使用聚二甲基硅氧烷薄膜自动形成脂双层膜

本实验的总体目标是描述一种利用聚二甲基硅氧烷薄膜研究自动形成脂双层的方法。该方法有助于回答纳米生物传感器领域中关于膜蛋白相互作用的关键问题。该技术的主要优势在于脂双层的形成过程可实现自动化且具有良好的可重复性。

首先，通过将氯化钾、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris hydrochloride）和 EDTA 溶解于蒸馏水中来配制缓冲液。然后，将溶液的 pH 调整至 8.0。接着，使用 0.2 微米滤器过滤溶液，并在 121 摄氏度下高压灭菌 15 分钟。

接下来，通过将3%的脂质溶解于由两份十一烷和八份十六烷按体积比组成的混合液中，制备用于预涂覆的脂质溶液。使用旋转仪将该溶液搅拌过夜。同时，通过将0.1%的脂质溶解于相同比例的两份十一烷和八份十六烷的混合液中，制备用于膜形成的脂质溶液。

将此溶液置于旋转仪上同样搅拌过夜。为了制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）薄膜，将九份预聚物与一份固化剂在混合杯中混合。取5克该混合物放入培养皿中，以800 rpm转速旋涂10秒，形成厚度为200至250微米的薄膜。

接下来，将培养皿放入真空干燥器中，抽真空至100毫托，持续两小时，以去除残留的气泡。然后，在70摄氏度的烘箱中加热固化该薄膜五小时，使PDMS聚合。冷却后，将聚合好的薄膜切成2厘米×2厘米的正方形，并使用直径为500微米的打孔器在正方形中心打一个小孔。

然后，使用微量移液器将1微升3%脂质溶液预涂在孔隙上。为了制备黑脂膜腔室，使用3D绘图软件设计两个对称的腔室模块。接着，使用聚四氟乙烯（PTFE）块材和数控机床（CNC）加工该腔室。

组装腔室时，将预涂覆的PDMS薄膜置于两个PTFE块之间，使PDMS薄膜上的孔与腔室中的孔对中。使用盖玻片和真空脂密封腔室的外缘。密封完成后，用螺母和螺栓固定组装好的腔室。

必须确保腔室的密封性良好，以防液体泄漏。使用移液器将 0.5 µL 的 0.1%脂质溶液滴加到已与腔室组装好的 PDMS 薄膜的小孔上。然后，将腔室置于低于 10 °C 的冷却环境中，保存至需要使用时为止。

为了快速自组装形成黑脂膜，将样品室从冰箱中取出，并在样品室的两侧各加入两毫升缓冲液。将样品室静置10分钟，直至冷冻的膜前体完全融化。随后，将样品室放置于显微操作仪上，以便精确控制其相对于光源和显微镜的高度。

使用卤素光纤照明器，照亮腔室的一侧，以增强PDMS薄膜小孔的亮度。在另一侧，将20倍物镜对准小孔，观察中心区域，此处颜色比环状区域更亮。进行电学测量时，通过将直径为208微米的银丝浸入次氯酸钠溶液中至少一分钟，制备氯化银电极。

接下来，将电极连接到微电极放大器上。然后，将氯化银电极分别放入 chamber 的两侧，使其浸入缓冲液中。使用电生理学软件，在膜两侧施加一个 10 毫伏的三角波，以获得方波信号。

通过点击记录按钮来记录膜的电学特性。持续记录直至观察到均匀的方波，然后点击黑色正方形图标停止记录。

有两种方法可将短杆菌肽A掺入脂质双层中。第一种，可在将脂质溶液铺展到PDMS薄膜的孔洞之前，直接将短杆菌肽A加入脂质溶液中。第二种，可在脂质双层形成后，将短杆菌肽A溶液加入到腔室中。

为了观察短杆菌肽A通道活性，在膜两侧施加100毫伏电压，以5千赫兹的采样率测量膜的保持电位。通过点击记录按钮，如前所述记录电学特性。当显示出离子通道活性时，持续记录直至观察到多种电流跳跃，以确认离子通道的整合。

确认后，单击黑色方块图标停止录制。录制结束后，使用电生理学软件对数据进行低通贝塞尔滤波，截止频率为100赫兹。观察滤波后钳制电位数据中的电流跳跃。

这些跳跃代表了短杆菌肽A离子通道的二聚化过程。当冷冻的膜前体被移至室温解冻时，疏水性溶剂被PDMS薄膜萃取，从而促进了脂双层的形成。这一系列图像展示了脂双层的形成过程，该脂双层在从冷冻状态升温时发生自组装。

此处，电导率的变化说明了短杆菌肽A的嵌入及其二聚化过程。在二聚化后，短杆菌肽A形成离子通道，电导水平跃升至28皮西门子（pS），这与以往研究结果一致，表明该抗生素可迅速嵌入双层膜中。与传统技术在实际应用中潜力有限相比，我们的膜形成技术为细胞膜和纳米通道研究提供了强有力的工具。本系统在膜形成和离子通道嵌入方面均无需专业技术，因此非常适用于药物筛选和生物传感应用。