自动化脂双层膜的形成使用聚二甲基硅氧烷薄膜

该程序的总体目标是描述一种可用于研究使用聚二甲基硅氧烷薄膜的自动脂质双层形成的方法。这种方法可以帮助回答纳米生物传感器领域中关于膜-蛋白质相互作用的关键问题。该技术的主要优点是脂质双层形成是自动化且可重复的。

首先，通过将氯化钾、盐酸 tris 和 EDTA 混合在蒸馏水中来制备缓冲溶液。然后，将溶液的 PH 调整为 8.0。然后，使用 0.2 微米过滤器过滤溶液，并在 121 摄氏度下高压灭菌溶液 15 分钟。

接下来，通过将 3% 的脂质溶解在由 2 份十一烷和 8 份十六烷（按体积计）组成的混合物中，制备用于预涂的脂质溶液。使用旋转器将溶液搅拌过夜。此外，通过将 0.1% 的脂质溶解在体积为 2 份十一烷和 8 份十六烷的相同混合物中来制备用于膜形成的脂质溶液。

也将该溶液在旋转器上搅拌过夜。为了制备 PDMS 薄膜，请在混合杯中将 9 份预聚物与 1 份固化剂混合。将 5 克这种混合物放入培养皿中，以 800 rpm 的速度旋涂培养皿 10 秒钟，形成 200 至 250 微米厚的薄膜。

接下来，将培养皿放入真空干燥器中，抽出 100 毫托的真空吸尘器两小时以去除残留的气泡。然后，将薄膜在 70 摄氏度的烘箱中烘烤 5 小时，以聚合 PDMS。冷却后，将聚合的薄膜切成 2 厘米 x 2 厘米的正方形，并使用直径为 500 微米的冲头在正方形中心制作一个小孔。

然后，使用微量移液器用一微升 3% 脂质溶液预涂孔。要创建黑色脂质膜室，请使用 3D 绘图软件为室设计两个对称块。然后，使用一块 PTFE 和 CNC 机器制造腔室。

要组装腔室，请将预涂漆的 PDMS 薄膜放在两个 PTFE 块之间，使 PDMS 薄膜上的孔径与腔室中的孔居中。使用盖玻片和真空润滑脂密封腔室的外边缘。密封后，使用螺母和螺栓固定组装好的腔室。

重要的是要确保腔室密封良好，以免液体泄漏。使用移液管，将 0.5 微升 0.1% 脂质溶液沉积到与腔室组装的 PDMS 薄膜的孔径上。然后，将腔室置于 10 摄氏度以下的阴凉环境中并存放起来，直到需要为止。

要形成具有加速自组装的黑色脂质膜，请从冰箱中取出腔室，并在腔室的每一侧加入 2 毫升缓冲溶液。将腔室放置 10 分钟，直到冷冻膜前体解冻。然后，将腔室放在微型纵器上，以精确控制相对于光源和显微镜的仰角。

使用卤素光纤照明器，照亮腔室的一侧，以增亮 PDMS 薄膜的孔径。在另一侧，将一个 20 倍物镜与光圈对齐，观察颜色变得比环形更亮的中心。对于电气测量，将 208 微米厚的银线放入次氯酸钠溶液中至少一分钟，以制备氯化银电极。

接下来，将电极连接到微电极放大器。然后，将氯化银电极放入腔室的每一侧，使其位于缓冲溶液中。使用电生理学软件，在膜上施加 10 毫伏的三角波形式以获得方波。

通过单击 record 按钮记录膜的电气特性。继续录制，直到观察到均匀的方波。然后，单击黑色方形图标退出录制。

可以采用两种方法将短杆菌素 A 掺入脂质双层中。首先，在将脂质溶液涂布到 PDMS 薄膜的孔径上之前，可以将短杆菌素 A 直接添加到脂质溶液中。其次，当脂质双层形成时，可以将短杆菌素 A 溶液添加到腔室中。

为了观察短杆菌素 A 通道活性，以 5 kHz 的采样率在膜上施加 100 毫伏电压，以测量膜的保持电位。像以前一样，通过单击 record 按钮来记录电气属性。如显示离子通道活性，请继续记录，直到观察到各种电流跳跃，以确认离子通道掺入。

确认后，单击黑色方块图标退出录制。记录完成后，使用电生理学软件用 100 赫兹的低通贝塞尔滤波器过滤数据。观察过滤后的保持电位数据中的电流跳跃。

这些跳跃代表短短杆菌素 A 离子通道的二聚化。当冷冻膜前体在室温下解冻时，由于疏水性溶剂被提取到 PDMS 薄膜中，从而促进了脂质双层的形成。这一系列图像显示了脂质双层的形成，当从冷冻形式加热时，它会自组装。

在这里，电导说明了杀短杆菌素 A 的掺入和二聚化，二聚化后，杀短杆菌素 A 形成离子通道，电导水平跃升至 28 皮秒，这与之前报告的结果一致，并显示这种抗生素立即掺入双层中。我们的膜形成技术为细胞膜和纳米通道研究提供了强大的工具，而传统技术的实际应用潜力有限。我们的系统不需要膜形成或离子通道掺入的专业知识，因此非常适合药物筛选和生物传感应用。