Name: 受体放射自显影协议血管紧张素Ⅱ受体的本地化的可视化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 学习受体放射自显影技术，用于精确定位和定量分析大鼠脑内血管紧张素Ⅱ受体的表达分布。该方法结合组织学鉴定，为研究神经退行性疾病和心血管疾病的新型治疗策略提供重要依据。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目HL-113905支持

本研究中进行的所有动物实验均经诺瓦东南大学机构动物护理和使用委员会批准，符合《实验动物护理与使用指南》第8版的要求。th （美国国家科学院出版社，华盛顿特区，2011年版）
1. 受体放射自显影组织切片的制备
<ol>
	<li>处死后立即采集新鲜脑组织，用铝箔包裹，并尽快放入 -20 °C 冰箱中。为保持脑组织的正确形态，可将脑组织置于模拟颅腔内部结构的脑模中，再用铝箔包裹，放入 -20 °C 冰箱。30 分钟后，将组织转移至可密封的冷冻储存袋中，并移至 -80 °C 冰箱进行长期保存。
	<ol>
		<li>从 -80 °C 冰箱中取出所需的新鲜冷冻组织样本，转移至设定温度为 -10 °C 至 -18 °C 的冷冻切片机中，以避免样本解冻。</li>
		<li>将样本置于组织托上，使用基于乙二醇和树脂的包埋介质，仅将样本的一小部分嵌入介质中。对于脑组织，应将脑垂直固定，以便进行冠状面切片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将组织托安装在冷冻切片机内的切片机上，并牢固固定。确保脑组织的左右两侧处于相同的前后坐标位置，且背腹轴方向与常用脑图谱的坐标系垂直。</li>
	<li>开始以所需厚度（推荐 20 µm）进行切片，并将切片以垂直方向贴附于载玻片上，以在载玻片上获得更大的可用空间。将切片按连续顺序每五张为一组收集到载玻片上，即第一组载玻片标记为 1-1、1-2、1-3、1-4 和 1-5（图 3）。</li>
	<li>完成一组载玻片的收集后，让载玻片在空气中干燥最多 1 小时，然后将载玻片放入塑料玻片盒中，再将盒子装入自封式冷冻储存袋，于 -20 °C 保存。</li>
</ol>
2. 受体放射自显影
警告：放射性物质。操作时需穿戴防护装备以处理放射性物质。废弃物处置须根据所在机构的规定进行，必须遵循相关指南，通过适当衰变（半衰期为60天）或由有资质的公司回收处理。&#160;
<ol>
	<li>从 -20 °C 冰箱中取出所需的 &#34;-1&#34; 和 &#34;-2&#34; 载玻片，装入载玻片夹中（图 5）。将 &#34;-1&#34; 载玻片组合用于“非特异性”处理，&#34;-2&#34; 载玻片用于“总量”处理。“非特异性”染色缸中将含有 10 µM 终浓度的 PD123319（AT2R 拮抗剂）和 losartan（AT1R 拮抗剂）溶于测定缓冲液（AM5）中（表 1），“总量”结合染色缸中仅含 10 µM PD123319 溶于 AM5 中。</li>
	<li>将载玻片夹倒置，使载玻片浸入已装有 35–40 ml AM5 缓冲液及相应抑制剂的预孵育 Coplin 染色缸中，在室温下孵育 30 分钟。后续各组在预孵育水浴中每隔 4 分钟依次开始。</li>
	<li>将载玻片立即从预孵育溶液转移至孵育载玻片邮寄盒中，其中含有 10 ml AM5 缓冲液，以及预定浓度的 125I-SI-Ang II（计算方法见 图 4）和相应的抑制剂，在室温下孵育 60–90 分钟。若放射性配体充足，可将 10 张载玻片（背对背）放入改良的载玻片夹中，并在 Coplin 染色缸中用 125I-SI-Ang II 进行孵育。</li>
	<li>将载玻片重新放回载玻片夹中（如需要），吸干并轻轻晃动，在两个独立容器中各用 400 ml 去离子水冲洗 1–2 秒。</li>
	<li>将载玻片依次转移至四个装有 35–40 ml AM5 缓冲液的 Coplin 染色缸中，每缸准确冲洗 1 分钟（如 图 4 所示）。</li>
	<li>最后一次 1 分钟冲洗后，将切片在四次更换的冰冻去离子水中轻轻晃动 1–2 秒。</li>
	<li>使用从不同角度设置的四个吹风机，以冷风（注意：热风会使放射性化合物挥发）吹干载玻片 4 分钟（图 5），直至所有切片完全干燥，然后将其放置在纸巾上。</li>
	<li>用双面胶带将组织面朝上的载玻片固定在硬纸板上，用于与 X 射线胶片贴片曝光。</li>
	<li>在每块硬纸板上至少固定一个 125I 碘校准标准品载玻片（图 6）。 
	注：校准标准品由脑组织匀浆与结合了 125I 碘的含酚环化合物充分混合后，通过离心在 1 ml 结核菌素注射器中压制成型，再使用冷冻切片机切片至与脑组织切片相同厚度，并贴附于载玻片上。或者，也可商业购买以塑料树脂包埋并切成 20 µm 厚度的 125I 校准标准品。此类标准品中的塑料树脂会部分屏蔽辐射，因此在校准中应考虑约 40% 的组织等效性。</li>
</ol>
3. 薄膜曝光与显影
<ol>
	<li>进入暗室，携带一个带背带的X射线片盒和放射自显影胶片。打开片盒，将载有切片的纸板放入其中（图6）。
	<ol>
		<li>关闭室内灯光，打开安全灯。小心打开X射线胶片盒，取出一张胶片，将光面朝上（锯齿边位于右下角）放置在片盒内的切片上方。仔细合上片盒，并旋转锁紧杆以确保完全避光（图6）。在-20 °C条件下曝光数天至数周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在暗室中打开片盒，开始进行胶片显影。
	<ol>
		<li>依次将胶片放入各托盘中：显影液中2分钟，含5%冰醋酸的水中30秒，定影液中5分钟。随后将胶片置于流动水中的托盘内清洗20分钟，再放入Photoflo溶液中不超过10秒，取出后悬挂晾干。 
		注意：曝光时间需通过实验经验确定，可能需要使用多张胶片进行不同时间的曝光：时间应足够长以检测到低结合区域的可测量信号，但又不能过长导致高结合区域使胶片饱和。一旦获得理想的曝光结果，即可进行下一步操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 组织学
<ol>
	<li>制备天青素染色液及染色试剂（表2，图7）。
	<ol>
		<li>将&#34;-3&#34;载玻片放入载片架中，依次转移至去离子水中浸泡1 min，随后放入天青素染色液中染色10 min，再在去离子水中浸洗三次，最后用去离子水冲洗30秒。</li>
		<li>水洗后，将载片架依次浸入乙醇中洗涤：50%、70%和90%乙醇各30秒，随后在100%乙醇中洗涤两次，每次1分钟。最后将载片架放入二甲苯中3分钟，再转移至第二份二甲苯溶液中5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从最后一个二甲苯浴中逐个取出载玻片，用含有机溶剂的树脂封片剂覆盖载玻片上缘，然后将24 mm × 60 mm的盖玻片盖在载玻片上。让载玻片充分干燥约48小时，随后以2,400 dpi的灰度模式扫描入计算机。</li>
</ol>
5. 密度测定图像分析
<ol>
	<li>将胶片有光泽的一面朝下放置，锯齿状边缘位于左下角，使用专有扫描仪进行扫描，确保将胶片密度信息传输至成像系统计算机时，图像无任何失真。</li>
	<li>打开专有成像系统，利用校准条建立校准标准，用于后续对胶片上图像的密度分析（图9-12）。</li>
	<li>通过建立模板或手动勾画感兴趣区域来测量目标区域。数据按胶片（对照或野生型（切片））及区域分别收集和分类。测量时需包含密度（fmol/g）、扫描面积和总目标面积（图9）。
	<ol>
		<li>调整扫描区域标尺，确保感兴趣区域位于高亮显示的参数范围内（图10）。</li>
		<li>将数据导出至电子表格（表4）。将密度乘以总目标面积，再除以扫描面积，以获得该特定区域的结合值。对所有测量值完成此计算后，用总结合值减去已确定的非特异性结合值，得到特异性结合值。也可对这些数值进行平均处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Robert Speth 已将血管紧张素 II 受体的抗体授权给一家商业供应商，并从这些抗体的销售中获得专利使用费。其他作者无任何利益冲突需要披露。

所述方案旨在对先前采集并储存在 -80 °C 的啮齿类动物脑冠状切片的相邻切片中，放射性配体的“总结合”与“非特异性结合”进行可视化观察，该方法可广泛适用于几乎所有具有解剖学上可分辨亚结构且表达不同数量受体或放射性配体结合位点的组织。本方案所描述的操作步骤简便，而分析过程对于正确解读实验结果至关重要。20 µm 的切片厚度被确定为最优值；若切片过厚，非特异性结合将增加，从而难以分辨放射性配体与其靶点的结合信号；若切片过薄，则难以在无变形的情况下连续切取并保存连续切片。最佳切割温度因组织性质和切片厚度而异，通常需通过经验确定。当刀片与组织接触后，可检查样本方向，并通过将组织样本从刀片处轻微后移并重新调整包埋球的方向进行校正。在切割啮齿类动物脑组织时，必须确保脑左右两侧处于相同的前-后坐标位置，且背-腹轴与常用脑图谱的坐标系垂直。载玻片组需预先标记，以便对组织的相邻切片进行研究。前五张载玻片标记为 1-1、1-2、1-3、1-4 和 1-5。第一张切下的切片置于 1-1 载玻片的左上角（当磨砂面向下时，此位置为载玻片的右上角）；第二张切片置于 1-2 载玻片上， 等等。 第五个切片置于1-5号载玻片上。第六个切片置于1-1...

心血管疾病仍然是美国死亡和残疾的首要原因，2011年导致了美国超过30%的死亡病例1。美国心脏协会的最新统计数据显示，超过三分之一的美国人患有一种或多种类型的心血管疾病。心血管研究在深入理解该疾病方面持续取得进展，但随着人口老龄化加剧，继续推进这些研究工作显得尤为迫切。肾素-血管紧张素系统（RAS）在心血管系统的调节中起着核心作用，主要通过促进动脉粥样硬化、炎症反应、全身性血管收缩以及交感神经系统的激活来发挥作用（图1）2-8。
肾素-血管紧张素系统（RAS）是一种激素系统，当肾脏的球旁细胞在血压降低、交感神经刺激增强或致密斑处钠离子流量减少的情况下向血液中分泌肾素时，该系统即被激活。肾素将由肝脏合成的血管紧张素原代谢为血管紧张素I（Ang I）。随后，Ang I被主要存在于肺部和肾脏血管内皮细胞管腔侧的膜外酶——血管紧张素转换酶（ACE）进一步代谢，生成RAS的主要效应肽血管紧张素II（Ang II）。Ang II能够激活两种受体亚型：1型受体（AT1R）和2型受体（AT2R），二者均参与调节心血管系统、维持体液和电解质稳态，目前也被认为影响认知功能及神经退行性疾病过程8,9。已有研究报道，脑内存在一个局部的、脑特异性的RAS，可独立合成Ang II。在脑组织中，前体蛋白血管紧张素原由星形胶质细胞合成10，经一种类似肾素的酶3（可能是与前肾素受体结合的前肾素）转化为Ang I11，再由在脑内神经元细胞外表面高表达的血管紧张素转换酶转化为Ang II12。这种脑内生成的Ang II是脑内AT1和AT2受体的激动剂，这些受体与血液中的Ang II相互隔离。
尽管AT1R具有重要的生理功能，但它更为人所知的是在全身范围内的病理生理作用，主要影响心血管系统和肾脏（图2）。当血管紧张素II（Ang II）与AT1R结合时，会引起血管收缩，增加血流阻力并升高血压。此外，它还能促进醛固酮和血管加压素的合成与分泌，导致钠和水的重吸收增加。这些效应还可能诱发缺血性脑损伤和认知功能障碍，并与帕金森病、阿尔茨海默病、糖尿病相关，且最近被发现会影响学习和记忆能力13-15。肾素-血管紧张素系统（RAS）中存在一个反馈环路，即肾脏内球旁细胞上的AT1R可抑制肾素的分泌。有趣的是，AT2R通常对AT1R的作用起负向调节作用，引起血管舒张、神经突起生长、轴突再生、抗增殖以及神经保护等多种效应16-20。AT2R还被确认为抗高血压药物的作用靶点，最近也被发现是抗癌药物的潜在靶点21。通过定量密度测定受体放射自显影技术，确定血管紧张素II受体在不同组织中的定位和密度，以及各种治疗干预和疾病状态下对其的影响，将有助于揭示RAS在特定疾病中所起的作用。
受体放射自显影技术已被用作一种有效方法超过30年，用于在多种实验条件下指示血管紧张素II受体及其他肾素-血管紧张素系统（RAS）组分在大鼠、小鼠、豚鼠、狗及人类的脑组织和其他组织中的存在22-34。定位脑内Ang II受体的重要性在于，可将功能神经解剖学应用于Ang II在脑内的作用，例如，下丘脑室旁核（PVN）中AT1R的存在提示Ang II在脑内具有刺激加压素、催产素或促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）释放，或激活交感神经系统的作用。因此，阻断AT1R的药物可能减轻与脑内RAS过度激活相关的某些由PVN介导的效应。正在进行的研究表明，使用AT1R拮抗剂可减少创伤后应激障碍（PTSD）诱导的CRH释放，并改善PTSD症状（Hurt et al.，已投稿待发表）。本示范性研究的目标区域包括在调节稳态、食欲/渴觉、睡眠、记忆和情绪反应中起重要作用的室旁核（PVN）、穹窿下器官（SFO）和杏仁核。这些区域通过在显微镜载玻片上收集脑的冠状切片，并用特异性抑制剂与针对Ang II受体的特异性放射性配体共同处理切片进行检测。本研究中列出了所有材料和试剂以及建议的供应商，使用碘-125对Ang II受体拮抗剂——1- sarcosine1, 8-异亮氨酸8 Ang II（SI Ang II）进行放射性标记，随后通过高效液相色谱法（HPLC）纯化为单碘125I-SI Ang II，方法如前所述35。使用这种高比活性的放射性配体，可在放射性标记切片曝光于X光胶片后，可视化受体密度低、中等及高的区域。通过使用含有已知量碘-125的脑组织糊标准品对胶片进行校准，可定量特定区域中Ang II受体结合的精确量。在实验研究中，可将实验组受试者脑内的Ang II受体结合水平与对照组受试者进行比较，从而判断Ang II的作用是否因遗传状况、表型异常、疾病状态或药物处理而发生改变。这些知识可进一步应用于开发治疗与RAS失调相关疾病的疗法。另一种可识别受体结合位点但解剖分辨率较低的技术是结合实验，该方法使用来源于组织匀浆的组织膜制备物，将其与放射性配体在一系列浓度下孵育，以评估放射性配体的结合亲和力（解离常数KD）和组织的最大结合容量（Bmax）。
本文所述方案可分为五个主要部分：受体放射自显影组织切片制备；受体放射自显影；胶片曝光与显影；组织学染色；以及密度计量图像分析。

<table><tbody><tr><td>500 ml 塑料烧杯</td><td>Fisher</td><td>02-591-30</td><td></td></tr><tr><td>24 mm x 60 mm 盖玻片</td><td>Fisher</td><td>22-050-25</td><td></td></tr><tr><td>放射自显影成像胶片 24 mm × 30 cm</td><td>Carestream-Biomax MR 胶片</td><td>891-2560</td><td></td></tr><tr><td>杆菌肽（源自地衣芽孢杆菌）</td><td>Sigma</td><td>B-0125</td><td></td></tr><tr><td>8 x 11 纸板片</td><td>新月形插图板 #201</td><td>201</td><td></td></tr><tr><td>考普林罐</td><td>Fisher Scientific</td><td>E94</td><td></td></tr><tr><td>商用吹风机</td><td>Conair</td><td>Model SD6X</td><td></td></tr><tr><td>一次性培养管</td><td>Fisher</td><td>14-961-26</td><td></td></tr><tr><td>EDTA（二钠盐，二水合物）</td><td>USB公司</td><td>15-699</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher</td><td>16-100-210&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-19显影液的配方替代品</td><td>Photographers Formulary, Inc.&amp;nbsp;</td><td>01-0036</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Fisher</td><td>A38 SI-212</td><td></td></tr><tr><td>Histoprep/OCT</td><td>Fisher</td><td>SH75-125D</td><td></td></tr><tr><td>显影定影液</td><td>柯达</td><td>5160320</td><td></td></tr><tr><td>光漂白</td><td>柯达</td><td>1464502</td><td></td></tr><tr><td>氯沙坦</td><td>Fisher/Tocris</td><td>37-985-0</td><td></td></tr><tr><td>MCID&amp;trade; Core 7.0</td><td>MCID</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way 切片夹</td><td>VWR</td><td>48440-003</td><td></td></tr><tr><td>佩尔蒙特</td><td>Fisher</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>PD123319</td><td>Fisher</td><td>13-615-0</td><td></td></tr><tr><td>优质带电载玻片，精细磨边</td><td>首映显微镜载玻片</td><td>9308W</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;125&lt;/sup&gt;I 配体</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEX-248</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;125&lt;/sup&gt;SI-Ang II&amp;nbsp;</td><td>乔治·华盛顿大学</td><td>由 Speth 博士进行放射性碘标记</td><td></td></tr><tr><td>幻灯片邮寄袋</td><td>Fisher Scientific</td><td>HS15986</td><td></td></tr><tr><td>无水磷酸氢二钠（Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO4</td><td>Fisher</td><td>RDCS0750500</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠（无水）</td><td>Fisher</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>硫堇&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>T409-25</td><td></td></tr><tr><td>X射线暗盒（10 x 12）</td><td>Spectronics 公司</td><td>四格法</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

血管紧张素ii受体定位可视化的受体放射自显影实验方案

Receptor Autoradiography Protocol for the Localized Visualization of Angiotensin II Receptors

本方案描述了使用特异性放射性配体对大鼠脑内血管紧张素II（Ang II）受体进行受体自显影定位，以研究Ang II在大鼠脑中的受体结合模式。
采集组织样本并保存于 -80 °C。使用冷冻切片机对组织（脑组织）进行冠状切片，并将切片 thaw-mount 到带电荷的载玻片上。将载玻片上的组织切片与 125I-SI-Ang II 孵育，以放射性标记 Ang II 受体。相邻的载玻片分为两组：一组用于检测“非特异性结合”（NSP），在含有受体饱和浓度的非放射性标记 Ang II 或 AT1 Ang II 受体亚型（AT1R）选择性拮抗剂的条件下进行；另一组用于检测“总结合”（total binding），不添加 AT1R 拮抗剂。在孵育缓冲液中同时加入饱和浓度的 AT2 Ang II 受体亚型（AT2R）拮抗剂（PD123319，10 µM），以限制 125I-SI-Ang II 仅与 AT1R 亚型结合。在约 22 °C 下进行 30 分钟预孵育，NSP 组载玻片暴露于 10 µM PD123319 和氯沙坦（losartan），而“总结合”组载玻片仅暴露于 10 µM PD123319。随后，载玻片在含有 PD123319 的缓冲液中与 125I-SI-Ang II 孵育用于“总结合”检测，或在含有 PD123319 和氯沙坦的缓冲液中孵育用于 NSP 检测，之后用缓冲液多次“洗涤”，再用水冲洗以去除盐分和非特异性结合的放射性配体。载玻片经吹干后，置于专用胶片和暗盒中进行放射自显影。胶片显影后，图像被扫描进入计算机，使用专有成像系统和电子表格软件进行可视化及定量密度分析。另设一组载玻片进行硫堇染色，用于组织学比较。
使用受体放射自显影技术的优势在于能够可视化血管紧张素II受体 原位在组织标本的某一区域中，通过与相邻的组织学参考切片进行比较，解剖学上识别该组织区域。

肾素-血管紧张素系统代谢途径的概览如下所示 图1 以及对血管紧张素II受体亚型（AT1R 和 AT2R）的描述见于 图2. 图3 展示将冠状面脑切片转移至显微镜载玻片的过程，随后使用预设的受体放射自显影步骤进行处理 125I-SIAng II 浓度如图所示 图4. 图5 展示受体放射自显影中载玻片的干燥步骤，随后将其固定在纸板上，如图所示 图6， 随后进行发育。 表 2 列出用于载玻片组织切片硫堇染色步骤的试剂，该切片如文中所述 图7定量所用的校准标准单位根据检测日期确定，如图所示。 表3. 图8 显示建立标准曲线以关联 125I浓度（fmol/g组织）与胶片曝光（相对光密度）之间的关...

本文介绍了一种通过定量、密度测定法、体外受体放射自显影技术，使用碘-125标记的血管紧张素II类似物，来描述血管紧张素II 1型受体在大鼠脑内定位的实验方案。

血管紧张素II受体定位可视化的受体放射自显影实验方案

本方案描述了使用特异性结合血管紧张素II（Ang II）受体的放射性配体，研究血管紧张素II在大鼠脑内受体结合模式的方法。

本实验的总体目标是利用受体放射自显影技术及脑结构的组织学鉴定方法，在脑切片中对血管紧张素II受体的表达进行解剖定位和定量分析。该方法可确定血管紧张素II影响行为、认知功能及心血管系统的脑区，为开发治疗神经退行性疾病和心血管疾病的新疗法提供依据。该技术的主要优势在于兼具定量与定性分析能力，并且相较于其他方法，能够更特异性地识别血管紧张素II的功能性受体。该方法还可用于表征体内其他激素受体系统的功能，例如与滥用药物相关的受体。在收获后立即把脑组织放入模拟颅腔内部的脑模具中，并用铝箔包裹模具，于零下20摄氏度保存。30分钟后，将组织转移至可密封的冷冻储存袋中，并将袋子存放在零下80摄氏度条件下。切片前，轻轻将脑组织从脑模具中取出。为进行脑组织切片，将待测样本转移至设定温度为零下10至零下18摄氏度的冷冻切片机中。当组织温度与切片机环境达到平衡后，使用含乙二醇和树脂的包埋介质，将样本的一小部分垂直包埋于组织固定头中，以便进行冠状面切片。将组织装入切片机，并牢固地固定装置，然后以所需的厚度开始切取脑组织，再将切片以垂直方向贴附于载玻片上，以增加组织与载玻片的接触表面积。按连续的五片一组收集切片。当所有切片收集完毕后，让载玻片在空气中干燥最多一小时。然后将样品放入塑料载片盒中，并置于自封式冷冻袋内，于-20摄氏度保存。为进行放射性标记，从每组五张载片中取出第一张和第二张，装入市售或3D打印的载片夹中。编号为“-1”的载片用于非特异性处理组，编号为“-2”的载片用于总处理组。将载玻片倒置于适当的预孵育科布林瓶中，每瓶含35至40毫升室温AM5溶液及相应的抑制剂。同时处理多组载玻片可能造成操作混乱，因此必须每隔四分钟将载玻片放入预孵育瓶中，以确保干燥步骤时无时间重叠。孵育30分钟后，将切片转移至含有10毫升AM5的孵育切片邮寄盒中，AM5中需添加适当浓度的I125 SI血管紧张素II以及相应处理组的抑制剂，在室温下孵育60至90分钟。确定125I SI Ang II的精确浓度对于实现不同天数之间血管紧张素II受体的可比性至关重要。孵育结束后，将切片重新放回切片夹中，用封闭液封闭切片，并在两个分别装有400毫升蒸馏水的容器中轻轻摇晃1至2秒。第二次水洗后，用30至40毫升的AM5溶液依次冲洗载玻片，每次一分钟，共冲洗四次。第四次冲洗后，将切片在四次更换的冰冻蒸馏水中轻轻涡旋1至2秒。然后使用四台吹风机，以不同角度设置，用冷风干燥载玻片4分钟。待所有切片完全干燥后，将载玻片转移至一张纸巾上。然后使用双面胶带将载玻片（组织面向上）固定在用于X射线胶片曝光的硬纸板上，并确保每组至少包含一个碘-125校准标准品载玻片。在暗室中进行胶片曝光时，将贴好载玻片的纸板放入暗盒（strap back X-ray cassette）内，然后关闭灯光。打开安全灯，小心取出一盒X射线胶片。取一张胶片，光面朝上，锯齿边位于右下角，放置在暗盒内的玻片上方。然后小心合上暗盒，拧紧锁条以避光，并将暗盒保存于-20摄氏度环境中。在适当的曝光时间后，将胶片转移至显影液中显影2分钟，随后在停显液中处理30秒，再用含乙酸的双蒸水冲洗，接着在定影液中处理5分钟。将胶片置于流动水槽中漂洗20分钟。将其放入润湿剂中约10秒，然后悬挂晾干。进行脑组织切片的组织学分析时，将负三度保存的切片置于载玻片架中解冻。随后，用去离子水洗涤切片1分钟，接着在硫堇染色液中孵育10分钟，并在一份去离子水容器中快速浸洗三次。再将载玻片浸入去离子水中额外洗涤30秒。然后按照所示步骤依次用乙醇进行洗涤。在最后一次100%乙醇洗涤后，将切片先后置于两个盛有二甲苯的容器中，分别洗涤3分钟和5分钟。第二次二甲苯洗涤结束后，逐个在切片的上边缘覆盖一层树脂基、无机溶剂封片介质。将24 mm × 60 mm的盖玻片固定到载玻片上，室温干燥48小时。随后以2400 DPI灰度扫描载玻片和胶片并导入计算机。为通过密度测定法分析胶片，扫描后需根据经验在每张胶片上圈定目标区域。这是在图像分析程序中打开扫描胶片后生成的伪彩色图像。测量时应包括密度、扫描区域和总靶标区域。调整扫描区域标线，确保每个感兴趣区域均位于高亮显示的参数范围内。然后将数据导出至电子表格，以确定每个样本中存在的特异性结合。定量所用的校准标准单位根据实验进行的日期确定。扫描胶片后，利用校准值根据该特定胶片的碘-125标准品不同浓度生成标准曲线。为确保准确性，校准值和标准值均以三份平行样记录。通过将每组数据分配至相应的亚组，可明确区分非特异性结合组与总结合组以及组织标签。应通过调整参数将较高阈值设为从红色到黑色，而较低阈值应设在接近零的位置，以便更准确地测量整个扫描感兴趣区域。例如，在此将下丘脑室旁核在总结合组与非特异性结合组中的最终测量面积与硫堇染色切片进行比较，以进行解剖学确认。非特异性结合是指在存在饱和浓度的非放射性血管紧张素I受体配体条件下，放射性配体与非血管紧张素受体结合的量；而总结合是指在不存在非放射性血管紧张素I受体配体时，放射性配体的结合量。随后，可通过从总结合值中减去非特异性结合值，得到血管紧张素I受体的特异性结合值。一旦掌握，受体放射自显影步骤可在约四小时内完成，而每张胶片的显影步骤约需30分钟。在执行该操作过程中，重要的是要准确记录时间，以确保所有载玻片的孵育、漂洗和干燥时间完全一致。完成该操作后，可进一步开展脑形态学研究，以评估显示血管紧张素II受体表达的脑区大小变化。该技术为研究受体药理学的科研人员提供了途径，使其能够确定不同脑区如何受到各种神经激素、神经递质和药物的影响。观看本视频后，您应能够充分理解如何成功地进行受体放射自显影分析、组织学染色切片，并评估放射自显影图像以定位特定脑区中的受体。请务必注意，操作放射性物质可能存在危险，应始终采取适当的防护措施，例如正确屏蔽、密闭操作、暴露监测和妥善处理，以避免放射性污染。

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