Name: 生物膜的微阵列用刮墨刀型组合方式形成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-08T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 学习利用刮墨刀型组合方式制备生物膜微阵列的方法，通过将脂质双层包覆的二氧化硅微珠沉积于硅胶微孔基底，实现毒素-脂质相互作用结合常数的测定与膜动力学研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作获得了以下机构对 S.H.O. 的资助：美国国立卫生研究院（R01 GM092993）、美国国家科学基金会（NSF CAREER 奖项和 DBI 0964216）、美国海军研究办公室（ONR）青年研究员计划以及明尼苏达州生物技术和医学基因组学合作伙伴奖。器件的制备在明尼苏达大学纳米制造中心（NFC）完成，该中心通过国家纳米技术基础设施网络获得美国国家科学基金会的支持。本工作还获得了美国国立卫生研究院（NS048357、R21 NS073684）、美国国家多发性硬化症协会（CA1060A11）、Applebaum 基金会、Hilton 基金会、Peterson 基金会、Sanford 基金会以及 McNeilus 家族对 M.R. 的资助。作者感谢 Hyungsoon Im 在插图绘制方面的协助，以及 Shailabh Kumar 在扫描电子显微镜方面的协助。

1. 微孔阵列基底的微加工
<ol>
	<li>使用一片4英寸硅片，表面带有100 nm厚的热生长氧化层。</li>
	<li>在硅片上以4,000 rpm的转速旋涂SPR-955 0.7光刻胶，持续30秒。</li>
	<li>在热板上于115 °C下烘烤90秒。</li>
	<li>曝光光刻胶。
	<ol>
		<li>使用掩模版，形成周期为3 µm、呈六边形排列的1 µm孔阵列，阵列覆盖区域为2 mm × 2 mm。</li>
		<li>在i线步进曝光机中曝光硅片，步进尺寸为6 mm，曝光剂量为200 mJ/cm2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在热板上于115 °C下烘烤90秒。</li>
	<li>使用旋转显影液，在硅片上分两次滴加CD-26显影液，总显影时间为90秒。</li>
	<li>用超纯去离子水彻底冲洗，并用N2吹干。</li>
	<li>在反应离子刻蚀机中，以75 mTorr的压力，通入50 sccm Ar、25 sccm CF4和50 sccm CHF3，刻蚀氧化层6分钟。</li>
	<li>在ICP深槽反应离子刻蚀机中，以14 mTorr的压力，通入63 sccm C4F8、27 sccm SF6、40 sccm Ar和10 sccm O2，刻蚀硅材料2分钟。</li>
	<li>依次在丙酮、甲醇和异丙醇中清洗，以去除光刻胶残留。</li>
	<li>将样品浸入体积比为1:1的H2SO4:H2O2溶液中10分钟，以清洁表面。</li>
	<li>用超纯去离子水彻底冲洗，并用N2吹干。</li>
	<li>在250 °C下通过原子层沉积（ALD）沉积1,080 Å的Al2O3。</li>
</ol>
2. 聚二甲基硅氧烷刮刀的制备
<ol>
	<li>若条件允许，请在洁净室中操作；否则应在尽可能洁净的环境中进行。</li>
	<li>准备一个塑料培养皿（或其他洁净的一次性容器），其侧壁高度应≥13 mm。</li>
	<li>在该培养皿中，先倒入5 g PDMS固化剂，再加入50 g PDMS基础剂（或按1:10比例配制、足以基本填满培养皿的其他用量）。使用一次性塑料移液管或搅拌棒充分混合。</li>
	<li>将混合后的PDMS置于连接真空管线的真空腔室中，抽真空至混合物中无气泡逸出（约30分钟），以去除气泡。</li>
	<li>若PDMS尚未倒入培养皿，则将其小心倒入培养皿中，避免产生气泡。</li>
	<li>在加热板上于&#62;50 °C条件下固化过夜（提高温度可缩短时间）。</li>
	<li>使用新的或洁净的剃刀片，小心切割出一块约2.5 × 2.5 cm的矩形PDMS片，尽量保持上表面清洁。用洁净镊子将其剥离。通过一次性用力下压剃刀片，切去其中一边边缘（使该边长度减至1.5 cm），以获得尽可能锋利的上边缘（此边缘将用于刮刀工艺）。</li>
	<li>依次用丙酮、甲醇、异丙醇和超纯去离子水清洗，然后用洁净的氮气吹干。存放于洁净的培养皿中保存。</li>
</ol>
3. 囊泡的制备
<ol>
	<li>收集以下脂质储备液：25 mg/ml 卵磷脂酰胆碱（PC）和 1 mg/ml 1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-(丽丝胺罗丹明B磺酰基)铵盐（Rho-DPPE）的氯仿溶液，以及 0.5 mg/ml 单唾液酸神经节苷脂 GM1 的氯仿/甲醇（2:1 v/v）溶液。</li>
	<li>在小型玻璃小瓶中，使用玻璃注射器加入 18.9 µl 的 25 mg/ml PC、39.6 µl 的 0.5 mg/ml GM1 和 7.9 µl 的 1 mg/ml Rho-DPPE，配制成摩尔比例为 97 mol% PC、2 mol% GM1 和 1 mol% Rho-DPPE 的混合脂质溶液。</li>
	<li>注：Nair et al.25 的补充材料中提供了一个出色的可自定义 Excel 表格，可用于计算制备任意组分囊泡所需的脂质用量。</li>
	<li>将小瓶置于真空干燥器中，抽真空 6 小时以除去溶剂。</li>
	<li>配制 0.1 M NaCl 的水溶液。向含有干燥脂质膜的小瓶中加入 0.5 ml 的 0.1 M NaCl 溶液。</li>
	<li>将水相脂质混合物静置过夜。</li>
	<li>短暂涡旋混匀以形成囊泡悬液，然后在室温下使用浴式超声仪超声处理 20 分钟。</li>
	<li>将囊泡悬液通过孔径为 100 nm 的聚碳酸酯膜进行挤出。将悬液反复通过滤膜共 17 次。</li>
	<li>将挤出后的囊泡储存在玻璃小瓶中，于 4 °C 保存。</li>
</ol>
4. 球形支撑脂双层的形成
<ol>
	<li>收集直径为 700 nm 的 SiO2 微球。微球以蒸馏水配制，储存浓度为 1.4 × 1011 个微球/ml。</li>
	<li>在 1.5 ml 离心管中，将 107 µl 微球储存液加入 893 µl 的 0.1 M NaCl 溶液中，配制总体积为 1 ml、浓度为 1.5 × 1010 个微球/ml 的微球悬浮液。</li>
	<li>涡旋振荡悬浮液，确保充分混匀。</li>
	<li>在 1,700 × g 条件下离心 20 分钟，弃去上清液。将沉淀物重悬于 1 ml 的 0.1 M NaCl 溶液中。重复此步骤两次，以彻底清洗微球。</li>
	<li>为形成固态支持类脂双层膜（SSLB），在 1.5 ml 离心管中将 25 µl SiO2 微球悬浮液加入 200 µl 浓度为 1 mg/ml 的囊泡悬浮液中。涡旋混匀后，室温静置 1 小时。此时 SSLB 的浓度应为 1.7 × 109 个 SSLB/ml。</li>
	<li>在 1,700 × g 条件下离心 20 分钟，使 SSLB 沉淀。由于带有 Rho-DPPE 的囊泡在微球表面破裂，沉淀物应呈现粉红色。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀物重悬于 225 µl 磷酸盐缓冲液（PBS，pH = 7.4）中。重复步骤 4.6–4.7 两次，以去除 SSLB 悬浮液中未破裂的囊泡。</li>
</ol>
5. SSLB 阵列的组装
<ol>
	<li>切割微孔阵列晶圆，得到每片包含4-6个微孔阵列的矩形小片。</li>
	<li>涡旋混匀SSLB悬浮液，然后在每个微孔阵列上加入10 µl的SSLB悬浮液。静置1小时，使SSLB沉降到表面。</li>
	<li>用洗瓶中的PBS轻轻冲洗微孔阵列芯片，然后将其浸入浅皿中预先准备好的PBS浴液中。</li>
	<li>在浸没状态下，将PDMS刮刀轻轻贴合于微孔阵列芯片表面，并沿表面轻柔滑动5次，以去除未固定在微孔中的SSLB。</li>
	<li>用镊子夹住微孔阵列芯片，在PBS浴液中轻轻晃动，以去除残留的过量SSLB。</li>
	<li>迅速将芯片从刮刀浴液中取出，转移至新鲜的PBS浴液中保存备用。确保芯片上表面保持湿润，以维持SSLB的稳定性。</li>
</ol>
注意：上述组装方法可用于创建天然膜颗粒阵列，例如从小鼠脑组织中分离的髓鞘颗粒，或不含SiO2微珠支撑的磷脂囊泡。该研究工作在Wittenberg et al.21中已有详细描述，代表性结果如下所示。
6. 霍乱毒素结合实验
<ol>
	<li>在 PBS 中配制浓度为 2 mg/ml 的牛血清白蛋白 (BSA) 溶液。</li>
	<li>在含有 2 mg/ml BSA 的 PBS 中配制所需浓度的 Alexa 488 标记霍乱毒素 B 亚基溶液。</li>
	<li>将 SSLB 阵列芯片从 PBS 浸泡液中取出，用实验室擦拭纸吸去大部分 PBS 溶液，仅保留足够保持 SSLB 阵列湿润的少量 PBS。</li>
	<li>为防止非特异性结合，向 SSLB 阵列芯片中加入 200 µl 的 2 mg/ml BSA 溶液，在湿盒中静置 1 小时。</li>
	<li>使用微量移液器从 SSLB 阵列芯片表面移除 200 µl 溶液。</li>
	<li>向 SSLB 阵列芯片中加入 200 µl 霍乱毒素溶液，在湿盒中静置 1 小时。</li>
	<li>使用洗瓶中的 PBS 轻柔冲洗 SSLB 阵列芯片，以去除未结合的霍乱毒素。</li>
	<li>用实验室擦拭纸吸去多余的 PBS。成像前在芯片上覆盖 24 mm × 40 mm 的盖玻片。</li>
	<li>使用直立显微镜及适用于目标荧光染料的滤光片组对阵列进行成像。</li>
	<li>使用 ImageJ 软件的自动颗粒分析功能，分析阵列中各个 SSLB 的荧光强度。</li>
	<li>将各个 SSLB 的平均荧光强度汇总，绘制直方图以总结特定阵列上 SSLB 的强度分布。</li>
</ol>

<ol><li>Drews, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+discovery%3A+A+Historical+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Drug discovery: A Historical Perspective.</a> Science. 287 (5460), 1960-1964 (1126).</li>
<li>Cooper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Membrane+Receptor+Screening+and+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Advances in Membrane Receptor Screening and Analysis.</a> J. Mol. Recognit. 17 (4), 286-315 (2004).</li>
<li>Voskuhl, J., Ravoo, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Recognition+of+Bilayer+Besicles%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular Recognition of Bilayer Besicles.</a> Chem. Soc. Rev. 38 (2), 495-505 (2009).</li>
<li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+Vesicles%3A+Preparations+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Giant Vesicles: Preparations and Applications.</a> Chembiochem. 11 (7), 848-865 (1002).</li>
<li>Castellana, E. T., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+Supported+Lipid+Bilayers%3A+From+Biophysical+Studies+to+Sensor+Design%5BTitle%5D)+AND+%22Surf.+Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Solid Supported Lipid Bilayers: From Biophysical Studies to Sensor Design.</a> Surf. Sci. Rep. 61 (10), 429-444 (2006).</li>
<li>Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Steps+of+Supported+Bilayer+Formation+Probed+by+Single+Vesicle+Fluorescence+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Early Steps of Supported Bilayer Formation Probed by Single Vesicle Fluorescence Assays.</a> Biophys. J. 83 (6), 3371-3379 (2002).</li>
<li>Krysinski, P., Zebrowska, A., Michota, A., Bukowska, J., Becucci, L., Moncelli, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tethered+Mono-+and+Bilayer+Lipid+Membranes+on+Au+and+Hg%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Tethered Mono- and Bilayer Lipid Membranes on Au and Hg.</a> Langmuir. 17 (13), 3852-3857 (2001).</li>
<li>Li, L., Wang, H. F., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Coherent+anti-Stokes+Raman+Scattering+Imaging+of+Lipid+Distribution+in+Coexisting+Domains%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative Coherent anti-Stokes Raman Scattering Imaging of Lipid Distribution in Coexisting Domains.</a> Biophys. J. 89 (5), 3480-3490 (2005).</li>
<li>Richter, R. P., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Following+the+Formation+of+Supported+Lipid+Bilayers+on+Mica%3A+A+Study+Combining+AFM%2C+QCM-D%2C+and+Ellipsometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Following the Formation of Supported Lipid Bilayers on Mica: A Study Combining AFM, QCM-D, and Ellipsometry.</a> Biophys. J. 88 (5), 3422-3433 (2005).</li>
<li>Dahlin, A., Zäch, M., Rindzevicius, T., Käll, M., Sutherland, D. S., Höök, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+Surface+Plasmon+Resonance+Sensing+of+Lipid-Membrane-Mediated+Biorecognition+Events%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Localized Surface Plasmon Resonance Sensing of Lipid-Membrane-Mediated Biorecognition Events.</a> J. Am. Chem. Soc. 127 (14), 5043-5048 (2005).</li>
<li>Kraft, M. L., Weber, P. K., Longo, M. L., Hutcheon, I. D., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+Separation+of+Lipid+Membranes+Analyzed+with+High-Resolution+Secondary+Ion+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phase Separation of Lipid Membranes Analyzed with High-Resolution Secondary Ion Mass Spectrometry.</a> Science. 313 (5795), 1948-1951 (2006).</li>
<li>Groves, J. T., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropattern+Formation+in+Supported+Lipid+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Micropattern Formation in Supported Lipid Membranes.</a> Acc. Chem. Res. 35 (3), 149-157 (2002).</li>
<li>Bally, M., Bailey, K., Sugihara, K., Grieshaber, D., Vörös, J., Stadler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+and+Lipid+Bilayer+Arrays+Towards+Biosensing+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Liposome and Lipid Bilayer Arrays Towards Biosensing Applications.</a> Small. 6 (22), 2481-2497 (2010).</li>
<li>Groves, J. T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+Planar+Bilayers+in+Studies+on+Immune+Cell+Adhesion+and+Communication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Supported Planar Bilayers in Studies on Immune Cell Adhesion and Communication.</a> J. Immunol. Methods. 278 (1-2), 19-32 Forthcoming.</li>
<li>Yang, T. L., Jung, S. Y., Mao, H. B., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+Phospholipid+Bilayer-Coated+Microchannels+for+On-Chip+Immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fabrication of Phospholipid Bilayer-Coated Microchannels for On-Chip Immunoassays.</a> Anal. Chem. 73 (2), 165-169 (2001).</li>
<li>Groves, J. T., Ulman, N., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+Fluid+Lipid+Bilayers+on+Solid+Supports%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Micropatterning Fluid Lipid Bilayers on Solid Supports.</a> Science. 275 (5300), 651-653 (1997).</li>
<li>Hovis, J. S., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+and+Composition+Arrays+of+Supported+Lipid+Bilayers+by+Microcontact+Printing%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Patterning and Composition Arrays of Supported Lipid Bilayers by Microcontact Printing.</a> Langmuir. 17 (11), 3400-3405 (2001).</li>
<li>Yee, C. K., Amweg, M. L., Parikh, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Photochemical+Patterning+and+Refunctionalization+of+Supported+Phospholipid+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Direct Photochemical Patterning and Refunctionalization of Supported Phospholipid Bilayers.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (43), 13962-13972 (2004).</li>
<li>Kelly, C. V., Craighead, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanofabrication+for+the+Analysis+and+Manipulation+of+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Nanofabrication for the Analysis and Manipulation of Membranes.</a> Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1356-1366 (2012).</li>
<li>Wittenberg, N. J., Johnson, T. W., Oh, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Density+Arrays+of+Submicron+Spherical+Supported+Lipid+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-Density Arrays of Submicron Spherical Supported Lipid Bilayers.</a> Anal. Chem. 84 (19), 8207-8213 (2012).</li>
<li>Wittenberg, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+Assembly+of+Micro-+and+Nanoarrays+for+Sensing+with+Natural+Cell+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Facile Assembly of Micro- and Nanoarrays for Sensing with Natural Cell Membranes.</a> ACS Nano. 5 (9), 7555-7564 (2011).</li>
<li>Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembled+Microarrays+of+Attoliter+Molecular+Vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 42 (45), 5580-5583 (2003).</li>
<li>Kalyankar, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arraying+of+Intact+Liposomes+into+Chemically+Functionalized+Microwells%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Arraying of Intact Liposomes into Chemically Functionalized Microwells.</a> Langmuir. 22 (12), 5403-5411 (2006).</li>
<li>Dahlin, A. B., Jonsson, M. P., Höök, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+Self-Assembly+of+Single+Lipid+Vesicles+in+Nanoplasmonic+Apertures+in+Gold%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Specific Self-Assembly of Single Lipid Vesicles in Nanoplasmonic Apertures in Gold.</a> Adv. Mater. 20 (8), 1436-1442 (2008).</li>
<li>Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Patterned+Supported+Lipid+Membranes+to+Investigate+the+Role+of+Receptor+Organization+in+Intercellular+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Using Patterned Supported Lipid Membranes to Investigate the Role of Receptor Organization in Intercellular Signaling.</a> Nat. Protoc. 6 (4), 523-539 (2011).</li>
<li>Kuziemko, G. M., Stroh, M., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholera+Toxin+Binding+Affinity+and+Specificity+for+Gangliosides+Determined+by+Surface+Plasmon+Resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cholera Toxin Binding Affinity and Specificity for Gangliosides Determined by Surface Plasmon Resonance.</a> Biochemistry. 35 (20), 6375-6384 (1996).</li>
<li>Moran-Mirabal, J. M., Edel, J. B., Meyer, G. D., Throckmorton, D., Singh, A. K., Craighead, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micrometer-Sized+Supported+Lipid+Bilayer+Arrays+for+Bacterial+Toxin+Binding+Studies+Through+Total+Internal+Reflection+Fluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Micrometer-Sized Supported Lipid Bilayer Arrays for Bacterial Toxin Binding Studies Through Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy.</a> Biophys. J. 89 (1), 296-305 (2005).</li>
<li>Shi, J. J., Yang, T. L., Kataoka, S., Zhang, Y. J., Diaz, A. J., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM1+Clustering+Inhibits+Cholera+Toxin+Binding+in+Supported+Phospholipid+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">GM1 Clustering Inhibits Cholera Toxin Binding in Supported Phospholipid Membranes.</a> J. Am. Chem. Soc. 129 (18), 5954-5961 (2007).</li>
<li>Gill, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arrangement+of+Subunits+in+Cholera+Toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Arrangement of Subunits in Cholera Toxin.</a> Biochemistry. 15 (6), 1242-1248 (1021).</li>
<li>Weng, K. C., Kanter, J. L., Robinson, W. H., Frank, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+Supported+Lipid+Bilayers+Containing+Monosialoganglioside+GM1%3A+A+QCM-D+and+FRAP+study%5BTitle%5D)+AND+%22Colloid+Surface+B%22%5BJournal%5D)">Fluid Supported Lipid Bilayers Containing Monosialoganglioside GM1: A QCM-D and FRAP study.</a> Colloid Surface B. 50 (1), 76-84 (1016).</li>
<li>Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibre+Optic+Microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Fibre Optic Microarrays.</a> Chem. Soc. Rev. 39 (1), 38-50 (2010).</li>
<li>Bake, K. D., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+Spectroscopic+Detections%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiplexed Spectroscopic Detections.</a> Annu. Rev. Anal. Chem. 1 (1), 515-547 (2008).</li>
<li>Kundu, J., Levin, C. S., Halas, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Monitoring+of+Lipid+Transfer+Between+Vesicles+and+Hybrid+Bilayers+on+Au+Nanoshells+Using+Surface+Enhanced+Raman+Scattering+%28SERS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Real-Time Monitoring of Lipid Transfer Between Vesicles and Hybrid Bilayers on Au Nanoshells Using Surface Enhanced Raman Scattering (SERS).</a> Nanoscale. 1 (1), 114-117 (2009).</li>
<li>Junesch, J., Sannomiya, T., Dahlin, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Properties+of+Nanohole+Arrays+in+Metal-Dielectric+Double+Films+Prepared+by+Mask-on-Metal+Colloidal+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Optical Properties of Nanohole Arrays in Metal-Dielectric Double Films Prepared by Mask-on-Metal Colloidal Lithography.</a> ACS Nano. 6 (11), 10405-10415 (2012).</li>
<li>Wu, M., Holowka, D., Craighead, H. G., Baird, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Plasma+Membrane+Compartmentalization+with+Patterned+Lipid+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Visualization of Plasma Membrane Compartmentalization with Patterned Lipid Bilayers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (38), 13798-13803 (2004).</li>
<li>Hatzakis, N. S., Bhatia, V. K., Larsen, J., Madsen, K. L., Bolinger, P. Y., Kunding, A. H., Castillo, J., Gether, U., Hedegard, P., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+Curved+Membranes+Recruit+Amphipathic+Helices+and+Protein+Anchoring+Motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">How Curved Membranes Recruit Amphipathic Helices and Protein Anchoring Motifs.</a> Nat. Chem. Biol. 5 (11), 835-841 (2009).</li>
<li>Roizard, S., Danelon, C., Hassaine, G., Piguett, J., Schulze, K., Hovius, R., Tampe, R., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+G-Protein-Coupled+Receptors+in+Cell-Derived+Plasma+Membranes+Supported+on+Porous+Beads%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Activation of G-Protein-Coupled Receptors in Cell-Derived Plasma Membranes Supported on Porous Beads.</a> J. Am. Chem. Soc. 133 (42), 16868-16874 (2011).</li>
</ol>

作者声明无竞争性财务利益。

本研究显示，包被有支撑性脂双层的单分散 SiO2 微球可在微孔阵列中自组装排列，无需在脂双层或基底表面修饰靶向配体，且该阵列可用于表征毒素与脂质之间的相互作用。我们计算得到的 CTx/GM1 结合解离常数与 Winter et al. 之前的报道结果相当，后者采用脂质包被微球的胶体自组装方法测得解离常数约为 30 nM；鉴于文献中该值存在较大差异，我们的结果具有可比性。通过将数据拟合至 Hill-Waud 结合模型，我们确定 CTx/GM1 相互作用可能为多价结合，这与先前报道一致28。CTx 的 B 亚基（神经节苷脂结合亚基）以五聚体形式存在，其中每个五聚体单元均可结合一个 GM1 分子29；因此，考虑到 GM1 在支撑性脂双层（SLBs）中具有扩散流动性，多个亚基同时结合的现象并不意外30。
化学功能化微珠阵列已用于其他分析研究31。在这些类型的实验中，通常将微珠固定在刻蚀光纤末端形成的微孔中。通过混合微珠的不同亚群并同时将其固定在光纤末端，可在此配置...

脂质双分子层膜是自然界中的重要结构。细胞质膜和细胞器膜均由脂质双分子层构成，其中嵌入了多种维持生命所必需的分子。许多维持生命的关键过程发生在细胞表面，或由与脂质双分子层膜相关的分子介导。事实上，许多药物的作用靶点正是位于膜上或膜内的过程或分子。1,2因此，有必要对发生在膜表面的化学反应或非共价结合等过程进行分析研究。由于天然膜难以分离和/或与传感器连接，许多研究人员采用简化的模型膜系统开展分析研究。文献中已报道了多种模型膜体系，其尺寸范围从直径达数十至数百微米的巨型囊泡，到具有纳米级尺寸的脂质体。3,4. 或者，可将平面脂质双层沉积于固体支撑物上， 即支持性脂双层（SLBs）可在多种不同表面上形成，并已广泛应用于生物物理、生物化学和分析领域5将支撑脂双层（SLBs）与电学或光学材料耦合，可利用多种分析技术研究膜生物化学与膜生物物理学。荧光显微镜6,&#160;电化学7，光学光谱学8扫描探针显微镜技术9表面等离子体共振10，质谱法11 均已用于研究SLB的结构与性质。
SLB 芯片在多联检测传感器的设计中提供了更高的灵活性12,13。其他应用则利用 SLB 芯片模拟免疫细胞之间形成的连接界面14。SLB 芯片的制备方法多种多样，包括采用微流控技术15，以及使用物理屏障分隔相邻 SLB 区域的方法16。此外，一些研究团队还采用了打印技术17、光化学图案化技术18 和多种纳米工程方法19 来构建 SLB 芯片。
本文及配套视频展示了一种通过将涂有支撑脂双层（SLB）的SiO2微球沉积到有序排列的微孔阵列中来构建SLB阵列的方法20。我们将涂有SLB的SiO2微球称为球形支撑脂双层（SSLB）。该技术是先前研究的延伸，此前工作曾构建了来源于天然来源的磷脂囊泡和生物膜阵列21，本文也展示了相关示例结果。其他用于排列生物膜颗粒或囊泡的方法依赖于在表面构建特定靶向配体图案，这些配体可与囊泡表面所含互补配体结合。例如生物素-亲和素相互作用22,23和DNA杂交策略24。我们的方法仅需使用微孔阵列，无需任何靶向或识别分子。SSLB的尺寸由SiO2微球载体的直径决定，而这些微球具有较低的粒径分布多分散性。通过调节微孔直径略大于SSLB直径，可确保每个微孔中仅沉积一个SSLB。随后使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）刮板去除未固定在微孔中的所有SSLB。所形成的微孔及SSLB阵列具有高密度（约~105个SSLB/mm2），中心间距为3 µm，并呈六方周期性排列。通过依次沉积不同脂质组成的SSLB，可构建包含随机分布SSLB的多组分阵列。为验证SSLB阵列的传感能力，我们利用霍乱毒素（CTx）与SSLB中掺入的神经节苷脂（GM1）之间的相互作用进行了检测。在使用天然膜颗粒的实验中，我们能够在包含两种不同细胞来源膜材料的多组分阵列中检测到细胞特异性脂质。&#160;

<table><tbody><tr><td>4 英寸硅晶圆</td><td>University Wafer</td><td>425</td><td></td></tr><tr><td>Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 光刻胶</td><td>MicroChem</td><td>SPR955-CM</td><td></td></tr><tr><td>Shipley MICROPOSIT CD-26 显影液</td><td>MicroChem</td><td>CD-26</td><td></td></tr><tr><td>i线步进式光刻机</td><td>Canon</td><td>2500 i3 stepper</td><td></td></tr><tr><td>Vision 320 反应离子刻蚀机</td><td>Advanced Vacuum</td><td>Vision 320 RIE</td><td></td></tr><tr><td>深槽反应离子刻蚀机</td><td>Plasma Therm</td><td>SLR-770</td><td></td></tr><tr><td>原子层沉积系统</td><td>Cambridge NanoTech</td><td>Savannah</td><td></td></tr><tr><td>道康宁 Sylgard 184 聚二甲基硅氧烷试剂盒</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>蛋黄磷脂酰胆碱</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840051C</td><td></td></tr><tr><td>1,2-二棕榈酰-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-(丽丝胺罗丹明B磺酰基)铵盐</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810158C</td><td></td></tr><tr><td>单唾液酸神经节苷脂 GM1</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860065P</td><td></td></tr><tr><td>二氧化硅微球</td><td>Bangs Laboratories</td><td>SS03N/4666</td><td>微球容器包装上标注微球直径为900 nm。然而，经光散射和电子显微镜检测后，我们确定微球实际直径约为700 nm。</td></tr><tr><td>霍乱毒素B亚基，Alexa 488标记物</td><td>Molecular Probes</td><td>C-34775</td><td></td></tr><tr><td>抗少突胶质细胞抗体 IgM O4，NorthernLights 557标记物</td><td>R&amp;D Systems</td><td>NL1326R</td><td></td></tr><tr><td>FM1-43</td><td>Molecular Probes</td><td>T-3136</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf MiniSpin 离心机</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-401-09</td><td></td></tr></tbody></table>

采用刮刀式组装方法制备生物膜微阵列

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

脂质双分子层构成细胞的质膜，并界定亚细胞器的边界。在自然界中，这些膜是由多种脂质组成的异质混合物，含有膜结合蛋白，并修饰有碳水化合物。在某些实验中，需要将脂质双分子层的生物物理或生物化学特性与天然膜的其他组分分离开来。这类情况需要使用模型系统，例如巨型囊泡、脂质体或支撑脂质双层（SLB）。SLB阵列在传感应用及模拟细胞间相互作用方面尤其具有吸引力。本文中，我们描述了一种形成SLB阵列的新方法。首先将亚微米直径的SiO2微球包覆上脂质双层，形成球形SLB（SSLB）。然后将这些微球沉积到微加工制备的亚微米直径微孔阵列中。该制备技术采用“刮刀”法清除基底表面的多余微球，而保留在微孔内的SSLB不受影响。该方法无需对微孔基底进行化学修饰，也不需要在SSLB上引入特定的靶向配体。由于微孔直径被精确调控为略大于微球直径，每个微孔通常仅容纳单个微球。通常情况下，超过75%的微孔被占据，其余微孔保持空置。在缓冲液中，SSLB阵列可长期稳定存在，稳定性超过一周。通过连续沉积，可在同一阵列中放置多种类型的SSLB，且该阵列可用于传感检测；我们通过表征霍乱毒素与神经节苷脂GM1的相互作用对此进行了验证。我们还证明，不含微球支撑的磷脂囊泡以及来源于细胞的生物膜也可采用相同方法进行阵列化，并可识别细胞特异性的膜脂成分。

当SiO2微珠与含有磷脂、荧光脂质以及其他脂质（如神经节苷脂）组成的囊泡溶液混合时，囊泡会在SiO2微珠表面破裂，形成固载双层脂膜（SSLBs），如图1a所示。在洗涤SSLBs后，将一滴SSLB溶液置于微孔阵列表面，使微珠沉降到基底上（图1b1）。该步骤也可使用磷脂囊泡或天然膜颗粒的悬浮液完成，如图1b2所示。吸附到微孔阵列基底上的磷脂囊泡的荧光图像如图1b3所示。随后，使PDMS刮片轻轻滑过表面，以去除未落入微孔中的SSLBs（图1c1）、囊泡或天然膜颗粒（图1c2）。最终形成一个SSLB阵列，其中每个微孔最多包含一个SSLB（图1d1），或形成每个微孔中含有多个囊泡或天然膜颗粒的阵列（图1d2）。由荧光标记囊泡构成的微阵列图像如图1d3所示。
<p class="jove_cont...

支撑脂双层和天然膜颗粒是可模拟细胞膜特性的便捷体系，可被整合到多种分析策略中。本文展示了一种制备微阵列的方法，该微阵列由涂覆有支撑脂双层的SiO2微珠、磷脂囊泡或天然膜颗粒组成。

脂质双分子层膜构成细胞的质膜，并界定亚细胞细胞器的边界。在自然界中，这些膜是……

本实验的总体目标是采用一种简单的制备方法构建生物膜微阵列。该过程首先用脂双层膜包被二氧化硅微珠，第二步是将包被脂质的微珠沉积到硅胶微孔基底上。第三步是使用聚甲基环氧化物刮刀去除未进入微孔的微珠。最后一步是通过荧光显微镜对脂质包被的微珠阵列进行成像。最终，该方法可用于通过阵列成像方法测定毒素与脂质相互作用的结合常数。该方法可用于构建由球形支撑脂质双层及源自细胞的天然膜颗粒组成的阵列。与现有方法相比，该技术的主要优势在于，除了微孔的制备外，无需对基底或脂质膜进行任何化学修饰，即可形成空间上明确界定的生物膜阵列。该技术的应用可拓展至基于纳米金属孔阵列的表面等离子体共振，实现对脂质-蛋白质相互作用的无标记检测。尽管该方法可用于研究脂质与蛋白质的相互作用，但也适用于其他系统，例如细胞黏着斑的研究。微孔阵列和刮刀制备的详细步骤见文本方案。本视频从囊泡制备开始。首先，在一个小玻璃小瓶中混合囊泡所需的组分脂质。该溶液中总共含有0.5毫克脂质，在真空条件下干燥混合物6小时。接下来，配制0.1摩尔的氯化钠溶液，并加入0.5毫升至干燥的脂质中。将混合物在室温下孵育过夜。第二天，涡旋混合物以重悬囊泡。然后在室温下将混合物置于水浴中超声处理20分钟。超声处理后，通过100纳米聚碳酸酯膜滤器挤出悬浮液。将悬浮液总共通过挤出滤器17次。然后将挤出的囊泡储存在4°C的玻璃小瓶中。首先使用直径为700纳米的二氧化硅珠。将150亿个微珠悬浮于0.1摩尔氯化钠溶液中。涡旋混匀悬浮液，然后在1700 ×g 条件下离心20分钟，弃去上清液。通过重新悬浮，将微珠再次悬浮于1毫升盐溶液中，并再离心20分钟，重复洗涤一次。然后重复该过程第三次，以形成球形支撑脂质双层（SSBs）。取25微升二氧化硅微球悬浮液与前一步骤中得到的200微升囊泡悬浮液混合。涡旋混匀后，室温孵育1小时，随后在1700 ×g 条件下离心20分钟。弃去上清液。沉淀物呈粉红色，为破裂的囊泡与珠子上的DPPE排列成行。将其重悬于225 µL pH 7.4的PBS中。重复离心和重悬步骤两次，以去除未破裂的囊泡并完成单链断裂（SSB）的制备。将微孔阵列的芯片分割成矩形小片，每片包含四到六个阵列。接着，涡旋振荡上一步骤所得的SSLB悬液，并取10 µL转移至每个微孔阵列中。一小时后等待SSB沉淀。用PBS轻轻清洗芯片阵列，并将阵列浸入PBS中，使用刮板在浸没的芯片表面滑动五次。此步骤可去除未进入微孔中的SLP。接下来，用镊子夹住每张芯片，轻轻抖去 PBS。然后将其转移至新鲜的 PBS 浴液中。芯片的上表面必须保持湿润。从浴槽中取出一张芯片并轻轻吸去大部分 PBS 液体。用实验室擦拭纸吸走大部分 PBS，保留足够的 PBS 以保持芯片阵列的湿润。现在向芯片中加入 200 微升 BSA 溶液，以阻断非特异性结合。让芯片孵育 1 小时。随后在湿化盒中用微量移液器吸除 BSA 溶液，并加入 200 微升霍乱毒素溶液。然后将芯片放回加湿的孵育 chamber 中。再等待一小时后，用 PBS 清洗芯片，并用擦镜纸吸去多余的 PBS。接着将芯片放置在标准的显微镜载玻片上，在芯片上覆盖一块 24 × 40 毫米的盖玻片，随后进行成像。可以使用 ImageJ 的自动颗粒分析功能进行图像分析。然后针对每个阵列，将各个 SSB 的平均强度汇总为直方图。在使用上述方法后，阵列上一个 100 微米的方形区域显示出 936 个 SSB。尽管在储存一周后计算了占据率数据并生成了SSLB荧光强度的直方图。随后以相同方式对同一芯片重新进行了分析，结果显示荧光强度和芯片占据率均未发生变化。利用所述方法还可实现不同SSB及其相应识别标记的顺序沉积。第二次沉积的 SSBs 浓度为第一次沉积的 SSBs 浓度的十分之一。实验中展示了两种标记物的叠加图像。采用不同浓度的 GM1制备SSB阵列，并暴露于固定浓度的霍乱毒素中。反之亦然，以测定GM1的平衡解离常数。霍乱毒素结合阵列也可由天然生物膜制成，例如由髓鞘颗粒制成的阵列。该阵列用亲脂性荧光染料FM 1-43标记。脂筏富含胆固醇和神经节苷脂（如GM1）。因此，Alexa 488 标记的霍乱毒素会强烈结合脂筏微阵列，相比之下，荧光标记的去唾液酸黏附素则不与这些阵列结合。该阵列通过微流控芯片将髓鞘和脂筏递送至微孔中制备而成，芯片通道为 250 微米。阵列使用抗少突胶质细胞 IgM 进行标记，并对髓鞘中含有的硫化物进行了标记，但脂筏未被标记。一旦脂质双层包被的微珠制备完成。如果操作得当，该技术可在一小时内用于制备微阵列。在构建天然膜颗粒微阵列后，可进一步应用其他方法，如纳米孔表面等离子体共振，用于生物分子相互作用的无标记检测。观看本视频后，您应充分了解如何利用脂质双层包被的微珠和天然膜颗粒制备生物膜阵列。

formation-biomembrane-microarrays-with-squeegee-based-assembly

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

生物膜的微阵列用刮墨刀型组合方式形成

我们介绍了两种用于三维细胞培养的多孔聚合物芯片微加工工艺。第一种是热压印与溶剂蒸气焊接工艺相结合的方法。第二种则采用 recently developed...

芯片级三维细胞培养支架的微加工

本文中，我们描述了如何利用自动扫描共聚焦显微镜，从固定在表面的单个DNA分子获得FRET轨迹。...

用于表面固定生物分子单分子荧光测量的自动化系统

介绍一种采用芯片内光聚合技术制备聚合物微阵列的方法。同时描述了利用原子力显微镜、水接触角测量、X射线光电子能谱、飞行时间二次离子质谱以及细胞黏附实验对表面进行高通量表征的过程。...

用于生物材料高通量发现的聚合物微阵列

在本视频中，我们演示一种在玻璃支撑脂双层上研究 septin 组织结构的方法 体外...

平面支撑脂双层实验：一种基于显微镜的体外技术，用于研究Septin在生物膜模拟物上的组装

本文介绍了一种引导性材料筛选方法，用于开发基于溶胶-凝胶技术并采用新型针式点样法制备的蛋白质掺杂微阵列。该方法通过制备乙酰胆碱酯酶和多激酶微阵列加以验证，这些微阵列可用于低成本的小分子筛选。...

一种用于开发定量溶胶-凝胶蛋白微阵列的引导式材料筛选方法

本文介绍了一种利用偏振全内反射荧光显微镜（TIRFM），在微流控通道中以单分子灵敏度和约15毫秒时间分辨率检测脂质体与支撑双层膜之间由SNARE介导的单个融合事件的实验方案。该方法可同时检测脂质和可溶性货物的释放，并可测量脂质体尺寸、脂质扩散系数以及融合孔的特性。...

微流控流动池中通过偏振全内反射荧光显微镜监测单个蛋白脂质体与锚定支撑双层膜的SNARE介导融合

微生物群落的发展依赖于多种因素的共同作用，包括环境结构、成员丰度、特性及其相互作用。本方案描述了一种合成的微加工环境，可用于同时追踪容纳在飞升级微孔中的数千个群落，其中生态位大小和空间限制等关键因素可被近似模拟。...

微孔阵列平台中微生物群落构建与追踪

本文介绍一种用于重现器官水平功能的可拉伸双通道器官芯片微流控细胞培养装置的制备方案 体外.

可扩展的可拉伸双通道微流控器官芯片的制备

我们介绍一种利用微流控平台中毛细作用力辅助组装的技术，可将悬浮在液体中的微米级物体（如细菌和胶体）在聚二甲基硅氧烷基底上排列成预设的阵列。...

通过连续毛细辅助组装实现微生物与微粒的图案化

本文介绍了一种利用单分子全内反射荧光（smTIRF）显微镜技术，在人工拥挤的脂质膜上对单个分子的结合、运动性和组装行为进行观测与分析的实验方案。...

单分子在聚合物拥挤的脂质膜上的扩散与组装

本方案描述了辛醇辅助脂质体组装（OLA）技术，这是一种用于生成生物相容性脂质体的微流控方法。OLA...

芯片上辛醇辅助脂质体组装用于生物工程

学习利用刮墨刀型组合方式制备生物膜微阵列的方法，通过将脂质双层包覆的二氧化硅微珠沉积于硅胶微孔基底，实现毒素-脂质相互作用结合常数的测定与膜动力学研究。

采用刮刀式组装方法制备生物膜微阵列

探索更多视频