Name: 通过玻璃表面功能靶细胞提取方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: 学习玻璃表面功能化方法，利用脱硫生物素和链霉亲和素实现靶细胞的温和捕获与释放。该技术可定制用于肿瘤血管生成和药物抗性研究，为个性化医疗提供细胞分离平台。

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感谢美国癌症协会伊利诺伊分会（282802）和美国国家科学基金会CBET（1512598）提供的资金支持。我们还要感谢伊利诺伊大学贝克曼研究所的Dianwen Zhang博士在显微镜技术培训方面的指导。最后，感谢Jared Weddell、Stacie Chen和Spencer Mamer提出的富有见地的讨论。

1. 清洁玻璃表面并准备试剂
<ol>
	<li>将玻璃表面放入氧气等离子体机中，在50%功率下处理5分钟以进行清洁。</li>
	<li>在锥形管中加入50 µl APTES和2.45 ml乙醇，配制2.5 ml 2%的重悬(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（APTES）溶液。</li>
</ol>
2. APTES 和 DSB 功能化
<ol>
	<li>将APTES溶液加入表面。对于8孔板，每孔加入150 µl；对于24孔板，每孔加入100 µl；对于60 × 15 mm玻璃培养皿，加入1.1 ml。覆盖表面以防止APTES溶液蒸发和分布不均。将表面置于摇床平台上，在室温下震荡50分钟，以形成均匀的APTES层。 
	注意：APTES是一种氨基硅烷，可形成表面的第一层。若使用其他类型的表面，请根据经验确定覆盖该表面所需的溶液体积。</li>
	<li>在表面震荡的同时设定烘箱温度：8孔板和24孔板在55 °C下加热2小时；仅含玻璃的培养皿则在90 °C下加热1小时。</li>
	<li>用乙醇冲洗表面。
	<ol>
		<li>根据所用表面类型，加入相应体积的乙醇。对于8孔板，每孔加入150 µl乙醇；对于24孔板，每孔加入125 µl乙醇；对于玻璃培养皿，加入1.1 ml乙醇。</li>
		<li>通过从固定点（如孔的角落）反复排液和吸液的方式冲洗表面。将移液器保持约70°角，使枪头不直接对准表面。再用乙醇重复冲洗两次。 
		注意：若任何玻璃底孔板中含有塑料成分，请勿将其加热至65 °C以上，否则塑料可能开始熔化并变形。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用储气罐中的100%氮气吹干。将表面放入烘箱中。</li>
	<li>配制2.5 ml的d-去硫代生物素（DSB）溶液：将37.5 µl含1.5 mg/ml DSB的二甲基亚砜（DMSO）溶液与2462.5 µl含5 mg/ml 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺（EDC）的0.1 M 4-吗啉乙磺酸水合物（MES）缓冲液（pH 6）混合，然后将两种溶液合并。</li>
	<li>反应15分钟后，向溶液中加入1 µl的2-β-巯基乙醇以终止DSB与EDC之间的反应。从烘箱中取出加热后的APTES功能化玻璃表面，静置5–10分钟使其冷却。</li>
	<li>用MES缓冲液冲洗表面，用量根据表面类型而定。对于8孔板，每孔加入150 µl MES缓冲液；对于24孔板，每孔加入125 µl MES缓冲液；对于玻璃培养皿，加入1.1 ml MES缓冲液。</li>
	<li>通过从固定点（如孔的角落）反复排液和吸液的方式冲洗表面。将移液器保持约70°角，使枪头不直接对准表面。再用MES缓冲液重复冲洗两次。</li>
	<li>将DSB溶液加至表面，使其孵育。对于8孔板，每孔加入150 µl DSB溶液；对于24孔板，每孔加入100 µl DSB溶液；对于玻璃培养皿，加入1.1 ml DSB溶液。</li>
	<li>将覆盖有DSB溶液的玻璃表面置于培养皿内的湿润纸巾上，盖好后在4 °C冰箱中孵育18–24小时。</li>
</ol>
3. 链霉亲和素功能化
<ol>
	<li>用1 ml 1.0×磷酸盐缓冲液（PBS）将每块玻璃表面冲洗三次。冲洗时，从固定位置（如孔的角落）排出并吸取液体。将移液器保持约70°角，使枪头不直接对准表面。将链霉亲和素（SAv）储存液稀释至0.4 mg/ml（推荐浓度）。 
	注意：PBS为等渗溶液，因此可用作稀释和冲洗的介质。SAv以PBS为溶剂，故不会影响SAv与表面的结合能力。</li>
	<li>将0.4 mg/ml的SAv溶液均匀地施加到表面，使在玻璃底部形成一层薄层，溶液用量根据表面面积选择。对于8孔板，每孔加入150 µl 0.4 mg/ml SAv溶液；对于24孔板，每孔加入100 µl 0.4 mg/ml SAv溶液；对于玻璃培养皿，加入1.1 ml 0.4 mg/ml SAv溶液。</li>
	<li>盖上盖子，将板转移至14 cm的培养皿中以保持湿度。将培养皿置于冰箱中孵育18–24小时。 
	注意：在每个表面上使用一致体积的APTES、DSB和SAv至关重要。</li>
	<li>用150 µl PBS将每块玻璃表面冲洗三次，以去除SAv。冲洗时，从固定位置（如孔的角落）排出并吸取液体。将移液器保持约70°角，使枪头不直接对准表面。</li>
	<li>用去离子水浸湿一张纸巾，将其平铺于14 cm培养皿内，围绕板的周围放置，以保持孔内的湿度。盖上含有孔板的培养皿。将培养皿置于4 °C生物安全等级1（BSL-1）冰箱中，直至使用。</li>
</ol>
4. 细胞捕获与释放
<ol>
	<li>从拟用于实验的 T175 培养瓶中开始操作。吸除培养瓶中的培养基。用 5 ml 室温 PBS 洗涤残留培养基。吸除 PBS。</li>
	<li>向装有细胞的 T-175 培养瓶中加入 10 ml 非酶解解离试剂（如细胞解离液）。将培养瓶放入培养箱中孵育 6 分钟，使细胞从瓶壁脱落。</li>
	<li>6 分钟后，加入 10 ml 冷的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS；参见材料列表）以终止解离试剂的作用。取 20 µl 细胞悬液，使用血细胞计数板计数溶液中的细胞数量。 
	注意：根据捕获实验中所用功能化表面的不同，所需细胞数量有所差异。对于功能化的 8 孔板，每孔使用 300,000 个细胞；对于功能化的玻璃培养皿，使用 110 万个细胞；对于功能化的 24 孔板，建议使用 125,000 个细胞。有关细胞计数的更多信息，请参见补充材料。</li>
	<li>若当前细胞数量不足以满足实验需求，对另一培养瓶的细胞重复步骤 4.1–4.3。合并细胞悬液并重新计数，以获得溶液中细胞的总数。</li>
	<li>将细胞悬液在离心机中以 500 × g 在 4 °C 下离心 5 分钟，获得浓缩的细胞沉淀。计算需加入 HBSS 的适当体积，使细胞浓度达到每毫升 1 × 106 个细胞，然后吸除离心后的上清液，并加入计算所得体积的 HBSS。该体积可通过补充材料中的公式计算得出。</li>
	<li>通过移液器反复吹打（重悬）使细胞充分悬浮，减少细胞聚集，避免影响抗体结合。将细胞悬液分为对照组和实验组两部分。参见补充文件以获取组分信息和计算方法。</li>
	<li>按照补充文件所述，向相应的细胞悬液中加入生物素化抗体。在 4 °C 下于翻转混合仪上孵育 30 分钟。 
	注意：对于 MCF7GFP 细胞，建议使用 0.5 mg/ml hIgG 或 0.5 mg/ml HLA-ABC 抗体；对于 RAW 巨噬细胞，建议使用半体积的 1 mg/ml mCD11b 抗体，以校正稀释差异；对于人脐静脉内皮细胞（HUVECs），建议使用 0.5 mg/ml hCD31 抗体。</li>
	<li>用 HBSS 清洗功能化玻璃表面。本实验建议使用 8 孔板。
	<ol>
		<li>向 8 孔板的每孔中加入 150 µl HBSS。再用 HBSS 重复冲洗两次。通过从固定点（如孔的角落）反复排出和吸入液体来冲洗表面。将移液器保持约 70° 角，使枪头不直接对准表面。保持 4 °C 冷藏状态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞悬液加入各孔中，在摇床上于冰上孵育 45 分钟。根据补充材料中所述的计算体积，配制无菌 HBSS 中的生物素溶液。</li>
	<li>使用 HBSS 从玻璃孔中移除细胞悬液。
	<ol>
		<li>轻柔地向每孔中加入 150 µl HBSS，然后吸出 HBSS。通过从固定点（如孔的角落）反复排出和吸入液体来冲洗表面。将移液器保持约 70° 角，使枪头不直接对准表面。</li>
		<li>重复上述操作两次。清洗后，向孔中加入 HBSS 以保持细胞湿润。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向各个释放孔中分别加入 150 µl 20 mM 生物素溶液，然后等待 20 分钟以完成反应。</li>
	<li>按照上述方法用 HBSS 洗涤，回收非特异性结合的细胞。若使用荧光标记细胞，则进行荧光成像。同时对培养瓶中的活细胞进行成像（作为对照，用于与孔中细胞比较）。若使用绿色荧光蛋白（GFP）转染的细胞，激发波长为 470 nm，发射波长为 515 nm。</li>
</ol>
5. 抗体优化：抗体滴定
<ol>
	<li>按照步骤 4.1–4.3 所述方法从 T75 或 T175 培养瓶中收集细胞。 
	注意：这些体积是针对 24 孔板校准的，但可通过经验测试调整以适用于任何功能化玻璃表面。典型的抗体滴定结果如图 1所示。</li>
	<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数，然后将细胞悬液在锥形管中以 500 × g 离心 5 分钟，温度为 4 °C。根据补充材料中描述的计算方法，将细胞重悬至每毫升含 100 万个细胞。</li>
	<li>将每毫升含 100 万个细胞的悬液分装至不同的离心管中，每管 500 µl，共六份，用于不同的抗体（Ab）处理。
	<ol>
		<li>将抗体储备液稀释至 10 µg/ml、1 µg/ml、100 ng/ml、10 ng/ml 和 1 ng/ml。对照组使用 100 µl 染色缓冲液（PBS + 1% 叠氮化钠 + 1% BSA）和 500 µl 细胞悬液（不含抗体）。空白对照组（无抗体且无细胞）使用 300 µl PBS。 
		注意：警告：叠氮化钠具有极高毒性且易爆，使用时必须格外小心。请查阅材料安全数据表（MSDS），并佩戴适当的个人防护装备。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将抗体溶液与细胞溶液混合后，在 4 °C 条件下于翻转混合仪中孵育 30 分钟。用 HBSS 冲洗功能化 24 孔板三次。通过固定位置（如孔的角落）反复吸液和排液来冲洗表面。移液时保持移液器约 70° 角，使枪头不直接对准表面。</li>
	<li>将每种样品溶液各 125 µl 分装至相应的 APTES、DSB 和 SAv 功能化孔中。在 4 °C 或冰上孵育 45 分钟，使细胞结合于玻璃表面。用 HBSS 冲洗表面三次，以去除非特异性结合的细胞。冲洗时通过固定位置（如孔的角落）反复吸液和排液。保持移液器约 70° 角，避免枪头直接对准表面。底部一排孔不要冲洗，因其为对照组。</li>
	<li>向每孔洗涤后的孔中加入 150 µl HBSS，将 24 孔板置于冰上，然后使用酶标仪检测 GFP 阳性细胞的荧光信号（激发波长 485 nm / 发射波长 528 nm）。</li>
</ol>
6. 细胞优化：细胞滴定
<ol>
	<li>按照步骤 4.1 - 4.3 中所述方法悬浮细胞。</li>
	<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数。将细胞悬液置于锥形离心管中，在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟。将细胞重悬至每毫升含 100 万个细胞。 
	注：有关血细胞计数板使用的更多信息，请参见补充材料。</li>
	<li>从细胞悬液中吸取 1.6 ml 用于制备 160 万个细胞的储备液，并置于锥形离心管中。吸取 800 µl 细胞悬液用于制备 80 万个细胞的储备液，并置于锥形离心管中。从细胞储备液中吸取 80 µl 用于制备 8 万个细胞的储备液，并置于锥形离心管中。从细胞储备液中吸取 8 µl 用于制备 8,000 个细胞的储备液，并置于锥形离心管中。 
	注：浓度按每 8 孔板测定设定，可根据需要进行重复。板输出示例见图 2。</li>
	<li>将上述四种储备液在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟。将所有储备液重悬于 400 µl HBSS 中。</li>
	<li>向 160 万个细胞的储备液中加入 1.6 µl 浓度为 100 ng/ml 的抗体，向 80 万个细胞的储备液中加入 0.8 µl 抗体，向其余各储备液中各加入 0.5 µl 抗体。在 4 °C 条件下于翻转混合器上孵育 30 分钟。用 HBSS 对功能化玻璃表面清洗三次。 
	注：建议使用功能化的 8 孔板进行显微镜定量，而功能化的 24 孔板则推荐用于酶标仪定量。8,000 个细胞储备液中的抗体浓度未降低，以确保捕获表面的限制因素不是溶液中抗体的不足，而是表面本身的捕获特性。</li>
	<li>将 150 µl 样品溶液分别加入各孔中。将 160 万个细胞的储备液加入最左侧第一列的孔中。将 80 万个细胞的储备液加入左侧第二列的孔中。将 8 万个细胞的储备液加入左侧第三列的孔中。最后将 8,000 个细胞的储备液加入最右侧一列的孔中。在 4 °C 条件下于摇床上孵育 45 分钟。 
	注：160 万个细胞的储备液作为最高测试浓度，其细胞数量是通常细胞分离实验中每孔使用量（60 万个细胞）的两倍。80 万个细胞的储备液作为实验对照，因其浓度与常规细胞分离实验中常用的细胞浓度一致（每孔 300 万个细胞）。8 万个细胞的储备液作为十倍稀释样本，用于测试较低浓度下的细胞捕获效率（每孔 3 万个细胞）。8,000 个细胞的储备液作为百倍稀释样本，用于检测细胞分离的下限（每孔 3,000 个细胞）。</li>
	<li>用 HBSS 清洗三次。通过从固定位置（如孔的角落）排出和吸入液体的方式清洗表面。将移液枪头保持约 70° 角，避免枪头直接对准表面。收集所有洗涤液。</li>
	<li>若使用 8 孔板，在荧光显微镜下对细胞成像，拍摄每块表面的图像，并在摇床上于 4 °C 条件下向每块表面加入 150 µl 生物素孵育 1 小时。1 小时后，如前所述用 HBSS 清洗生物素释放孔三次。收集所有孔的洗涤液，用血细胞计数板计数，并对释放孔进行成像。</li>
	<li>若使用 24 孔板，向相应的生物素释放孔中加入 150 µl 20 mM 过量生物素溶液，孵育 1 小时，然后用 HBSS 清洗三次。使用酶标仪对 24 孔板进行定量。使用血细胞计数板对所有收集的孔洗涤液中的细胞进行计数。</li>
</ol>
7. 图像分析
注意：推荐使用 FIJI 软件包（http://fiji.sc/Fiji）进行图像分析。首先将图像转换为灰度图像，然后调整亮度/对比度以凸显细胞。
<ol>
	<li>加载图像，然后通过点击图像标签并向下滚动至 &#34;Type&#34;，再点击 &#34;8 bit&#34;，将图像转换为灰度图像。</li>
	<li>通过点击图像标签并向下滚动至 &#34;Adjust&#34;，然后点击 &#34;Brightness and Contrast&#34;，调整图像对比度，使用滚动条使细胞更加清晰。若使用荧光图像，请对图像进行反相处理以使细胞轮廓更明显。</li>
	<li>在 ImageJ 中加载一个名为 ITCN 的插件（http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html），用于分析图像。</li>
	<li>打开 ITCN 插件。当弹出一个对话框提示用户设置多个参数以估算细胞大小时，首先设定目标细胞的最小宽度。如果图像是荧光图像且细胞呈暗色，请勾选 &#34;Detect Dark Peaks&#34; 选项。</li>
	<li>初始阈值设为 2，然后点击 &#34;Count&#34; 按钮。将出现一幅重新计数后的图像，其中红色圆点标示出已被计数的细胞位置。</li>
	<li>通过调整阈值和宽度参数，定义“&#34;cell&#34;”的大小，以获得更准确的细胞数据。注意：计数的细胞数量将显示在右侧的对话框中。更改参数会导致计数结果不同。</li>
	<li>持续迭代调整阈值和宽度参数，直至获得对细胞数量的合理估计。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

细胞分离技术的进步推动了神经科学中结构与功能关系的科学研究18，再生生物学中的干细胞编程，以及血管生物学中的血管生成信号传导19确实，原代细胞培养20 (例如，血管内皮细胞（HUVECs）在血管生物学中的研究主要通过细胞分离技术实现。近期，细胞分离技术还被用于血浆膜受体的定量流式（qFlow）细胞术分析3,14,15,19,21然而，现有的细胞分离方法会影响细胞表面受体水平，且在人力和试剂方面成本较高。我们提出了一种改进的表面功能化方法17，可实现从多种细胞类型的混合物中可重复地轻柔捕获单一细胞类型，从而弥补上述不足。该技术可整合为一个迭代系统，通过使用特异性抗体分阶段捕获不同细胞类型。为进一步阐明该操作流程，以下提供若干常见问题及解决方案：
功能化优化：已对功能化过程进行优化，以提高MCF7gfp细胞捕获的均匀性和富集效率。本方案也可根据任何细胞类型和抗体组合进行优化和定制。这可通过调整捕获表面中基础组分的浓度，或改变抗...

目前的台式细胞分离方法（例如，荧光激活细胞分选1、激光捕获显微切割2、免疫磁珠分离1）通常需要数小时的准备和分选时间。如此长的时间尺度可能影响细胞的生理反应和表达水平，导致分析结果不能真实反映生理状态3。因此，亟需开发能够快速高效地分离特定细胞类型、同时不破坏细胞表面受体水平的系统，以提升细胞分离与富集效果，满足生物医学应用的需求。基于此，本方法的设计理念是建立一种温和的细胞分离技术。
这 &#34;芯片实验室&#34; 该概念有望将细胞分离速度提高数个数量级（从小时级缩短至分钟级），通常涉及将细胞捕获到表面，再通过物理方式释放细胞或其胞内成分4,5 或化学方法6尽管这些方法具有一些优势，例如能够鉴定蛋白质7,8 表达，鉴定RNA表达9-11，甚至为细胞提供 体外 培养12,13，许多此类技术由于所处的非生理环境，无法应用于细胞受体谱分析等诊断领域。此外，胶原酶等酶解消化试剂也可能影响这些受体的数量14,15，这意味着使用这些解离试剂的细胞受体定量技术将无法获得准确的生理学数据。细胞裂解会阻碍区分天然存在于细胞表面的受体与先前已被内化的受体16本方案描述了一种快速且温和的细胞分离方法。

<table><tbody><tr><td>(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷 (APTES)</td><td>Acros Organics</td><td>919-30-2</td><td>用于配制 2% APTES 溶液</td></tr><tr><td>Plasma Cleaner Pico</td><td>Diener</td><td>Model 1</td><td>用于清洁表面，并实现 PDMS 与玻璃之间的键合</td></tr><tr><td>d-脱硫生物素 (DSB)</td><td>Sigma</td><td>D20655</td><td>作为细胞捕获表面的释放机制使用&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>二甲基亚砜 (DMSO)</td><td>British Drug Houses (BDH)</td><td>BDH1115-1LP</td><td>用于将 DSB 溶解于溶液中</td></tr><tr><td>1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺 (EDC)</td><td>Thermo-Scientific</td><td>5g: 22980&lt;br/&gt; 25g: 22981</td><td>活化羧酸，使蛋白质能够结合到玻璃表面</td></tr><tr><td>未包被 8 孔培养板</td><td>BD Falcon</td><td>24 个/箱：354118&lt;br/&gt; 96 个/箱：354108</td><td>用于涉及 Zeiss 荧光显微镜的细胞实验，如初始捕获和释放定量实验</td></tr><tr><td>玻璃底 24 孔板</td><td>MatTek</td><td>P24G-0-13-F</td><td>用于涉及酶标仪的细胞实验，如抗体和细胞滴定实验</td></tr><tr><td>巯基乙醇</td><td>Science Lab</td><td>60-24-2</td><td>用于淬灭 EDC 与 DSB 之间的反应</td></tr><tr><td>4-吗啉乙磺酸一水合物&lt;br/&gt; (MES 一水合物，99%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC172590250</td><td>用于配制 0.1 M MES 缓冲液，供 EDC 反应使用</td></tr><tr><td>Precision Oven</td><td>Thermo Scientific</td><td>11-475-153</td><td>用于 PDMS 和 APTES 层的固化</td></tr><tr><td>Titramax 1000 摇床</td><td>Heidolph</td><td>13-889-420</td><td>确保 APTES 在表面均匀分布</td></tr><tr><td>1× 链霉亲和素 5 mg [e7105-5mg]</td><td>Proteo Chem</td><td>9013-20-1</td><td>生物素结合蛋白，可能引起刺激</td></tr><tr><td>5 cm 玻璃培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>08748A</td><td>用于 HUVEC 研究以及未来的分析研究</td></tr><tr><td>14 cm 带盖培养皿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z717231</td><td>用于盛放正在功能化的样品并进行转移</td></tr><tr><td>MCF7-GFP 细胞</td><td>Cell Biolabs</td><td>AKR211</td><td>保存于液氮中</td></tr><tr><td>RAW264.7 小鼠巨噬细胞</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td>由伊利诺伊大学 Smith 实验室赠予，保存于液氮中</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Life Technologies</td><td>12605036</td><td>以 100 ml 规格室温保存</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle 培养基</td><td>伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校化学科学学院细胞培养基中心</td><td>50003PC</td><td>供应商：Corning</td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校化学科学学院细胞培养基中心</td><td>25-025-CI</td><td>已由该中心加入 DMEM 中，供应商：Corning</td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-58</td><td>小型 23 cm，50 个/包</td></tr><tr><td>细胞解离液</td><td>Corning</td><td>MT-25-056CI</td><td>用于非酶法解离细胞，以用于细胞实验</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Hausser</td><td>02-671-54</td><td>用于细胞计数，以定量细胞悬液浓度及评估捕获与释放效率</td></tr><tr><td>生物素</td><td>Amresco</td><td>58-85-5</td><td>用于从表面释放细胞</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>按配方配制</td><td>N/A</td><td>用于维持悬浮状态下的细胞活性，并清洗表面的非特异性结合。配方改编自 Cold Spring Harbor 实验方案：在 500&amp;nbsp;ml 水中加入 4&amp;nbsp;g NaCl、0.2&amp;nbsp;g KCl、0.0402&amp;nbsp;g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O、0.03&amp;nbsp;g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 和 0.5&amp;nbsp;g 葡萄糖。加去离子水至&amp;nbsp;500 ml，过滤后冷藏保存</td></tr><tr><td>HLA-ABC 抗体</td><td>BioLegend</td><td>311402</td><td>用于捕获 MCF7gfp 细胞的抗体</td></tr><tr><td>hIgG 抗体</td><td>BioLegend</td><td>HP6017</td><td>用于捕获 MCF7gfp 细胞的抗体</td></tr><tr><td>MCF7 GFP 细胞</td><td>Cell Biolabs</td><td>AKR-211</td><td>经绿色荧光蛋白转染的管腔型乳腺癌细胞系</td></tr><tr><td>各种锥形离心管</td><td>Thermo-Scientific</td><td>15 mL：12-565-268</td><td>50 mL/15 mL 塑料锥形管，用于储存溶液和分装样品</td></tr><tr><td>小型管式旋转混合器（翻转混合器）</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-127</td><td>用于孵育抗体及混合其他细胞溶液</td></tr><tr><td>Axiovert 200M（荧光显微镜）</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Zeiss Axiovert 200 M 倒置荧光显微镜</td></tr><tr><td>Zeba 脱盐柱</td><td>Thermo-Scientific</td><td>PI-87770</td><td>用于在使用生物素化试剂盒后纯化新生物素化的抗体。操作说明见：http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf</td></tr><tr><td>EZ Link Sulfo NHS 小分子量生物素化试剂盒</td><td>Thermo- Scientific</td><td></td><td>用于对抗体进行生物素化，使其能够整合至捕获表面</td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>BioTek</td><td>Synergy HTX 多功能酶标仪</td><td>用于在滴定实验中定量测定荧光强度</td></tr></tbody></table>

一种通过玻璃表面功能化实现靶向细胞分离的方法

A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization

阻碍个体化医学发展和应用的因素之一，是缺乏能够检测患者之间基因表达个体差异的诊断工具。目前试图通过细胞分离来填补这一空白的技术方法，往往会导致生理状态下表达模式的破坏，从而使分离技术无法作为有效的诊断工具。在本实验方案中，我们描述了一种用于细胞捕获与释放的功能化表面的构建及其优化过程。该功能化表面将生物素化抗体与经氨基硅烷（APTES）、脱硫生物素（desthiobiotin）和链霉亲和素修饰的玻璃表面相结合。通过引入生物素实现细胞的释放，从而可回收并纯化被该表面捕获的细胞。这种释放机制靶向作用于次级组分脱硫生物素，因而实现了更为温和的细胞释放模式。由于减少了剧烈试剂的使用以及剪切力的影响，细胞表达的变化得以显著降低。该功能化表面在单细胞混合物中可捕获高达80%的细胞，在双细胞混合物中亦实现了50%的捕获效率。本文还探讨了该技术在异种移植模型及癌症细胞分离研究中的应用。同时介绍了用于表面验证的定量分析方法，如酶标仪和ImageJ图像分析技术。

通过本方案，我们展示了MCF7GFP细胞的捕获（图3A）和释放（图3C），以及活细胞对照结果（图4）。我们对细胞捕获效率进行了量化，结果显示捕获率为60%，其中80%的细胞被成功释放（图3C）。当我们将该方法应用于RAW 264.7巨噬细胞与MCF7GFP细胞的混合体系时，50%的RAW巨噬细胞被捕获（图3D），在使用20 mM生物素后，80%的RAW巨噬细胞被释放（图3B）。由于过量抗体可能降低细胞捕获效率，我们通过滴定0–10,000 nM的HLA抗体进行优化，发现最佳抗体浓度范围为100–1,000 mM（图1）。类似地，我们确定可有效捕获的细胞最佳浓度范围为1 × 105至1 × 106，因为当细胞数量低于该范围时，检测值低于背景水平17（图2</s...

本方案描述了去硫代生物素、链霉亲和素和APTES系统的可定制化表面功能化方法，以分离特定的目标细胞类型。此外，本文还涵盖了该方法的应用、优化及验证过程。

阻碍个性化医疗采纳与发展的因素之一，是无法开发出用于检测个体……的诊断工具

该玻璃表面功能化过程的总体目标是实现对目标细胞的温和捕获与释放。该方法有助于解答肿瘤血管生成领域的关键问题，能够筛选出指示药物耐药性的细胞生物标志物。该技术的主要优势在于其完全可定制化，几乎适用于任何目标细胞类型。只要存在针对特定细胞类型的特异性抗体，即可对该表面进行改造以实现细胞捕获。尽管该方法可为癌症血管生成研究提供见解，但也可应用于其他疾病，因为纯化样本对于开发更加个性化的治疗方案至关重要。我们最初产生该方法的构想，是在尝试利用脱硫生物素与亲和素家族之间的相互作用，开发一种可逆释放机制以捕获细胞时。根据文本方案，将玻璃表面在氧气等离子体仪器中清洗5分钟后，通过在锥形管中混合50 µL APTES和2.45 mL乙醇，制备2.5 mL的2%重悬3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）溶液。用移液器将APTES溶液加至玻璃表面，然后覆盖表面，并将其置于室温下的平台摇床上震荡50分钟，以均匀分布APTES层。在此期间，将烘箱预热至55 °C（用于8孔和24孔板）或90 °C（用于玻璃培养皿）。从摇床中取出培养板后，按照文本方案使用乙醇冲洗玻璃表面。用100%氮气吹干表面。然后将八孔和24孔板放入烘箱中烘烤两小时，或将玻璃培养皿放入烘箱中烘烤一小时。接下来，通过将1.5毫克/毫升的d-脱硫生物素（d-Desthiobiotin，DSB）与37.5微升二甲基亚砜（DMSO）混合，并将5毫克/毫升的EDC加入2,462.5微升0.1摩尔MES缓冲液（pH 6）中，配制2.5毫升DSB溶液。然后将两种溶液混合。15分钟后，加入1微升β-巯基乙醇（BME）以终止DSB与EDC之间的反应。将热的APTES功能化玻璃表面从烘箱中取出，静置冷却5到10分钟。加入MES缓冲液冲洗玻璃表面，移液时保持移液器与表面呈70度角，使枪头不直接对准表面。然后从固定位置（如孔的角落）反复排液和吸液，以完成缓冲液的冲洗。然后，用 MES 缓冲液再冲洗两次。将 DSB 溶液涂覆到玻璃表面，转移到培养皿内湿润的纸巾上，盖上培养皿，并在冰箱中孵育 18 至 24 小时。在4摄氏度孵育后，用PBS冲洗每块玻璃表面三次，操作方法如本视频前面所示。然后将链霉亲和素（Streptavidin）或SAV储存液稀释至0.4毫克/毫升，并均匀地涂布于玻璃表面，形成一层薄层。玻璃孵育18至24小时后，用150微升PBS对每个表面冲洗三次。然后用去离子水浸湿一张纸巾，将其平铺于直径14厘米的培养皿中，环绕在孔板周围，以保持孔内湿度。用玻璃表面盖上培养皿，并将其置于4°C生物安全一级冰箱中，直至需要时使用。进行细胞捕获时，从T175细胞培养瓶中吸除培养基。然后用 PBS 清洗细胞，并吸去缓冲液。向培养瓶中加入 10 毫升非酶解解离试剂，例如细胞解离溶液。随后在 37 摄氏度孵育 6 分钟。六分钟后，加入 10 毫升冷的 HBSS 以稀释消化液。然后用移液器取 20 微升细胞悬液，使用血细胞计数板进行细胞计数。将细胞悬液在 4°C 下以 500 × g 离心 5 分钟。用HBSS将细胞重悬至每毫升1 × 10⁶个细胞。通过反复吹打使细胞充分悬浮于溶液中，以减少细胞团块形成，避免影响抗体结合。随后，将细胞悬液分装为对照组和实验组两份独立的溶液。将生物素标记的抗体加入相应的细胞溶液中，在4°C下于翻转混合仪中孵育30分钟。用150微升HBSS在八孔板中对功能化玻璃片进行洗涤，重复三次，方法如视频前面所示。将细胞溶液加入孔中，在冰上于摇床中孵育45分钟。在此期间，用无菌的 HBSS 配制 20 毫摩尔的生物素溶液。然后，在孵育结束后，轻轻用 150 微升 HBSS 将细胞溶液从玻璃表面冲洗下来。重复冲洗步骤再进行两次后，向每个相应的释放孔中加入 150 微升生物素溶液，并孵育 20 分钟，以使反应充分进行。使用HBSS洗涤细胞，回收非特异性结合的细胞。然后根据文本方案进行荧光成像和分析。将培养瓶中活细胞的图像作为对照包括在内。在本实验中，MCF7GFP细胞被暴露于功能化表面。使用HLA-ABC抗体捕获了60%的细胞。当暴露于20毫摩尔生物素时，80%被捕获的细胞被释放。如图所示，当将MCF7GFP细胞与RAW 264.7细胞混合时，50%的RAW巨噬细胞被捕获，随后加入20微摩尔的生物素，可释放80%被捕获的RAW细胞。该图显示，阳性对照RAW巨噬细胞无荧光活性，而阴性对照MCF7GFP细胞则呈现GFP荧光阳性。由于过量的抗体可能会降低细胞捕获效率，因此通过将HLA抗体浓度从0至10,000纳克/毫升进行梯度滴定，对抗体浓度进行了优化。结果显示，理想的抗体浓度范围为100至1,000纳克/毫升。此外，细胞优化实验确定，可有效捕获的细胞理想浓度范围为1×10⁵至1×10⁶个细胞，因为低于该数量的细胞捕获量将低于背景水平。一旦掌握，该技术可在三天内完成，实验操作时间少于六小时（不包括过夜孵育）。在实施该步骤时，需注意在实验过程中收集细胞洗涤液，因为这些洗涤液可提供有关表面有效性的关键信息。在完成该步骤后，可进一步采用其他方法（如流式细胞术）来回答更多问题，例如目标细胞可能具有的受体表达水平。表面功能化技术发展以来，为生物材料领域的研究人员探索生物安全的材料整合开辟了道路，例如将植入物用于多种疾病和损伤的治疗。观看本视频后，您应能充分理解如何对玻璃表面进行表面功能化以捕获和释放目标细胞，从而实现后续分析。请注意，使用叠氮化钠处理活细胞可能具有极高危险性，在执行该操作时，必须采取适当的培训、个人防护装备（PPE）及妥善的废弃物处理等安全措施。

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科研

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非接触式介电泳（cDEP）利用颗粒固有的介电特性实现其分选与富集。流体电极通道取代了传统介电泳中的金属电极，使cDEP适用于对生物颗粒进行无损、无菌的表征与分选。本文演示了如何制备cDEP微装置，并开展细胞表征与分选实验。...

无标记细胞分离与富集通过非接触式介电泳

传统的制备含有荧光探针的聚丙烯酰胺（PA）凝胶的方法涉及将凝胶夹在粘附表面与玻璃载片之间。本文表明，通过用聚-D-赖氨酸（PDL）包被该载片，并将荧光探针定位在凝胶表面1.6...

一种用于牵引力显微镜技术中将报告荧光微珠定位在细胞培养表面附近的新型方法

本文介绍了一种利用微流控平台分离和培养单细胞的实验方案，该平台采用了一种新型的微孔设计概念，可实现高效的单细胞分离和长期克隆培养。...

一种用于高通量单细胞分离与培养的微流控平台

本方案旨在从含有非靶标背景细胞的混合物中分离并制备稀有靶细胞，用于单细胞水平的分子遗传学表征。所获得的DNA质量与未经处理的单细胞相当，适用于单细胞分析（包括基于筛查和靶向分析的应用）。...

靶细胞预富集与全基因组扩增用于单细胞下游分析

我们描述了一种简单的光刻方法，用于将基因长度的DNA分子固定在表面，该方法可用于在生物芯片上进行无细胞基因表达实验。...

利用多步链置换光刻技术实现基因的功能性表面固定

报道了利用高分辨率光刻工具通过光降解水凝胶分离细菌细胞的方法。综述了该方法的关键实验步骤、结果及其优势。该方法能够从异质性菌群或种群中快速、低成本地分离出具有稀有或独特功能的目标细菌。...

光可降解水凝胶界面用于细菌筛选、选择与分离

我们采用了一种可渗透的微孔膜插入装置来模拟肿瘤微环境（TME）。该模型包含混合细胞培养体系，可在无需荧光标记或细胞分选的情况下，简便地获得高度富集的单一细胞群体，并允许在正常或应激条件下研究肿瘤微环境中细胞间的相互通讯。...

肿瘤微环境的模拟：一种用于富集细胞群体及研究细胞间通讯的简单方法

学习玻璃表面功能化方法，利用脱硫生物素和链霉亲和素实现靶细胞的温和捕获与释放。该技术可定制用于肿瘤血管生成和药物抗性研究，为个性化医疗提供细胞分离平台。

一种通过玻璃表面功能化实现靶向细胞分离的方法

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