采用刮刀式组装方法制备生物膜微阵列
2014年5月8日
支撑脂双层和天然膜颗粒是可模拟细胞膜特性的便捷体系，可被整合到多种分析策略中。本文展示了一种制备微阵列的方法，该微阵列由涂覆有支撑脂双层的SiO2微珠、磷脂囊泡或天然膜颗粒组成。
本实验的总体目标是采用一种简单的制备方法来构建生物膜微阵列。首先，通过在二氧化硅微珠表面包被脂双层膜实现该目标；实验的第二步是将包被脂质的微珠沉积到硅胶微孔基底上。
第三步是使用聚甲基戊二烯刮刀去除未进入微孔的微珠。最后一步是采用荧光显微镜对脂质包被的微珠阵列进行成像。最终，该方法可用于通过阵列成像方法测定毒素与脂质相互作用的结合常数。
该方法可用于制备由球形支撑脂双层及源自细胞的天然膜颗粒组成的阵列。与现有方法相比，该技术的主要优势在于，除了微孔的制备外，无需对基底或脂质膜进行任何化学修饰，即可形成空间定位明确的生物膜阵列。该技术的应用可拓展至基于纳米金属孔阵列的表面等离子体共振，实现对脂质-蛋白质相互作用的无标记检测。
尽管该方法可用于研究脂质与蛋白质的相互作用，但也适用于其他系统，例如细胞黏着斑的研究。微孔阵列和刮刀制备的详细步骤见文本方案。本视频从囊泡制备开始。首先，在一个小玻璃小瓶中混合囊泡所需的组分脂质。
该溶液中含有总计0.5毫克脂质，在真空条件下干燥混合物6小时。接下来，配制0.1摩尔的氯化钠溶液，并加入0.5毫升至干燥的脂质中。将混合物在室温下孵育过夜。
第二天，涡旋混合物以重悬囊泡。然后在室温下将混合物置于水浴中超声处理20分钟。超声处理结束后，通过100纳米聚碳酸酯膜滤器挤出悬浮液。
将悬浮液总共通过挤出滤器17次。然后将挤出的囊泡储存在4°C的玻璃小瓶中。首先使用直径为700纳米的二氧化硅珠。
将150亿个微珠悬浮于0.1摩尔氯化钠溶液中。充分涡旋混匀后，在1700 ×g 条件下离心20分钟，弃去上清液。再次洗涤时，将微珠重悬于另1毫升盐溶液中，再以相同条件离心20分钟。
然后重复该过程第三次，以形成球形支撑脂质双层（SSBs）。取25 µL二氧化硅微球悬浮液与前一步骤中得到的200 µL囊泡悬浮液混合。涡旋混匀后，室温孵育1小时，随后在1700 ×g条件下离心20分钟。
弃去上清液。沉淀物呈粉红色，为破裂的囊泡与珠上的 DPPE 排列。将其重悬于 225 µL pH 7.4 的 PBS 中。
重复离心和重悬步骤两次，以去除未破裂的囊泡并完成单层支撑膜（SSB）的制备。将微孔阵列的基片分割成矩形小片，每片包含四到六个阵列。接着，涡旋振荡上一步骤所得的SSLB悬浮液，并向每个微孔阵列中加入10 µL。
一小时后等待SSB沉淀。用PBS轻轻清洗芯片阵列，并将阵列浸入PBS中，使用刮板在浸没的芯片表面滑动五次。此步骤可去除未进入微孔中的SLP。
接下来，用镊子夹住每块阵列芯片，轻轻抖去 PBS。然后将其转移至新鲜的 PBS 浴中。芯片的上表面必须保持湿润。
从浴槽中取出一块芯片并轻轻吸去水分。用实验室擦拭纸吸去大部分 PBS，保留足够的 PBS 以保持芯片的湿润。
现在向芯片中加入 200 微升 BSA 溶液，以阻断非特异性结合。让芯片孵育 1 小时。随后在湿化盒中用微量移液器吸除 BSA 溶液，并加入 200 微升霍乱毒素溶液。
然后将芯片放回加湿孵育室，再等待一小时，随后用 PBS 清洗芯片，并用擦镜纸吸去多余的 PBS。接着将芯片放置在标准显微镜载玻片上，在芯片上覆盖一块 24 × 40 毫米的方形盖玻片，随后进行成像。
可以使用 ImageJ 的自动颗粒分析功能进行图像分析。然后，针对每个芯片，将各个 SSB 的平均强度汇总为直方图。在使用上述方法后，芯片上一个 100 微米的方形区域显示出 936 个 SSB。
在储存一周后，计算了占据率数据并生成了SSLB荧光强度的直方图。随后以相同方式对同一芯片重新进行了分析，荧光强度和芯片占据率均未发生变化。利用所述方法还可实现不同SSB及其相应识别标记的顺序沉积。
第二次沉积的 SSBs 浓度为第一次沉积的 SSBs 浓度的十分之一。实验中展示了两种标记物的叠加图像。
采用不同浓度的 GM1 的 SSB 制备芯片，并暴露于固定浓度的霍乱毒素中。同时进行反向实验，以测定 GM1 的平衡解离常数。
霍乱毒素结合阵列也可由天然生物膜制成，例如由髓鞘颗粒制成的阵列。该阵列用亲脂性荧光染料FM 1-43标记。脂筏富含胆固醇和神经节苷脂（如GM1）。
因此，Alexa 488 标记的霍乱毒素可强烈结合脂筏微阵列，相比之下，荧光标记的去除了包膜的腺病毒则不能结合这些阵列。该阵列通过微流控芯片将髓鞘和脂筏递送至微孔中制备而成，芯片通道为 250 微米。阵列中的髓鞘使用抗少突胶质细胞 IgM 进行标记，并对髓鞘中含有的硫苷脂进行了标记，但脂筏未进行标记。
脂质体包被的微珠制备完成后，若操作得当，该技术可在一小时内完成阵列的制备。在天然膜颗粒阵列构建之后，可采用其他方法，如纳米孔表面等离子体共振，用于无标记检测生物分子相互作用。
观看本视频后，您应能充分理解如何利用脂质双层包被的微珠和天然膜颗粒来制备生物膜阵列。
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概述
本文介绍了一种利用支持性脂质双层制备生物膜微阵列的方法。该过程包括在二氧化硅微珠上包被脂质双层，并将其沉积到硅胶微孔基底上。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物物理学
- 分析化学
背景
- 支持性脂质双层可模拟细胞膜的特性。
- 天然膜颗粒可用于多种分析策略。
- 微阵列有助于研究生物分子相互作用。
- 荧光显微镜用于阵列成像。
研究目的
- 建立一种制备生物膜微阵列的简便方法。
- 实现对毒素-脂质相互作用结合常数的测定。
- 提升研究膜动力学的分析能力。
使用的方法
- 用脂质双层膜包覆二氧化硅微珠。
- 将包覆脂质的微珠沉积到硅胶微孔基底上。
- 使用聚甲基戊烯刮刀去除未进入微孔的微珠。
- 利用荧光显微镜对包覆脂质的微珠阵列进行成像。
主要结果
- 成功制备了脂双层包被的微阵列。
- 实现了脂质包被微珠阵列的成像。
- 在研究脂质与毒素相互作用方面具有潜在应用价值。
- 为研究人员提供了一种简单且有效的实验方法。
结论
- 该方法可用于制备功能性生物膜微阵列。
- 可应用于神经科学和生物学中的多种分析。
- 未来的研究可在此方法所研究的相互作用基础上进一步拓展。
常见问题
行业重要性概述
该方法能够创建稳定且高密度的支撑脂双层阵列，用于在无需对底物或膜进行化学修饰的情况下研究生物分子相互作用。通过提供可重复的定量配体-受体结合平台（例如霍乱毒素与神经节苷脂GM1的结合），并具备长期稳定性和多重检测能力，该方法支持靶点验证和检测方法的开发。该策略以一种可控且可扩展的形式分离膜特异性相互作用，从而在早期发现中减少机制上的模糊性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：可在定义明确的膜环境中研究脂质-蛋白质相互作用，从而验证如神经节苷脂 GM1 等靶点。
- 操作价值：通过荧光强度直方图进行定量结合测量，支持功能靶点的验证。
- 预测价值：在与疾病相关的膜系统中测定结合常数，有助于先导分子的识别。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪：可生成标准化的SLB阵列，孔板占有率超过75%，且荧光信号读数一致，适用于可靠的化合物筛选。
- 可重复性：信号稳定性可维持一周以上，支持长期检测性能评估及不同运行间的比较。
- 多重检测能力：支持不同SSLB的连续点样，可在单一阵列格式中同时分析多个脂质靶点。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：利用天然膜颗粒（例如，髓鞘来源的脂筏）研究病理生理环境中的细胞特异性膜组分。
- 转化连续性：通过实现与生物标志物一致的检测方法（如脂筏中神经节苷脂的富集），连接发现阶段与临床前研究。
- 风险评估：通过提供来自类天然膜的预测性结合数据，支持决策是否推进项目的判断。
流程与工作流整合
该方法适用于从靶点验证到先导化合物发现，再到临床前特征分析的整个发现流程，尤其适用于膜相关靶点。
- 发现生物学：通过将双层膜特性与细胞复杂性分离，支持对脂质介导机制的假设验证。
- 筛选：通过单个固态支持脂双层（SSLB）的荧光强度提供即用型、定量的检测输出，用于确认阳性结果。
- 分析：通过在不同配体浓度下对固态支持膜（SSB）强度进行直方图分析，实现结合常数的测定。
- 转化研究：通过使用天然膜颗粒以反映与疾病相关的脂质组成，连接至临床前验证。
- 企业级复用：通过无需基底重新功能化的连续沉积方式，可作为多个靶点的可重复使用平台。
运营与企业影响
- 科学价值：通过减少非特异性结合带来的假阳性，提高对靶点-配体相互作用的预测可靠性。
- 操作价值：通过基于微珠的自组装和刮刀纯化，确保实验的标准化和可扩展性。
- 战略价值：通过在最小试剂消耗下实现高内涵筛选，提升资本使用效率。
- 项目组合影响：基于定量相互作用数据，支持对膜靶点进行风险调整后的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备脂质囊泡制备、微珠功能化以及荧光显微镜技术方面的专业知识。
- 依赖于微加工的微孔阵列以及用于囊泡尺寸控制的挤出设备。
- 需要标准化洗涤和封闭步骤（例如，BSA孵育），以尽量减少阵列间的背景噪声。
- 应用于不同膜系统时，需优化微珠与脂质的比例及孵育时间。
- 实际限制：阵列占用率通常高于75%，部分孔位为空，数据分析时必须对此进行校正。
