通过玻璃表面功能靶细胞提取方法
2016年9月20日
该方案描述了脱硫生物素、链霉亲和素和 APTES 系统的可定制表面功能化，以分离感兴趣的特定细胞类型。此外，本手稿还涵盖了此过程的应用、优化和验证。
这种玻璃表面功能化过程的总体目标是允许温和地捕获和释放目标细胞。该方法可以帮助回答肿瘤血管生成领域的关键问题，从而能够筛选表明耐药性的细胞生物标志物。该技术的主要优点是它是完全可定制的，几乎适用于任何感兴趣的细胞类型。
只要存在对细胞类型具有特异性的抗体，表面就可以适应其捕获。虽然这种方法可以提供对癌症血管生成的见解，但它也可以应用于其他疾病，因为纯化的样本对于开发更加个性化的治疗方案是必要的。当我们试图利用 desthiobiotin 和 adivin 家族之间的相互作用开发一种可逆释放机制来捕获细胞时，我们第一次有了这种方法的想法。
根据文本方案在氧气等离子机中清洁玻璃表面 5 分钟后，将 50 微升 APTES 和 2.45 毫升乙醇混合在锥形管中，制备 2.5 毫升 2% 重构的 3-氨丙基三乙氧基硅烷或 APTES 溶液。将 APTES 溶液移液到玻璃表面，然后覆盖表面，将它们放在室温下的平台摇床上 50 分钟，以均匀分布 APTES 层。同时，将 8 孔板和 24 孔板的烤箱预热至 55 摄氏度，或将玻璃盘预热至 90 摄氏度。
从摇床中取出板后，根据文本方案使用乙醇冲洗玻璃表面。用 100% 氮气吹干表面。然后将 8 孔板和 24 孔板放入烘箱中 2 小时，或将玻璃培养皿放入烘箱中 1 小时。
接下来，通过将每毫升 1.5 毫克 DSB 混合在 37.5 微升 DMSO 中，并将每毫升 5 毫克 EDC 添加到 2， 462.5 微升 0.1 摩尔 MES 缓冲液（pH 6）中，制备 2.5 毫升 d-脱硫生物素或 DSB 溶液。然后组合两个解决方案。15 分钟后，加入 1 微升 BME 以淬灭 DSB 和 EDC 之间的反应。
从烤箱中取出热的 APTES 功能化玻璃表面，让它们冷却 5 到 10 分钟。将 MES 缓冲液添加到玻璃表面，以 70 度角握住移液器以冲洗玻璃表面，使吸头不会直接指向表面。然后从固定点（如井的角落）排出并抽取缓冲液。
然后，使用 MES 缓冲液再冲洗两次。将 DSB 溶液涂抹在玻璃表面。将它们转移到培养皿内的湿纸巾中，盖上培养皿，然后在冰箱中孵育 18 至 24 小时。
在 4 摄氏度下孵育后，使用 PBS 冲洗每个玻璃表面 3 次，如本视频前面所示。然后，将链霉亲和素或 SAV 储备液稀释至 0.4 毫克/毫升，并将其均匀地涂抹在玻璃表面上，以形成薄层。将玻璃杯孵育 18 至 24 小时后，使用 150 微升 PBS 冲洗每个表面 3 次。
然后用去离子水润湿纸巾，将其平放在围绕板的 14 厘米培养皿中，以保持孔中的水分。用玻璃表面盖住培养皿，并将其放入 4 摄氏度的生物安全 1 级冰箱中，直到需要为止。为了进行细胞捕获，从细胞的 T175 培养瓶中吸出培养基。
然后使用 PBS 冲洗细胞并吸出缓冲液。向培养瓶中加入 10 毫升非酶提升剂，例如细胞解离溶液。然后在 37 摄氏度下孵育 6 分钟。
6 分钟后，加入 10 毫升冷 HBSS 以稀释提升剂。然后吸取 20 微升细胞，并使用血细胞计数器计数。将细胞悬液在 4 摄氏度下以 500 x g 离心 5 分钟。
并使用 HBSS 将细胞重悬至每毫升 10 至 6 个细胞的 1 倍。上下移液以将细胞重悬于溶液中，并减少可能降低抗体结合的细胞结块。然后，将细胞悬浮液分成单独的对照和实验溶液。
将生物素化抗体添加到相应的细胞溶液中，并在 4 摄氏度的端到端混合器上孵育 30 分钟。使用 150 微升 HBSS 在 8 孔板中清洗功能化玻璃 3 次，如视频前面所示。将细胞溶液加入孔中，并在摇床上冰上孵育 45 分钟。
同时，在无菌 HBSS 中制备 20 毫摩尔的生物素溶液。然后，孵育后，轻轻使用 150 μL HBSS 从玻璃杯中冲洗细胞溶液。再重复冲洗两次后，向每个相应的释放孔中加入 150 μL 生物素溶液，并孵育 20 分钟以使反应继续进行。
通过使用 HBSS 洗涤细胞来收集非特异性结合的细胞。然后，根据文本方案进行荧光成像和分析。包括培养瓶中活细胞的图像作为对照。
在本实验中，MCF7GFP 个细胞暴露于功能化表面。60% 的细胞是使用 HLA-ABC 抗体捕获的。暴露于 20 毫摩尔生物素后，释放 80% 的捕获细胞。
如图所示，当 MCF7GFP 细胞与 RAW 264.7 细胞混合时，捕获了 50% 的 RAW 巨噬细胞，随后添加 20 微摩尔生物素释放了 80% 的捕获的 RAW 细胞。该图说明阳性对照 RAW 巨噬细胞没有荧光活性。然而，阴性对照MCF7GFP细胞的 GFP 荧光呈阳性。
由于过量的抗体会减少细胞捕获，因此通过从每毫升 0 滴定到 10， 000 ng/mL HLA 抗体来优化抗体浓度。结果表明，理想的抗体浓度在 100 到 1， 000 纳克/毫升之间。此外，细胞优化实验确定，可以捕获的细胞的理想浓度是 10 倍到第 5 个细胞，以及 10 到 10 到第 6 个细胞之间，因为低于该数字的数量低于背景。
一旦掌握，这项技术可以在三天内完成，实验时间不到 6 小时，不包括过夜孵育。在尝试此过程时，重要的是要记住在实验期间收集细胞洗涤液，因为它们可以提供有关表面有效性的重要信息。在此程序之后，可以执行其他方法（如流式细胞术）来回答其他问题，例如目标细胞可能具有的受体表达水平。
表面功能化发展起来后，为生物材料领域的研究人员探索材料的生物安全集成铺平了道路，例如，用于各种疾病和伤害的患者植入物。观看本视频后，您应该对玻璃表面进行表面功能化以捕获和释放目标细胞，从而进行下游分析。不要忘记，在叠氮化钠中处理活细胞可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如适当的培训、PPE 和处置。
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概述
本协议描述了一种使用脱硫生物素、链霉亲和素和APTES的可定制表面功能化方法，用于分离特定细胞类型。它能够温和地捕获和释放细胞，有助于研究肿瘤血管生成和药物耐药性。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 肿瘤学
- 生物技术
背景
- 理解肿瘤血管生成对于癌症研究至关重要。
- 细胞生物标志物可以指示药物耐药性。
- 可定制的方法增强了对各种细胞类型的研究。
- 可逆释放机制对于捕获细胞很重要。
研究目的
- 开发一种分离特定细胞类型的方法。
- 提供关于癌症生物学和治疗的见解。
- 促进个性化医疗的生物标志物筛选。
使用的方法
- 使用脱硫生物素和链霉亲和素进行表面功能化。
- 使用针对目标细胞类型的特异性抗体。
- 优化捕获和释放条件。
- 验证该方法在分离细胞中的有效性。
主要结果
- 该方法能够有效捕获各种细胞类型。
- 它为研究肿瘤中的药物耐药性提供了一个平台。
- 可定制的表面增强了该技术的多功能性。
- 获得的见解可以为个性化治疗策略提供信息。
结论
- 该协议为细胞分离提供了一种新颖的方法。
- 它在癌症研究之外还有潜在的应用。
- 该方法可以为个性化医疗的进步做出贡献。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method addresses a critical bottleneck in personalized medicine by enabling gentle, reversible isolation of specific cell populations without altering physiological expression. It supports biomarker screening for drug resistance in tumor angiogenesis studies, directly informing target validation and lead identification efforts. The customizable surface functionalization platform enhances reproducibility and scalability for downstream applications in oncology and immunology research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through isolation of specific cell types for biomarker analysis.
- Operational Value: Provides a reversible capture-release system that preserves native cellular expression profiles.
- Predictive Value: Supports functional target validation by isolating cells indicative of drug resistance mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified cell populations suitable for downstream screening assays and receptor expression analysis.
- Operational Value: Achieves up to 80% capture efficiency in single-cell mixtures with biotin-mediated gentle release.
- Platform Value: Enables assay standardization through quantifiable surface verification using plate reader and ImageJ analysis.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical studies by providing disease-relevant isolated cells for xenograft and cancer separation models.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity in target engagement studies through gentle cell recovery.
- Translational Value: Supports biomarker-aligned screening for personalized treatment regimen development.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification, enabling isolation of biomarker-positive cell populations for mechanistic and phenotypic screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating cells expressing specific surface markers.
- Screening: Delivers assay-ready purified cells with quantifiable capture and release metrics for compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative measurement of cell capture efficiency and release kinetics via fluorescence imaging and hemocytometer counting.
- Translational Research: Connects to preclinical workflows through application in xenograft models and cancer separation studies.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform adaptable to any cell type with available antibody, reducing need for re-optimization across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by minimizing expression artifacts during isolation.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized surface functionalization and biotin-mediated release.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling reliable screening of drug resistance biomarkers.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on functional validation in isolated cell populations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface chemistry, antibody conjugation, and cell handling techniques.
- Depends on access to oxygen plasma equipment, ovens for silanization, and fluorescence imaging systems.
- Necessitates standardization of antibody titration and cell concentration ranges for optimal capture.
- Involves adaptation considerations for different cell types and surface geometries (well plates vs. glass dishes).
- Includes practical limitations such as background signal at low cell concentrations and antibody optimization requirements.
