生物膜的微阵列用刮墨刀型组合方式形成
May 8th, 2014
支持的脂质双层和天然膜颗粒是方便的系统，可以近似细胞膜的性质和在各种分析战略中。这里，我们证明了制备微阵列支持的脂质双层包被的SiO 2的有孔玻璃珠，磷脂囊泡或天然膜颗粒组成的方法。
该程序的总体目标是使用简单的制备方法创建生物膜微阵列。这是通过首先用脂质双层膜包被二氧化硅珠来实现的。该程序的第二步是将脂质包被的珠子沉积在硅胶微孔底物上。
第三步是使用聚甲基 Suboxane 刮刀去除不在微孔中的珠子。最后一步是用荧光显微镜对脂质包被的微珠阵列进行成像。最终，该方法可用于使用阵列成像方法确定毒素脂质相互作用的结合常数。
该方法可用于创建球形支撑的脂质双层阵列和源自细胞的天然膜颗粒。与现有方法相比，该技术的主要优点是，除了制造微孔外，该技术不需要对底物或脂质膜进行化学修饰，即可创建空间定义的生物膜阵列。该技术的应用可以扩展到使用基于纳米度量金属空穴阵列的表面等离子体和共振对脂质蛋白相互作用进行无标记检测。
虽然这种方法可以提供对脂质蛋白相互作用的见解，但它也可以应用于其他系统，例如细胞粘附的研究，微孔阵列和刮刀制备在文本方案中详细说明。本视频从囊泡制备开始。首先在小玻璃瓶混合物中，成分脂质用于囊泡。
在该溶液中总共有半毫克脂质，在真空下将混合物干燥 6 小时。接下来，制成 0.1 摩尔的氯化钠溶液，向干脂质中加入半毫升。让混合物在室温下孵育过夜。
第二天，涡旋混合物以悬浮囊泡。然后在浴中对混合物进行超声处理 20 分钟，在室温下进行超声处理。超声处理后，通过 100 纳米聚碳酸酯膜过滤器挤出悬浮液。
将悬浮液通过挤出过滤器共 17 次。然后将挤出的囊泡储存在 4 摄氏度的玻璃瓶中。首先使用直径为 700 纳米的二氧化硅珠。
在 0.1 摩尔氯化钠中制备 150 亿颗珠子的悬浮液。涡旋悬浮液，然后以 1700 Gs 离心 20 分钟，弃去上清液。通过复苏重复洗涤，将珠子悬浮在另一毫升盐溶液中，然后再旋转 20 分钟。
然后第三次重复该过程以形成球形支持的脂质双层或 SSB。将 25 微升二氧化硅珠悬浮液与上一节的 200 微升囊泡悬浮液混合。涡旋混合物并点燃，在室温下孵育 1 小时后，以 1700 Gs 离心混合物 20 分钟。
丢弃上清液。沉淀物呈粉红色至破裂的囊泡，珠子上有行 DPPE。在 PH 值为 7.4 的 225 微升 PBS 中重悬。
重复离心和 Resus 悬浮步骤两次，以去除未破裂的囊泡并完成 SSB 的创建。将微孔阵列的晶片分成矩形块，每个块有四到六个阵列。接下来，涡旋，将上一节中的 SSLB 悬浮液转移到每个微孔阵列中，并将 10 微升转移到每个微孔阵列中。
等待一个小时，以便 SSB 稍后结算。用 PBS 轻轻洗涤阵列芯片，然后使用刮刀在浸没芯片表面滑动五次，将阵列浸入 PBS 中。这会去除不在微孔内的 SLP。
接下来，用镊子夹住每个阵列芯片，轻轻甩掉 PBS。然后将其转移到新鲜的 PBS 浴中。切屑的顶面必须保持湿润。
从浴缸中取出芯片，然后 W 离开。大多数 PBS 带有实验室擦拭。留下足够的 PBS 以保持阵列水合。
现在向阵列中加入 200 μL BSA 溶液以阻断非特异性结合。让阵列孵育一小时。稍后在加湿箱中，用微量移液管去除 BSA，并加入 200 微升霍乱毒素溶液。
然后将阵列放回加湿室。再等待一小时，然后用 PBS 清洗阵列，并用搭接擦拭擦掉多余的 PBS。然后将阵列芯片放在标准显微镜载玻片上，并将 24 x 40 毫米的方形盖玻片连接到阵列上并继续成像。
图像分析可以使用图像 J.自动粒子分析功能来完成。然后，对于每个数组，将各个 SSB 的平均强度汇总为直方图。使用概述的方法后，阵列上的 100 微米正方形区域显示 936 个 SSB。
同时计算占用率数据并在储存一周后生成 SSLB 荧光强度的直方图。以相同的方式重新分析相同的阵列，荧光强度或阵列占用率没有变化。使用概述的方法也可以用不同的识别标记物顺序沉积不同的 SSB。
第二个 SSB 存放在 10 号。第一批沉积的 SSB 的浓度。对于实验，将显示两个标记的叠加。
用含不同浓度的 GM one 的 SSB 制成阵列，并暴露于固定浓度的霍乱毒素中。还进行了逆运算以确定平衡解离常数。对于 GM 一。
霍乱毒素结合阵列也可以由天然生物膜制成，例如这种由髓鞘颗粒制成的阵列。它用亲脂性氟四 FM 1 43 标记。脂筏富含胆固醇和神经节苷脂，例如 GM one。
因此，相比之下，Alexa 4 88 偶联的霍乱毒素与脂筏微阵列紧密结合，荧光标记的剥离的 Aden 不与这些阵列结合。通过具有 250 微米通道的微流体芯片将髓鞘和脂质筏输送到微孔来构建阵列。它用抗少突胶质细胞 IgM 标记，髓鞘中发现的硫化 S 被标记，但脂筏没有。
Not 一旦准备好脂质 bator 涂层的珠子。如果执行得当，该技术可用于在创建天然膜颗粒阵列后一小时内制备阵列。其他方法，如纳米空穴表面等离子体和共振，可用于生物分子相互作用的无标记传感。
看完这个视频后，您应该对如何使用脂质胆汁层包被的微珠和天然膜颗粒创建生物膜阵列有很好的了解。
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概述
本文介绍了一种使用支持的脂质双层膜来创建生物膜微阵列的方法。该过程包括用脂质双层膜包覆硅胶珠并将其沉积到硅胶微孔基底上。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物物理学
- 分析化学
背景
- 支持的脂质双层膜模拟细胞膜的特性。
- 天然膜颗粒可用于各种分析策略。
- 微阵列促进生物分子相互作用的研究。
- 荧光显微镜用于成像阵列。
研究目的
- 开发一种简单的生物膜微阵列制备方法。
- 实现毒素-脂质相互作用结合常数的测定。
- 增强研究膜动力学的分析能力。
使用的方法
- 用脂质双层膜包覆硅胶珠。
- 将脂质包覆的珠子沉积到硅胶微孔基底上。
- 使用聚甲基亚硫醚刮板去除非微孔珠子。
- 用荧光显微镜成像脂质包覆的珠子阵列。
主要结果
- 成功制备了脂质双层包覆的微阵列。
- 展示了脂质包覆的珠子阵列的成像。
- 在研究脂质与毒素相互作用中的潜在应用。
- 为研究人员提供了一种简单有效的方法。
结论
- 该方法允许创建功能性生物膜微阵列。
- 它可用于神经科学和生物学中的各种分析应用。
- 未来的研究可以扩展使用该方法研究的相互作用。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables the creation of stable, high-density supported lipid bilayer arrays for studying biomolecular interactions without chemical modification of substrates or membranes. It supports target validation and assay development by providing a reproducible platform for quantifying ligand-receptor binding, such as cholera toxin to ganglioside GM1, with long-term stability and multiplexing capability. The approach reduces mechanistic ambiguity in early discovery by isolating membrane-specific interactions in a controlled, scalable format.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of lipid-protein interactions in a defined membrane environment to validate targets like ganglioside GM1.
- Operational Value: Supports functional target validation through quantitative binding measurements using fluorescence intensity histograms.
- Predictive Value: Facilitates lead identification by measuring binding constants in a disease-relevant membrane system.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized SLB arrays with >75% well occupancy and consistent fluorescent readouts for reliable compound screening.
- Reproducibility: Maintains signal stability over one week, enabling longitudinal assay performance and cross-run comparison.
- Multiplexing Capability: Allows serial deposition of different SSLBs to profile multiple lipid targets in a single array format.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses natural membrane particles (e.g., myelin-derived lipid rafts) to study cell-specific membrane components in pathophysiological contexts.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by enabling biomarker-aligned assays, such as ganglioside enrichment in lipid rafts.
- Risk De-risking: Supports go/no-go decisions by providing predictive binding data from native-like membranes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical profiling, particularly for membrane-associated targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of lipid-mediated mechanisms by isolating bilayer properties from cellular complexity.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs via fluorescence intensity of individual SSLBs for hit confirmation.
- Analytics: Enables binding constant determination through histogram analysis of SSB intensities under varying ligand concentrations.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by using natural membrane particles to reflect disease-relevant lipid composition.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for multiple targets via sequential deposition without substrate re-functionalization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target-ligand interactions by reducing false positives from non-specific binding.
- Operational Value: Ensures standardization and scalability through bead-based self-assembly and squeegee purification.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling high-content screening with minimal reagent consumption.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of membrane targets based on quantitative interaction data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid vesicle preparation, bead functionalization, and fluorescence microscopy.
- Depends on access to microfabricated microwell arrays and controlled extrusion equipment for vesicle sizing.
- Necessitates standardization of washing and blocking steps (e.g., BSA incubation) to minimize noise across arrays.
- Adaptation to different membrane systems requires optimization of bead-to-lipid ratios and incubation times.
- Practical limitation: Array occupancy is typically >75%, leaving some wells empty, which must be accounted for in data analysis.
