩色图像。在测量中包括密度、扫描区域和总目标区域。调整扫描区域条以确保每个感兴趣区域都位于突出显示的参数之间。

然后将数据导出到电子表格中，以确定每个样品的特定结合。定量的校准标准品单位根据分析的执行日期确定。扫描胶片后，使用校准值根据该特定胶片的不同浓度的碘 125 标准品生成曲线。

为了准确起见，校准值和标准值一式三份记录。通过将每组数据分配给适当的亚组来确定非特异性结合组和总组以及组织标记之间的区别。应通过将参数从红色调整为黑色来设置较高的阈值，而较低的阈值应设置在接近零的位置，以便更准确地测量整个扫描的感兴趣区域。

例如，在这里，将总结合组与非特异性结合基团中下丘脑室旁核的最终测量面积与硫氨酸染色切片进行比较以进行解剖确认。非特异性结合是在饱和浓度的非放射性血管紧张素 I 受体配体存在下与非血管紧张素受体结合的放射性配体量，而总结合是在不存在非放射性血管紧张素 I 受体配体的情况下结合的放射性配体量。然后可以从总结合值中减去非特异性结合值，以获得血管紧张素 I 受体的特异性结合值。

一旦掌握，受体放射自显影步骤可以在大约 4 小时内完成，而胶片显影步骤每张胶片大约需要 30 分钟。在执行此过程时，重要的是要跟踪时间以确保所有载玻片的孵育、冲洗和干燥时间完全相同。在此程序之后，可以进行额外的脑形态学研究，以评估显示血管紧张素 II 受体表达的区域大小的变化。

这项技术为研究受体药理学的研究人员铺平了道路，以确定不同的大脑区域如何受到各种神经激素、神经递质和药物的影响。观看此视频后，您应该对如何成功进行受体放射自显影测定、组织学染色载玻片以及评估放射自显影图以将受体定位到特定大脑区域有很好的了解。请记住，与放射性一起工作可能是危险的，应始终采取预防措施，例如适当的屏蔽、遏制、暴露监测和处置，以避免放射性污染。