Name: 自动化脂双层膜的形成使用聚二甲基硅氧烷薄膜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 了解使用聚二甲基硅氧烷薄膜自动化形成脂质双层膜的方法，成功率超过80%，可在1小时内完成。该技术简化了膜蛋白相互作用研究，适用于纳米生物传感器领域。

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本研究工作得到了韩国国家研究基金会先锋研究中心项目（NRF-2012-0009575）和国家研究基金会资助项目（NRF-2012R1A1B4002413、NRF-2014R1A1A2059341）的支持。本研究工作还部分得到了仁荷大学研究基金的资助。

1. 溶液配制
<ol>
	<li>缓冲液的配制：
	<ol>
		<li>配制缓冲液：将1 M KCl（氯化钾）、10 mM Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷盐酸盐）和1 mM EDTA（乙二胺四乙酸）溶于蒸馏水中，并调节pH至8.0。</li>
		<li>使用 0.20 µm 滤器过滤溶液。为达到灭菌目的，将溶液在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>预涂脂质溶液的制备：
	<ol>
		<li>为配制用于预涂覆的脂质溶液，将3% DPhPC（1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱）脂质（w:v），按2:8比例混合 n-癸烷与十六烷（体积比）混合，使用旋转器搅拌过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于膜形成的脂质溶液制备：
	<ol>
		<li>为制备用于膜形成的脂质溶液，将0.1% DPhPC（1, 2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱）脂质（w:v），溶于体积比为2:8的角鲨烯与十六烷混合液中。使用旋转仪搅拌过夜。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. PDMS 薄膜的形成
<ol>
	<li>将PDMS与固化剂按9:1（w/w）的比例在混合杯中混合，制备PDMS预聚物。取5 g PDMS预聚物加入培养皿中，形成PDMS薄膜（厚度200–250 µm）。使用旋涂仪以800 rpm转速旋涂10秒，使PDMS预聚物均匀铺展成薄膜。</li>
	<li>将培养皿置于真空干燥器中，在100 mTorr压力下抽真空2小时，以去除气泡。为使预聚物薄膜聚合，在70 °C下烘烤5小时。</li>
	<li>为了制备方形PDMS薄膜，将固化的PDMS薄膜切割成2 x 2 cm2 方块。使用500 µm的微型打孔器在PDMS薄膜中心打孔。用3% DPhPC脂质溶液（溶于2:8的氯仿-甲醇混合液）预先涂覆孔洞 n-癸烷和十六烷</li>
</ol>
3. 腔室的制备与组装
<ol>
	<li>为制备双层脂膜（BLM）腔室，使用三维绘图软件设计两个对称的腔室部件，外部尺寸为 4 cm × 1.5 cm × 1 cm，内井尺寸为 1.5 cm × 1.3 cm × 0.8 cm17。</li>
	<li>使用聚四氟乙烯（PTFE）块并通过数控（CNC）机床加工腔室，同时遵循制造商的操作说明。</li>
</ol>
4. 反应室组装
<ol>
	<li>组装腔室时，将预涂覆的PDMS薄膜置于两个PTFE块之间，使PDMS薄膜上的孔与腔室中的孔对齐。</li>
	<li>使用涂有润滑脂的盖玻片密封腔室的外缘（便于光学观察）。用螺母和螺栓固定组装好的腔室。 
	注意：确保腔室密封良好，无液体泄漏。</li>
</ol>
5. 快速自组装膜前体（MPES）的形成
<ol>
	<li>使用移液器将 0.5 µl 的 0.1% DPhPC 脂质（溶于 2:8 n-十二烷:十六烷）滴加到与腔室组装好的 PDMS 薄膜孔径上。</li>
	<li>使用前，将腔室储存在低于 10 °C 的冰箱或冷冻柜中。</li>
</ol>
6. 膜的形成与验证
<ol>
	<li>使用 MPES 制备双层脂膜（BLM）时，先将腔室从冰箱中取出，并在腔室两侧各加入 2 ml 缓冲溶液。将腔室静置 &#60; 10 分钟，直至冷冻的膜前体完全融化。</li>
	<li>将腔室置于显微操作器上，以精确控制其相对于光源和显微镜的高度。使用卤素光纤光源照射腔室的一侧，作为照明光源，使 PDMS 薄膜上的小孔区域变亮，以便通过光学手段观察双层脂膜的形成过程。</li>
	<li>在另一侧，将数字显微镜垂直于光源方向放置，用于观察双层脂膜的形成（放大倍数为 200 倍）。</li>
	<li>为确认双层脂膜的形成，观察小孔中心区域，当该区域颜色比环状区域更亮时，表明膜已形成。</li>
</ol>
7. 电生理记录
<ol>
	<li>进行电学测量时，使用直径为 208 µm 的银丝制备 Ag/Cl 电极，并将其浸入次氯酸钠溶液中漂白，时间需超过 &#62; 1 分钟。将 Ag/Cl 电极分别插入 chamber 两侧，插入深度应足以使其浸入缓冲液中。</li>
	<li>将电极连接至微电极放大器。通过电生理学软件，在膜两侧施加 ±10 mV 的三角波电压，以获取方波信号。通过点击 V_clamp (mV) 上标注的箭头来设定施加的电压值。</li>
	<li>点击记录按钮（红色圆点图标）开始记录膜的电学特性。持续记录直至观察到稳定的方波信号，随后点击黑色方块图标停止记录。</li>
</ol>
8. 离子通道的整合
注意：当形成双层脂膜（BLM）时，短杆菌肽A（gA）会自发掺入，因为gA被直接加入脂质溶液中。
<ol>
	<li>为观察gA通道活性，以5 kHz的采样率在膜两侧施加100 mV电压，以测量膜的钳制电位。通过点击V_clamp（mV）上指示的箭头来设定施加的电压。</li>
	<li>通过点击记录按钮（红色圆点图标）记录gA整合的电学特性。持续记录直至观察到电流跳跃。通过点击黑色方块图标结束记录。</li>
	<li>电学数据采集完成后，使用电生理学软件将数据通过100 Hz的低通贝塞尔滤波器进行滤波。</li>
	<li>在滤波后的钳制电位数据中观察电流跳跃（每次电流跳跃约0.15 nS，代表一个gA离子通道的二聚化），以验证gA的整合。</li>
</ol>

<ol><li>Hanke, W., Schulue, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHanke%2C+W+%22Planar+lipid+bilayers%3A+methods+and+applications%22">Planar lipid bilayers: methods and applications</a>. , Academic Press. (2012).</li>
<li>Mirzabekov, T. A., Silberstein, A. Y., Kagan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+planar+lipid+bilayer+membranes+for+rapid+screening+of+membrane+active+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Use of planar lipid bilayer membranes for rapid screening of membrane active compounds.</a> Methods Enzymol. 294, 661-674 (1999).</li>
<li>Bayley, H., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+sensors+inspired+by+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stochastic sensors inspired by biology.</a> Nature. 413 (6852), 226-230 (2001).</li>
<li>Fang, Y., Lahiri, J., Picard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptor+microarrays+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug.+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptor microarrays for drug discovery.</a> Drug. Discov. Today. 8 (16), 755-761 (2003).</li>
<li>Majd, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+biological+pores+in+nanomedicine%2C+sensing%2C+and+nanoelectronics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Applications of biological pores in nanomedicine, sensing, and nanoelectronics.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 21 (4), 439-476 (2010).</li>
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<li>Ryu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+Ion+Channel+Activities+of+Gramicidin+A+in+the+Presence+of+Ionic+Liquids+Using+Model+Cell+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Investigation of Ion Channel Activities of Gramicidin A in the Presence of Ionic Liquids Using Model Cell Membranes.</a> Sci Rep. 5, (2015).</li>
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<li>Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+cell+membrane+structure+in+vitro+and+its+transformation+into+an+excitable+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system.</a> Nature. 194, 979-980 (1962).</li>
<li>Montal, M., Mueller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+bimolecular+membranes+from+lipid+monolayers+and+a+study+of+their+electrical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 69, 3561-3566 (1972).</li>
<li>Baaken, G., Sondermann, M., Schlemmer, C., Ruhe, J., Behrends, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+microelectrode-cavity+array+for+high-resolution+and+parallel+electrical+recording+of+membrane+ionic+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Planar microelectrode-cavity array for high-resolution and parallel electrical recording of membrane ionic currents.</a> Lab Chip. 8 (6), 938-944 (2008).</li>
<li>Costello, R., Peterson, I., Heptinstall, J., Byrne, N., Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+gel-bilayer+channel+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater.+Opt.+Electron%22%5BJournal%5D)">A robust gel-bilayer channel biosensor.</a> Adv. Mater. Opt. Electron. 8 (2), 47-52 (1998).</li>
<li>Ide, T., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+artificial+lipid+bilayer+formed+on+an+agarose-coated+glass+for+simultaneous+electrical+and+optical+measurement+of+single+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">An artificial lipid bilayer formed on an agarose-coated glass for simultaneous electrical and optical measurement of single ion channels.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 265 (2), 595-599 (1999).</li>
<li>Jeon, T. J., Malmstadt, N., Schmidt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel-encapsulated+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Hydrogel-encapsulated lipid membranes.</a> J Am Chem Soc. 128 (1), 42-43 (2006).</li>
<li>Malmstadt, N., Jeon, T. J., Schmidt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Lived+Planar+Lipid+Bilayer+Membranes+Anchored+to+an+In+Situ+Polymerized+Hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Long-Lived Planar Lipid Bilayer Membranes Anchored to an In Situ Polymerized Hydrogel.</a> Adv. Mater. 20 (1), 84-89 (2008).</li>
<li>Jeon, T. J., Poulos, J. L., Schmidt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+storable+and+shippable+lipid+bilayer+membrane+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Long-term storable and shippable lipid bilayer membrane platform.</a> Lab. Chip. 8 (10), 1742-1744 (2008).</li>
<li>Ryu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Lipid+Membrane+Formation+Using+a+Polydimethylsiloxane+Film+for+Ion+Channel+Measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Automated Lipid Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Film for Ion Channel Measurements.</a> Anal. Chem. 86 (18), 8910-8915 (2014).</li>
<li>Yaws, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYaws%2C+C+%22Chemical+Properties+Handbooks%3A+Physical%2C+Thermodynamic%2C+Environmental%2C+Transport%2C+Safety%2C+and+Health+Related+Properties+for+Organic+and+Inorganic+Chemicals%22">Chemical Properties Handbooks: Physical, Thermodynamic, Environmental, Transport, Safety, and Health Related Properties for Organic and Inorganic Chemicals</a>. , MC GRAW HILL HANDBOOKS. (1999).</li>
<li>Windholz, M., Budavari, S., Stroumtsos, L. Y., Fertig, M. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWindholz%2C+M+%22The+Merck+index.+An+encyclopedia+of+chemicals+and+drugs%22">The Merck index. An encyclopedia of chemicals and drugs</a>. , Merck & Co. (1976).</li>
<li>Miller, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+C+%22Ion+Channel+Reconstitution%22">Ion Channel Reconstitution</a>. , Springer Science & Business Media. (1986).</li>
<li>Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-state+substructure+of+single+chloride+channels+from+Torpedo+electroplax%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Open-state substructure of single chloride channels from Torpedo electroplax.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 299 (1097), 401-411 (1982).</li>
<li>Benz, R., Frohlich, O., Lauger, P., Montal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+capacity+of+black+lipid+films+and+of+lipid+bilayers+made+from+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Electrical capacity of black lipid films and of lipid bilayers made from monolayers.</a> Biochim. Biophys. Acta. 394 (3), 323-334 (1975).</li>
<li>Priel, A., Gil, Z., Moy, V. T., Magleby, K. L., Silberberg, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+requirements+for+membrane-glass+adhesion+and+giga+seal+formation+in+patch-clamp+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ionic requirements for membrane-glass adhesion and giga seal formation in patch-clamp recording.</a> Biophys. J. 92 (11), 3893-3900 (2007).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们的BLM形成技术为细胞膜和离子通道研究提供了一种强有力的工具，与传统技术相比，后者在工业应用方面潜力有限。我们采用PDMS薄膜开发了一种膜前体，并设计出一种可快速自组装的冷冻膜前体。
与传统的疏水膜形成方法（仅通过膜与脂质溶液之间的表面相互作用形成膜）不同20，在聚二甲基硅氧烷（PDMS）薄膜上，膜的变薄过程不仅依赖于表面相互作用，还涉及PDMS薄膜对溶剂的萃取作用。溶剂渗入PDMS的孔隙以及在PDMS薄膜表面的润湿，促进了脂质双层快速且一致地形成。此外，通过结合高黏度的角鲨烯和高凝固点的十六烷，可实现对膜形成时间的可控调节。利用该系统，我们能够在提高双层脂膜（BLM）形成成功率（&lt; 80%）的同时，显著缩短膜形成时间（&lt; 40 分钟）。由于使用了高凝固点的溶剂，膜前体可被储存和运输。此外，由于在加入缓冲液后膜的形成过程可自动进行，我们 Eliminated 对高度专业训练人员依赖的复杂成膜操作步骤。
在本实验方案中，制备了一种带有500 µm孔径的聚二甲基硅氧烷（PDMS）薄膜，并在该孔...

人工脂双层膜，又称黑脂膜（BLM），是阐明细胞膜和离子通道机制以及理解离子通道与离子/分子之间相互作用的重要工具。1-7 尽管膜片钳技术通常被视为细胞膜研究的金标准，但其操作繁琐，且对离子通道的测量需要技术娴熟的操作人员。8 虽然人工重建的脂双层膜已作为离子通道研究的替代工具出现，9,10 但其同样涉及复杂的操作流程和特定的专业知识。此外，这类膜易受机械扰动的影响。因此，迄今为止所提出的脂双层技术在实际应用中仍存在局限性。11
为了增强脂双层膜的稳定性和寿命，Costello 等12 以及 Ide 和 Yanagida13 设计了一种由水凝胶支撑的自支撑脂双层膜。尽管其寿命有所延长（&#60; 24 小时），但膜的机械强度并未得到改善。Jeon 等14 开发了一种水凝胶封装膜（HEM），实现了水凝胶与脂双层之间的紧密接触，从而显著延长了膜的寿命（可达数天）。为进一步延长 HEM 的使用寿命，Malmstadt 和 Jeon 等 通过原位共价偶联（in-situ covalent conjugation）构建了具有水凝胶-脂质结合的水凝胶封装膜（cgHEM）15。在这两种系统中，膜的寿命均显著增加（&#62; 10 天）。然而，这些膜形成系统仍不够稳定，无法进行储存或运输，因而难以推广使用，限制了脂双层技术的广泛应用。
脂质双层平台的开发主要围绕提高人工脂双层膜（BLMs）的稳定性和寿命展开。尽管近年来BLMs的寿命已得到显著改善，但由于缺乏可运输性和可储存性，其应用仍受到限制。为解决这些问题，Jeon 等 创建了一种可储存的膜系统，并引入了膜前体（MP）。16 为了构建一个MP，他们准备了一种混合物 n-含有3% DPhPC（1,2-二植烷酰基-磷脂酰胆碱）的癸烷和十六烷sn-甘油-3-磷脂酰胆碱）以调控脂质溶液的冰点，使其在约14 °C时冻结（低于室温，高于普通冰箱温度）。在本实验中，将微孔（MP）覆盖于聚四氟乙烯（PTFE）膜上的小孔处，随后在4 °C冰箱中冷冻。当MP被转移至室温时，MP解冻并自动形成脂双层，从而避免了传统膜形成过程中所需的专业技术。然而，由MP制备的双层脂膜（BLM）成功率仅为约27%，且成膜时间不一致（30分钟至24小时），限制了其实际应用。
在本研究中，采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）薄膜替代传统的疏水性薄膜（如聚四氟乙烯、聚甲醛、聚苯乙烯），以（a）控制制备时间，以及（b）提高双层脂膜（BLM）形成的成功率，该方法此前已被Ryu et al.17 报道。在此，由于PDMS具有多孔特性，可促进溶剂的萃取，从而促进膜的形成，并成功实现了对成膜时间的控制。在该系统中，随着脂质溶液被吸收进入PDMS薄膜，成膜时间保持一致。此外，由于在脂质溶液中添加了角鲨烯，减缓了溶剂向PDMS薄膜中的吸收速率，从而延长了膜的寿命。我们进行了光学和电学测量，以验证利用该技术形成的膜适用于离子通道研究。

<table><tbody><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>用于缓冲液溶液</td></tr><tr><td>三羟甲基氨基甲烷盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1185-53-1</td><td>用于缓冲液溶液</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60-00-4</td><td>用于缓冲液溶液</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;n&lt;/em&gt;-十二烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44074-U</td><td>用于脂质溶液</td></tr><tr><td>十六烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>544-76-3</td><td>用于脂质溶液</td></tr><tr><td>角鲨烯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3626</td><td>用于脂质溶液</td></tr><tr><td>短杆菌肽A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11029-61-1</td><td>膜蛋白</td></tr><tr><td>1,2-二植烷酰基-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-甘油-3-磷脂酰胆碱</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850356</td><td>用于膜形成</td></tr><tr><td>Sylgard 184a 和 184b 弹性体试剂盒</td><td>Dow Corning Asia</td><td></td><td>用于制备PDMS薄膜</td></tr><tr><td>0.2 &amp;mu;m 滤膜</td><td>Sartorius stedim</td><td>16534----------K</td><td>用于过滤缓冲液溶液</td></tr><tr><td>旋转混合仪</td><td>FinePCR</td><td>AG</td><td>用于均匀溶解脂质</td></tr><tr><td>高压灭菌器</td><td>Biofree</td><td>BF-60AC</td><td>用于灭菌缓冲液溶液</td></tr><tr><td>旋涂仪</td><td>Shinu Mst</td><td>SP-60P</td><td>用于涂布PDMS预聚物</td></tr><tr><td>真空干燥器</td><td>Welch</td><td>2042-22</td><td>用于去除PDMS预聚物中的气泡</td></tr><tr><td>500 &amp;mu;m&amp;nbsp;打孔器</td><td>Harris Uni-Core</td><td>0.5</td><td>用于在PDMS薄膜上创建孔径</td></tr><tr><td>数控机床</td><td>SME trading</td><td>SME 2518</td><td>用于制造膜形成腔室</td></tr><tr><td>卤素光纤照明器</td><td>Motic</td><td>MLC-150C</td><td>用于光学观察PDMS薄膜孔径的照明</td></tr><tr><td>数字显微镜</td><td>Digital blue</td><td>QX-5</td><td>用于光学观察脂双层膜的形成</td></tr><tr><td>电极</td><td>A-M Systems</td><td></td><td>用于电学监测膜的形成</td></tr><tr><td>微电极放大器（Axopatch放大器）</td><td>Axon Instruments</td><td>Axopatch 200B Amplifier</td><td>用于测量膜的电容（在文稿中描述为微电极放大器）</td></tr></tbody></table>

使用聚二甲基硅氧烷薄膜自动形成脂双层膜

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

人工脂双层膜（即黑脂膜，BLM）是研究离子通道、蛋白质相互作用以及生物传感器应用的有力工具。然而，传统的BLM制备技术存在多种缺陷，通常需要特定的专业知识和繁琐的操作流程。特别是，传统BLM的形成成功率较低，且成膜时间不稳定。本文展示了一种可储存、可运输的BLM制备系统，通过将传统使用的薄膜材料（如聚四氟乙烯、聚甲醛、聚苯乙烯）替换为聚二甲基硅氧烷（PDMS），实现了对膜减薄时间的可控性，并提高了BLM的形成效率。在本实验中，采用具有多孔结构的聚合物，例如PDMS薄膜。此外，与传统使用的低粘度溶剂不同，使用角鲨烯可通过PDMS缓慢吸收溶剂，从而实现对减薄时间的控制，并延长膜的寿命。同时，通过使用角鲨烯与十六烷的混合物，提高了脂质溶液的凝固点（约16 °C），并制备出可无限期储存且便于运输的膜前体。这些膜前体将BLM的形成时间缩短至&#60;1小时，并实现了约80%的BLM形成率。此外，利用短杆菌肽A进行的离子通道实验验证了该膜系统的可行性。

优化 MPES 溶液组成 
为成功从 MPES 重构脂双层膜，测试了不同组成的脂质与溶剂。含有 n-癸烷和十六烷并添加 3% DPhPC14 的 MP 体系，其成膜成功率较低（约 27%）。此外，由于 PDMS 膜会持续萃取脂质溶液，因此有必要优化溶剂组成以维持脂双层膜的完整性。因此，采用黏度为 12 cP（20 °C 时）18 的角鲨烯替代黏度为 0.92 cP（20 °C 时）19 的 n-癸烷。使用角鲨烯后，由于 PDMS 对溶剂的吸收速率降低，膜的稳定性和寿命均得到提高。表 1 比较了不同溶剂组成下膜的变薄时间、寿命和成膜成功率。
当 n-使用正癸烷时，由于聚二甲基硅氧烷（PDMS）薄膜快速吸收溶剂，膜的形成不一致，且膜通常在短时间内频繁破裂。而使用角鲨...

我们展示了一种可储存、可运输的脂双层形成系统。当冷冻的膜前体恢复至室温后，可在1小时内形成脂双层膜，成功率超过80%。该系统将减少与离子通道研究相关的繁琐操作和对专业技术的依赖。

人工脂双层膜，或称黑脂膜（BLM），是研究离子通道和蛋白质相互作用，以及……的有力工具。

本实验的总体目标是描述一种利用聚二甲基硅氧烷薄膜研究自动形成脂双层的方法。该方法有助于解答纳米生物传感器领域中关于膜蛋白相互作用的关键问题。该技术的主要优势在于脂双层的形成过程可实现自动化且具有良好的可重复性。首先，通过将氯化钾、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）和EDTA溶于蒸馏水中来配制缓冲液。然后，将溶液的pH值调节至8.0。接着，使用0.2微米滤器过滤溶液，并在121摄氏度下高压灭菌15分钟。接下来，通过将3%的脂质溶解于由两份十一烷和八份十六烷按体积比组成的混合液中，制备用于预涂覆的脂质溶液。使用旋转仪将该溶液搅拌过夜。同时，通过将0.1%的脂质溶解于相同比例的十一烷与十六烷混合液（两份十一烷和八份十六烷，按体积计）中，制备用于膜形成的脂质溶液。将此溶液置于旋转仪上同样搅拌过夜。为了制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）薄膜，将九份预聚物与一份固化剂在混合杯中混合。取五克该混合物放入培养皿中，以800 rpm转速旋涂10秒，形成厚度为200至250微米的薄膜。接下来，将培养皿放入真空干燥器中，抽真空至100毫托，持续两小时，以去除残留的气泡。然后，在70摄氏度的烘箱中加热固化该薄膜五小时，使PDMS聚合。冷却后，将聚合好的薄膜切成2厘米×2厘米的正方形，并使用直径为500微米的打孔器在正方形中心打一个小孔。然后，使用微量移液器将1 µL的3%脂质溶液预涂在孔隙上。为了制备黑脂膜腔室，使用3D绘图软件设计两个对称的腔室模块。随后，使用聚四氟乙烯（PTFE）块材和数控机床（CNC）加工该腔室。组装腔室时，将预涂覆的PDMS薄膜置于两个PTFE块之间，使PDMS薄膜上的孔与腔室中的孔对中。使用盖玻片和真空脂密封腔室的外缘。密封完成后，使用螺母和螺栓固定组装好的腔室。确保腔室的密封性良好，防止液体泄漏，这一点非常重要。使用移液器将 0.5 微升的 0.1%脂质溶液滴加到与腔室组装好的 PDMS 薄膜的孔洞处。然后，将腔室置于低于 10 摄氏度的低温环境中，并保存至需要使用时为止。为快速自组装形成黑脂膜，将样品室从冰箱中取出，并在样品室两侧各加入两毫升缓冲液。将样品室静置10分钟，直至冻结的膜前体完全融化。然后，将样品室放置于显微操作器上，以便精确控制其相对于光源和显微镜的高度。使用卤素光纤照明器，照射微流控腔室的一侧，以照亮PDMS薄膜上的孔径。在另一侧，将20倍物镜对准孔径，观察中心区域，此处颜色较环形区域更亮。进行电学测量时，将直径208微米的银丝浸入次氯酸钠溶液中至少一分钟，以制备氯化银电极。接下来，将电极连接到微电极放大器上。然后将氯化银电极分别置于腔室的两侧，使其浸入缓冲液中。使用电生理学软件，在膜两侧施加一个10毫伏的三角波，以获得方波信号。通过点击记录按钮来记录膜的电学特性。持续记录直至观察到均匀的方波，然后点击黑色方块图标停止记录。可采用两

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

自动化脂双层膜的形成使用聚二甲基硅氧烷薄膜

支撑脂双层和天然膜颗粒是可模拟细胞膜特性的便捷体系，可被整合到多种分析策略中。本文展示了一种制备微阵列的方法，该微阵列由涂覆有支撑脂双层的SiO2微珠、磷脂囊泡或天然膜颗粒组成。...

采用刮刀式组装方法制备生物膜微阵列

通过微流控喷射技术作用于液滴界面脂双层，可可靠地生成具有可控膜不对称性、跨膜蛋白整合及物质包封能力的囊泡。该技术可用于研究多种需要区室化生物分子的生物系统。...

利用微流控喷射技术生成脂质双层囊泡

我们提出了一种在固体基底上形成支持性脂双层的实验方案，该方法无需使用脂质体。我们展示了一种一步法，可在二氧化硅和金表面形成脂双层，并可制备富含胆固醇结构域的支持性膜，适用于多种生物应用。...

利用溶剂辅助脂质双层（SALB）法构建生物膜

微流控双乳液的生成通常涉及具有图案化润湿性的装置或定制制造的玻璃部件。本文介绍了一种全聚二甲基硅氧烷（PDMS）双乳液发生器的制备与测试方法，该发生器无需表面处理或复杂的制造工艺，能够生成低至14...

使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）同轴流动聚焦装置生成双重乳液

固相支撑、无蛋白质的双层磷脂膜（DLBM）可转化为复杂的动态脂质纳米管网络，可作为内质网的二维自下而上模型。...

人工脂质纳米管网络的自发生长与重组：内质网的自下而上模型

我们报道了一种通过在脂质双层中掺杂铜(II)...

水/气界面处掺杂疏水性有机分子的杂化脂质膜的自组装

本方案描述了模拟细胞的单脂质和多脂质囊泡、支撑脂双层以及悬浮脂双层的制备方法。这些 体外 模型可进行调整以包含多种脂质类型，并可用于研究各种分子和大分子间的相互作用。...

用于研究分子相互作用的模拟细胞支撑及悬浮脂双层模型的构建

本文介绍了一种利用单分子全内反射荧光（smTIRF）显微镜技术，在人工拥挤的脂质膜上对单个分子的结合、运动性和组装行为进行观测与分析的实验方案。...

单分子在聚合物拥挤的脂质膜上的扩散与组装

在此，开发了一种基于纳米棒支撑的脂质双层系统，以构建具有确定曲率的合成膜，从而实现对具有曲率感知能力的蛋白质进行表征 体外.

一种用于研究膜曲率感应蛋白的纳米棒支撑脂双层系统 体外

本方案描述了辛醇辅助脂质体组装（OLA）技术，这是一种用于生成生物相容性脂质体的微流控方法。OLA...

芯片上辛醇辅助脂质体组装用于生物工程

本方案通过引入硅油作为聚二甲基硅氧烷（PDMS）双铸法中PDMS层间的非粘附性屏障，改进了脱模过程。与等离子体处理或化学表面修饰方法不同，该方法无需使用专用或昂贵设备，因此是一种更易实现且成本更低的替代方案。...

通过硅油处理改进聚二甲基硅氧烷（PDMS）双铸法用于密集微结构复制

了解使用聚二甲基硅氧烷薄膜自动化形成脂质双层膜的方法，成功率超过80%，可在1小时内完成。该技术简化了膜蛋白相互作用研究，适用于纳米生物传感器领域。

使用聚二甲基硅氧烷薄膜自动形成脂双层膜

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