发展与表征体外微血管网络和内皮的定量测量的[Ca ²⁺]_我和一氧化氮含量

该程序的总体目标是开发一种微流体装置，使内皮细胞能够在生理相关的剪切流下生长，并测量激动剂诱导的钙和一氧化氮产生的变化。该信息可以通过验证体外微血管模型并弥合体内和体外研究之间的差距，帮助推进微血管研究的未来。该技术的主要优点是微通道的多功能设计，可模拟各种脉管系统，并且它们改善了细胞培养环境，比原始培养物的条件静态更接近体内。

演示这些程序的是我实验室的 Sulei 和 Xiang。在开始之前，使用标准光刻技术创建母模和软光刻技术来制造 PDMS 微通道器件，如文本协议中所述。要准备微通道设备，首先用一块薄薄的 PDMS 盖住入口和出口，然后将设备放入装有湿纸巾的培养皿中。

然后，用 Parafilm 包裹培养皿，并在紫外线下对设备消毒至少三个小时。下一步是应用纤连蛋白。首先，在入口处滴入 30 至 50 微升 PBS。

在出口处产生真空以冲洗设备。接下来，在入口处滴一滴每毫升 100 微克的纤连蛋白。在出口处产生真空以加载纤连蛋白溶液。

接下来，盖上入口和出口。再次用 Parafilm 包裹培养皿，并在 4 摄氏度下孵育设备过夜。第二天，用 PBS 手动冲洗设备 3 次。

然后，在其中加入 30 至 50 微升细胞培养基，并在 37 摄氏度的培养箱中预热设备至少 15 分钟。首先将 HUVEC 混合到含有 8% 葡聚糖的 HUVEC 培养基中，每毫升 2 至 400 万个细胞。需要葡聚糖来增加粘度，从而改善细胞接种。

接下来，将 10 至 20 微升细胞放在入口处，并使用重力或玻璃巴斯德移液器在出口处的毛细管作用引入它们。接下来，将设备孵育 15 到 20 分钟。然后，在显微镜下检查接种状态。

如有必要，加载更多细胞以达到所需的细胞密度。一旦加载了足够的细胞，用正常、温暖的细胞培养基轻轻冲洗装置以去除葡聚糖。然后，在没有任何培养基灌注的情况下将装置培养 6 小时。

接下来，设置用于长期灌注的管道连接。将设备用胶带粘在培养皿上，然后用针头将入口管连接到注射器。将管路插入设备的入口和出口。

将出口管连接到废液收集器。现在，将培养皿和废物容器放入培养箱中。将带有长入口管的注射器连接到穿过培养箱门的外部灌注泵。

然后，根据实验设计设置灌注速率。通过良好控制的灌注，微血管网络中的培养可以维持长达两周。因此，它可以扩展到模拟细胞和血流动力学环境对不同生理和病理状况的长期研究。

要开始免疫染色，例如 VE-钙粘蛋白标记，首先在 4 摄氏度下用 2% 的多聚甲醛灌注 30 分钟来固定细胞。在进行一系列灌注以封闭、透化和用抗体染色后，将设备保持在 4 摄氏度，直到细胞成像。为了对细胞中的钙浓度进行成像，在 37 摄氏度下用每毫升 10 毫克白蛋白的林格溶液灌注装置 15 分钟。

接下来，在 37 摄氏度下用 5 微摩尔 Fluo-4 AM 灌注设备 40 分钟。然后，在 37 摄氏度下用白蛋白振铃液洗掉内腔结合的 Fluo-4 AM，持续 15 分钟。接下来，启动共聚焦系统，使用 Fluo-4 AM 进行细胞间钙水平成像。获取加载 Fluo-4 的微血管的图像。

收集基准图像 10 分钟。然后，用 10 微摩尔 ATP 连续灌注设备，并记录荧光强度的变化 20 分钟。为了对细胞中一氧化氮的产生进行成像，在 37 摄氏度下用白蛋白林格灌注装置 15 分钟。

然后，在 37 摄氏度下用 5 微摩尔 DAF-2 DA 灌注细胞约 35 至 40 分钟。接下来，设置荧光成像系统以测量 ATP 诱导的一氧化氮产生。记录基线 5 分钟，然后用 10 微摩尔 ATP 灌注设备，并以 1 分钟的间隔收集图像 30 分钟。

对于比色池一氧化氮测量，重要的是要了解强度曲线的分离适配器表示随时间累积的一氧化氮产生，而不是一氧化氮浓度。从单个细胞水平收集的图像中手动选择感兴趣的区域。每个 ROI 覆盖一个个体细胞的区域，这可以通过 floresense 轮廓表示。

量化 ATP 诱导的内皮钙和一氧化氮变化。通过计算 Fluo-4 的 floresense 强度的变化，减少组织背景。通过对 DAF-2 的 floresense 强度随时间进行第一次差分转换来量化一氧化二氮的产生速率。

器件中的微通道模式具有三级分支网络。进行了 3D 数值模拟，以估计 0.35 μL/min 流速下的剪切应力分布。如前所述，内皮细胞接种到网络中。

然后，标记 F-肌动蛋白和细胞核。同样，VE-钙粘蛋白也被染色。结果与完整小静脉中的 VE-钙粘蛋白表达相似。

接下来，检查 ATP 诱导的细胞内钙和一氧化氮产生的增加。如方案部分所述，使用 Fluo-4 AM 检查钙水平。如方案部分所述，使用 DAF-2 DA 监测一氧化氮的产生。

结果与单独灌注的完整小静脉的结果相当。高级技术在生物条件和动态流体环境中很容易且受到严格控制，这在传统的微技能技术中是不可能的。观看此视频后，您应该对如何制造设备以及进行钙和一氧化氮测量有很好的了解。

之后，这项技术为研究人员铺平了道路，不仅可以研究潜在的激动剂诱导，还可以为生物医学研究开辟更广泛的应用。