Name: 肿瘤微环境的模仿:产生富集的细胞群及侦查间通讯的简单方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 学习使用体外共培养模型模拟肿瘤微环境，通过微孔膜插入物富集细胞群并研究细胞间通讯。该方法无需荧光标记即可分离高纯度细胞群体，适用于癌症生物学和放射生物学研究。

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本研究获得了新泽西癌症研究委员会（博士前奖学金 DFHS13PPCO17）、美国国立卫生研究院（CA049062）和美国国家航空航天局（NNX15AD62G）资助项目的支持。

1. 培养基和细胞的准备
<ol>
	<li>配制500 ml添加有12.5%（体积比）热灭活胎牛血清（FBS）、2 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺以及每毫升100单位青霉素和100 µg链霉素的Eagle最小必需培养基。 
	注意：可根据其他细胞株或细胞系的生长需求，轻松更换培养基和补充物。</li>
	<li>为每个插件（6孔板格式插件）准备70 µl细胞培养基：添加50%（体积比）热灭活FBS、2 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，以及每毫升含100单位青霉素和100 µg链霉素的Eagle最小必需培养基。 
	注意：培养基中添加50% FBS以促进细胞贴附至底部即， 插入物的下侧。可根据其他细胞株或细胞系的生长需求，方便地更换培养基和补充物。</li>
	<li>制备将要接种到插入式培养小室底面的细胞的细胞悬液。 
	注意：此处结果使用在75 cm²培养瓶中培养的AG1522正常人成纤维细胞获得2 细胞培养瓶中的细胞，因此这些细胞将是细胞悬液制备描述的重点。</li>
	<li>收集细胞时，移除培养基，用5 ml 1×磷酸盐缓冲液（PBS）将细胞单层洗涤2次。</li>
	<li>吸除 PBS，加入 1 ml 预热至室温（RT）的 0.25%（体积比）胰蛋白酶溶液（含 2.21 mM 乙二胺四乙酸，EDTA），均匀覆盖细胞，室温孵育 2 分钟。</li>
	<li>用9 ml完全培养基（按步骤1.1配制）终止胰蛋白酶活性，并通过轻柔吹打细胞悬液10次，使液体均匀覆盖培养瓶表面，从而收集细胞。</li>
	<li>使用血细胞计数板或电子计数器测定细胞浓度，并用移液器吸取可提供每孔250,000个细胞的细胞悬液体积，加入无菌的15 ml离心管中。</li>
	<li>通过离心沉淀细胞悬液（800 × g）, 2分钟）。用生长培养基（步骤1.2中配制）重悬细胞沉淀，调整细胞浓度至每70 μl含250,000个细胞。 
	注意：由于在可渗透的微孔膜插入物中进行的细胞培养基于二维基质，细胞接种操作与此类似，但应先将细胞悬浮于含有50%（体积/体积）胎牛血清（FBS）的培养基中，以促进细胞贴壁。</li>
</ol>
2. 插入片段的制备
注意：为确保无菌条件，应在专用于细胞培养的层流生物安全柜中操作。
<ol>
	<li>选择孔径为 0.4 μm、1 μm 或 3 μm 的插入式培养小室（具体孔径根据实验目的确定，因孔径大小可用于探究不同细胞间通讯方式的作用）。 
	注意：0.4 μm 孔径足够小，可限制插入膜两侧细胞间功能性缝隙连接的形成，因此可用于研究细胞间通过分泌因子进行的通讯。而 1 μm 和 3 μm 孔径较大，允许功能性缝隙连接的形成，因此可用于同时研究通过缝隙连接和分泌因子介导的细胞间通讯。</li>
	<li>从包装中取出单个插件，并放入大小相同的多孔培养皿中。 
	注意：插入物可提供不同膜表面积，以满足特定应用需求（例如．，6孔、12孔和24孔插入式培养板）。此处结果使用6孔插入式培养板获得，因此模型描述将以此为重点。</li>
	<li>用培养皿盖盖住含有插入物的培养皿。用双手握住多孔板，轻轻翻转培养皿，使插入物底部（即， 下侧现在朝上。</li>
	<li>移除多孔培养板的底部，暴露出插件的底面。每次操作一个插件，使用无菌镊子轻轻夹住插件并固定。用另一只手取一支带有宽口吸头的移液器，吸取70 μl细胞悬液（按步骤1.3–1.8制备），其中含有250,000个细胞。</li>
	<li>接种细胞时，将移液器枪头轻轻置于小室膜的中央，缓慢加入70 μl细胞悬液，同时缓慢移动枪头使其覆盖膜表面。注意不要将枪头和细胞悬液延伸至小室边缘。 
	注意：接触插入物的边缘可能导致细胞悬液的毛细张力丧失，从而在细胞贴壁过程中引起细胞干燥。</li>
	<li>对剩余的插入物重复上述操作，注意不要在暴露的插入物上方直接操作，以避免潜在的微生物污染。</li>
	<li>轻轻将多孔板底部放回以覆盖插入物。保持多孔板及其插入物倒置状态，在含5%（体积/体积）CO₂的湿润空气环境中孵育。2 37 °C 下孵育 30–45 分钟。 
	注意：如果插入物上的细胞悬液接触到孔底部，请小心将培养皿底部抬起并倚靠在培养皿上部边缘，使其形成轻微倾斜角度，从而增大培养皿表面与插入物底侧（细胞接种位置）之间的距离。这可以防止细胞附着在孔表面而非插入物上。</li>
	<li>孵育30-45分钟后，轻柔取出含有插入物的培养皿，放入层流生物安全柜中。</li>
	<li>用双手并保持培养皿盖紧闭，轻轻将培养皿再次倒置，使含有贴壁细胞的插入物底部朝下。</li>
	<li>缓慢而小心地向每个孔中加入 2 ml 预热的完全培养基（对于 3 μm 孔径的插入式培养小室，加入 1 ml，以避免细胞穿过小室孔隙），使插入式培养小室的底部浸入培养基中。</li>
	<li>在所有含有插入物的孔中加入生长培养基后，将培养皿放回加湿的培养箱中。</li>
	<li>将插入物在培养箱中静置培养48小时。48小时后，通过从孔底部吸出2 ml培养基，并加入2 ml新鲜生长培养基，对细胞进行换液。</li>
	<li>在向孔板底部加入新鲜培养基后，将1 ml第二细胞群体悬液（约250,000 个细胞/ml）接种至小室插入膜的上侧，此时插入膜的下侧已生长有第一细胞群体（在本实验中，将AG1522（对照）细胞或肿瘤（实验）细胞接种于小室插入膜的上侧，而下侧已接种将分化为CAFs的AG1522细胞）。将培养皿重新放回湿润的培养箱中。 
	注意：如果所使用的细胞在插入物底部贴附效果不佳，可将这些细胞培养在插入物的上表面。</li>
	<li>在细胞接种至插件上层后的24、72和96小时更换培养基，通过吸出插件上层和孔底部的培养基进行操作。轻柔地向插件上层加入1 ml新鲜培养基，向孔底部加入2 ml新鲜培养基。使两群细胞在可渗透微孔插件膜的两侧共培养120小时。</li>
</ol>
3. 通过胰蛋白酶消化法从插入物中收集细胞
注意：除了能够轻松获得富集的细胞群体外，插入式肿瘤微环境模型还允许进行类似的实验处理（例如，化学物质孵育，暴露于高于或低于环境大气的氧气条件，电离辐射处理， 等等。）以及其他 体外 TME 共培养模型。此外，可使用已为标准二维组织培养模型开发的实验流程来分析可渗透插入式共培养基质。例如，可从插入膜的任一侧收集细胞，以获得高度富集的细胞群体，随后可用于终点指标的分析例如，原位 免疫检测、蛋白质印迹（Western blotting）或用于后续实验的扩增36.
<ol>
	<li>收集细胞时，将小室从生长培养基中取出，放入含有 1 ml PBS 的 35 mm 细胞培养皿中。用 1 ml PBS 分别清洗小室的底部和顶部各一次。</li>
	<li>吸除 PBS，加入 200 μl 预热至室温的含 2.21 mM EDTA 的 0.25%（体积/体积）胰蛋白酶溶液。
	<ol>
		<li>若收集生长在小室底部的细胞，将胰蛋白酶溶液加入 35 mm 培养皿中，轻轻将小室底部浸入胰蛋白酶溶液，室温孵育 2 分钟。</li>
		<li>若收集生长在小室顶部的细胞，将小室放入 35 mm 培养皿中，将胰蛋白酶溶液加至小室顶部，并在室温孵育 2 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入 800 μl 完全生长培养基以终止胰蛋白酶活性。
	<ol>
		<li>若收集小室底部的细胞，将生长培养基加入 35 mm 培养皿中，用移液器将 1 ml 细胞悬液在小室表面轻柔吹打 10 次，同时将小室保持轻微倾斜，使细胞悬液流入培养皿中收集。</li>
		<li>若收集小室顶部的细胞，将生长培养基加至小室顶部，然后轻柔吹打 1 ml 细胞悬液经过小室表面 10 次。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 通过流式细胞术表征细胞纯度
注意：为了表征可渗透微孔膜插件维持两种细胞群体纯度的能力（即， 顶部和底部）最多120小时，进行了第1-3步操作，将表达绿色荧光蛋白（GFP）标记的MDA-MB-231细胞接种于插入物的顶部，将未标记GFP的AG1522细胞接种于孔径为0.4 µm、1 µm或3 µm的插入物底部。
<ol>
	<li>一旦收集了插入物底部的细胞（见第3节所述步骤），通过离心（500 g）沉淀细胞悬液, 30 秒</li>
	<li>移去上清液，将细胞沉淀重悬于400 µl含1%（体积比）FBS的Hanks' Balanced Salt Solution（HBSS）中。</li>
	<li>使用配备488 nm激光器以激发GFP、并配有530/30带通滤光片以检测GFP光子发射的流式细胞仪进行流式细胞分析37.</li>
	<li>为便于细胞鉴定，使用 AG1522 对照细胞群体调整流式细胞仪的前向散射和侧向散射电压。调整 GFP 通道电压，将细胞自发荧光值设为 GFP 信号的最低检测阈值。</li>
	<li>使用对照细胞确定门控阈值。根据GFP阳性细胞相对于对照的存在情况评估各细胞群的纯度。 
	注意：纯细胞群应表现为未检测到GFP阳性细胞。</li>
</ol>
5. 通过以下方法对细胞进行表征 原位 免疫荧光
<ol>
	<li>将插入物中的细胞进行胰蛋白酶消化后（参见第3节），收集细胞，取5 × 104个细胞接种于250 μl生长培养基中（参见步骤1.1），滴加至无菌玻璃盖玻片上，在37 °C、含5% (vol/vol) CO2的湿化空气环境中孵育1小时，使细胞贴壁。</li>
	<li>孵育结束后，轻柔取出含有盖玻片的培养皿，置于层流通风生物安全柜中。</li>
	<li>向每皿中小心加入2 ml预热的完全培养基（参见步骤1.1），确保盖玻片完全浸没。</li>
	<li>向所有含盖玻片的培养皿中加入生长培养基后，将培养皿放回37 °C、含5% (vol/vol) CO2的湿化空气环境中继续孵育48小时。</li>
	<li>48小时孵育结束后，用PBS洗涤样本3次，随后在室温下用含4% (wt/vol) 甲醛的PBS固定10分钟。</li>
	<li>用Tris缓冲盐水（TBS：50 mM Tris-Cl，pH 7.5，150 mM NaCl）洗涤5次，然后在室温下用含0.25% (vol/vol) Triton X-100和0.1% (wt/vol) 皂苷的溶液处理5分钟，进行通透。</li>
	<li>在室温下用封闭液（含2% (vol/vol) 正常山羊血清（NGS）、1% (wt/vol) 牛血清白蛋白（BSA）和0.1% (vol/vol) Triton X-100的TBS溶液）封闭非特异性结合位点，孵育1小时。</li>
	<li>在封闭液中加入一抗（抗Caveolin 1（CAV1），稀释比例1:1,000），4 °C孵育过夜。</li>
	<li>用洗涤液（含0.2% (vol/vol) NGS、1% (wt/vol) BSA和0.1% (vol/vol) Triton X-100的TBS溶液）洗去未结合的一抗，洗涤3次，每次5分钟。</li>
	<li>在封闭液中加入二抗，室温孵育1小时（参见第5.4节）。</li>
	<li>用洗涤液（参见步骤5.6）洗去未结合的二抗，洗涤3次，每次5分钟。</li>
	<li>将盖玻片用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的抗荧光淬灭封片剂封固于载玻片上，并用指甲油密封。</li>
	<li>使用配备外部光源用于荧光激发的倒置显微镜，以63倍油镜观察细胞，并通过连接的数字相机采集图像，用于后续分析。</li>
</ol>
6. 通过蛋白质印迹法对细胞进行表征
注意：Western印迹实验步骤在其他地方已有描述38。此处仅作简要概述：
<ol>
	<li>通过胰蛋白酶消化使细胞从插入物上脱离后（见第3节），将细胞悬液以500 g离心30秒，收集细胞沉淀。</li>
	<li>弃去上清液，用100 µl PBS将细胞沉淀重悬2次。</li>
	<li>弃去上清液，加入50 µl改良的放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液（含50 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl、1% (vol/vol) NP40、0.5% (vol/vol) 脱氧胆酸钠一水合物（DOC）、0.1% (vol/vol) 十二烷基硫酸钠（SDS）），并加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物，裂解细胞。</li>
	<li>冰上孵育20分钟，然后在4 °C下以19,000 g离心15分钟。</li>
	<li>使用与RIPA缓冲液中去垢剂兼容的蛋白光密度检测法测定上清液中的蛋白浓度。</li>
	<li>通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白，并电转至0.2 µm硝酸纤维素膜上。</li>
	<li>将膜置于含0.1% (vol/vol) Tween-20（TBST）和4% (wt/vol) 脱脂奶粉（封闭液）的TBS中，室温封闭60分钟，随后加入一抗（抗CAV1抗体，1:1,000）在4 °C孵育过夜。</li>
	<li>在室温下用TBST洗涤膜3次，每次5分钟。</li>
	<li>将膜在含辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗小鼠二抗（1:5,000）的封闭液中孵育30分钟。</li>
	<li>在室温下用TBST洗涤膜3次，每次5分钟。</li>
	<li>使用Western blot检测系统通过化学发光法显影反应产物。</li>
</ol>
7. 通过流式细胞术表征细胞间通讯
注意：为了表征可渗透微孔膜插件在研究不同细胞间通讯模式（例如，分泌因子、间隙连接）中的适用性，第1-2.12节实验使用非荧光标记的AG1522细胞，将其接种于孔径为0.4 µm、1 µm或3 µm的插件的底侧。
<ol>
	<li>在35 mm培养皿中，使用1.1节所述培养基将未标记的AG1522细胞培养至90%融合度。</li>
	<li>用1 ml HBSS冲洗细胞1次。</li>
	<li>将细胞与含有30 µM Calcein AM的HBSS共同孵育，使细胞负载Calcein AM。</li>
	<li>在含5%（体积/体积）CO₂的湿润空气环境中孵育15分钟2 在 37 °C 下。</li>
	<li>用1 ml HBSS洗涤细胞2次。</li>
	<li>用含有2.21 mM EDTA的0.25%（体积比）胰蛋白酶溶液200 µl在室温下消化细胞2分钟。</li>
	<li>通过加入含有12.5%（体积比）FBS的800 µl完全培养基以终止胰蛋白酶活性。</li>
	<li>通过反复吹打使细胞悬浮。</li>
	<li>使用血细胞计数板或电子计数器测定细胞浓度，将250,000个负载Calcein AM的细胞接种至小室的上侧，该小室的下侧已培养有AG1522细胞。</li>
	<li>在含5% CO₂的湿润空气环境中孵育插入物2 在 37 °C 6 小时。</li>
	<li>6 小时后，按照第 3 节所述，从插入物的底面收集细胞。</li>
	<li>离心（500 g，30 秒）使细胞悬液沉淀。</li>
	<li>移除上清液，将细胞沉淀重悬于400 µl含1%（体积比）FBS的HBSS中。</li>
	<li>使用配备有能够激发和检测Calcein（分别为496 nm和516 nm）的激光器和滤光片的流式细胞仪，按照制造商方案对细胞进行分析。</li>
	<li>为进行细胞鉴定，使用未染色的 AG1522 对照细胞群体调节流式细胞仪的前向散射和侧向散射电压。调节钙黄绿素（Calcein）通道电压，将细胞自发荧光值设为钙黄绿素信号的最低检测阈值。</li>
	<li>使用负载钙黄绿素的对照细胞确定上限阈值。根据每个细胞小室中钙黄绿素阳性细胞相对于对照的存在情况评估通讯。</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性或冲突性利益。

本方案描述了一种简单且可灵活调整的方法 体外 实验步骤图1利用可渗透的微孔膜插入物，从异型细胞共培养体系中分离出高度富集的单一群体细胞。该模型的重要优势在于适用于研究多种细胞间通讯模式。关键技术步骤包括：根据特定实验需求选择合适孔径的插入物，将第一群细胞接种于插入物底部，培养基中添加50% FBS，随后将第二群细胞接种于插入物顶部，并将两个不同细胞群体共培养适当时间。我们证明该系统能够模拟多种 体内 特征，从而为理解早期肿瘤微环境（TME）演化过程中发生的分子、表型及潜在变化提供了更充分的机会，弥补了现有许多TME模型的主要缺陷 体外 模型（图2).
该模型可轻松修改，以允许研究癌症-基质发育及肿瘤微环境演化过程中细胞间相互作用的各个方面（图4）。尽管0.4 µm孔径的插入式培养小室允许两种细胞群体之间进行紧密的相互作用45，它显著限制了生长在插入膜两侧的细胞之间功能性间隙连接的形成（图4<...

肿瘤微环境（TME）是一个高度复杂的系统，由癌细胞与宿主间质共同存在并协同演化而成。该间质成分通常包括成纤维细胞、肌成纤维细胞、内皮细胞、多种免疫组分以及细胞外基质1。其中一个重要组分，往往是间质的主体部分，是被激活的成纤维细胞，通常被称为癌症相关成纤维细胞或癌相关成纤维细胞（CAF）2,3。与正常的非激活状态成纤维细胞不同，CAF在多种癌症中促进肿瘤的起始、进展、血管生成、侵袭、转移和复发4-11，这些癌症包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、皮肤癌、结肠癌、食管癌和卵巢癌5,6,12-17。然而，CAF在整个癌症发病过程中所起作用的具体性质仍不明确。此外，临床证据表明CAF具有预后价值，其存在与高级别恶性肿瘤、治疗失败以及总体不良预后相关10,18,19。
显然，加深对癌相关成纤维细胞（CAF）发育起始事件及其在肿瘤微环境（TME）中介导作用的细胞间通讯机制的理解，可能为改善患者预后提供令人期待的新型治疗靶点和优化策略。为实现这一目标，已有若干 体内 和 体外 已开发出多种模型。尽管 体内 尽管这些方法更能反映患者体内的肿瘤微环境（TME），但仍存在局限性，包括肿瘤内部及肿瘤之间的巨大复杂性和异质性。此外，来自人类受试者的肿瘤样本通常代表的是高度发育成熟的TME，因而无法揭示TME初始事件的发生机制。实验动物研究虽具有一些优势，但由于人类与动物（如啮齿类）在生理学上存在差异，将动物研究数据外推至人类时应谨慎对待。例如， 巯基化学20代谢率21，对胁迫的耐受性22, 等等。此外，与具有天然遗传异质性的人群不同，实验动物通常经过培育以达到遗传同质性。同时，使用大鼠等动物模型往往难以检测短暂的生理波动和细胞表型变化，也难以对特定的实验参数进行精确控制。因此， 体外 二维和三维（2D和3D）组织培养模型常被用于深入理解肿瘤微环境（TME）的发育基础。尽管这些模型无法准确再现TME复杂性的全貌， 体内 这些模型具有显著优势，可极大地促进机制研究。 体外 模型能够对肿瘤微环境（TME）进行更简化、更集中且更具成本效益的分析，从而在排除动物体内系统性变异干扰的细胞中生成具有统计学意义的数据。
有多种类型 体外 系统。最常用的两种TME 体外 模型包括混合单层细胞培养或球状细胞培养。这两种培养方法均有利于细胞间相互作用的基础研究。例如， 正常细胞与肿瘤细胞）以及对肿瘤微环境（TME）中特定细胞表型变化的分析（例如，癌相关成纤维细胞由正常成纤维细胞转化而来）。此外，类球体能够形成更接近真实组织结构的肿瘤微环境，并可体现肿瘤异质性23然而，球状体通常会在不同层间产生差异较大的氧张力梯度，这可能会使实验结论的解读变得复杂。24不幸的是，这两种模型在共培养后分离出用于进一步表征和研究的纯细胞群体方面均存在极大局限性。要实现这一目标，至少需要对一种细胞类型进行荧光标记或使用特异性标识物进行标记，然后对混合的共培养物进行大量处理并通过细胞分选来分离不同细胞群体。尽管细胞分选仪能够分离出较为纯净的细胞群体，但操作过程中必须注意细胞应激以及潜在的微生物污染风险25.
为了促进对细胞间通讯的理解，研究人员已投入大量努力用于开发和优化 体外 紧密模拟的系统 体内 环境，同时简化操作流程。其中一种工具是可渗透微孔插件，这是一种膜基质，最早于1953年开发。26 并随后被改进用于多种应用和研究（例如细胞极性27内吞作用28药物转运29组织建模30，受精31，旁观者效应32,33, 等等。）。该系统允许细胞在特定条件下生长 体内-样的解剖和功能分化，以及多种基因的表达 体内 标记物34,35 在不可渗透的塑料器皿上培养时则观察不到这些现象。此外，这种极薄的多孔膜（10 µm 厚）可实现分子的快速扩散和快速平衡，从而模拟了 体内 环境，并允许细胞在顶端和基底外侧区域均能独立发挥功能。该插入装置作为肿瘤微环境系统的一项额外优势在于，它能够在相同环境条件下，通过膜上的孔隙在物理上分隔生长于膜两侧的两种异质细胞群体，同时维持细胞间通过膜孔隙进行的多种交流模式。尽管这两种细胞群体在物理上相互分离，但它们通过分泌物质实现代谢偶联，正如本文所述，还可通过间隙连接通道进行通讯。此外，通过将插入装置维持在 体内 氧分压（PO2），该模型减少了其他系统中常见的氧气和化学梯度带来的复杂性，从而更有利于理解调控肿瘤微环境（TME）的自然机制。值得注意的是，在长期共培养后，无需荧光标记和/或细胞分选，即可轻松分离出两种细胞群体，并保持高纯度。
在此我们描述一种 体外 TME方案，包含人乳腺癌细胞和人成纤维细胞，分别培养于可渗透微孔膜插入物的两侧，通过膜孔实现持续的双向通讯。我们展示，通过使用不同孔径的膜，可区分特定类型细胞间通讯的贡献例如，可研究分泌因子与间隙连接等对肿瘤微环境（TME）形成的影响。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;细胞培养用&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AG01522 (&lt;em&gt;即&lt;/em&gt;，AG1522）人二倍体成纤维细胞</td><td>科里尔</td><td>107661</td><td>第8-13段</td></tr><tr><td>MDA-MB-231-luc-D3H1 乳腺腺癌细胞系</td><td>PerkinElmer</td><td>119261</td><td>亲本细胞系：ATCC（#HTB-26）</td></tr><tr><td>MDA-MB-231/GFP 乳腺腺癌细胞系</td><td>Cell Biolabs</td><td>AKR-201</td><td></td></tr><tr><td>Eagle最小必需培养基（MEM）</td><td>Corning Cellgro</td><td>15-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS），经认证合格</td><td>Sigma</td><td>F6178-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Corning GlutaGro 补充剂（200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-015-Cl</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液，100倍浓缩液</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Transwell 小室（插入式）&lt;em&gt;即&lt;/em&gt;，可渗透的微孔膜插入物）（0.4 &amp;mu;微孔</td><td>Costar</td><td>3450</td><td></td></tr><tr><td>Transwell 小室&lt;em&gt;即&lt;/em&gt;，可渗透的微孔膜插件）（1 &amp;mu;微孔</td><td>Greiner bio-one</td><td>657610</td><td></td></tr><tr><td>Transwell 小室&lt;em&gt;即&lt;/em&gt;，可渗透的微孔膜插入物）（3 &amp;mu;微孔</td><td>Costar</td><td>3452</td><td></td></tr><tr><td>6孔培养板</td><td>Greiner Bio-One Cellstar</td><td>657160-01</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 细胞培养瓶</td><td>CellStar</td><td>658 170</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），1x</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td>不含钙 &amp;和镁</td></tr><tr><td>0.25%（体积/体积）胰蛋白酶，2.21 mM EDTA，1×</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-053-Cl</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>CellTreat</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>35 mm × 10 mm 细胞培养皿</td><td>Greiner bio-one</td><td>627 160</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;用于免疫荧光显微镜检查&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗Caveolin 1</td><td>BD 转导实验室</td><td>610406</td><td>&lt;em&gt;原位&lt;/em&gt; 免疫荧光 - 1:5,000</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 488标记</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A-11029</td><td>&lt;em&gt;原位&lt;/em&gt; 免疫荧光 - 1:2,000</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 - 第五组分</td><td>Rockland</td><td>BSA-50</td><td>免疫球蛋白和蛋白酶无污染</td></tr><tr><td>16% (wt/vol) 甲醛溶液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>28908</td><td>用1×PBS稀释至4%</td></tr><tr><td>优质盖玻片（22 mm × 22 mm，No.1）</td><td>Fisher</td><td>12548B</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>含DAPI的SlowFade Gold抗荧光淬灭试剂</td><td>Invitrogen</td><td>S36938</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;用于流式细胞术分析&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcein, AM</td><td>分子探针</td><td>C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14025-076</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;用于蛋白质印迹分析&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗Caveolin 1</td><td>BD 转导实验室</td><td>610406</td><td>Western Blot - 1:1,000</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BioRad</td><td>170-6531</td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜（0.2 &amp;mu;m)</td><td>BioRad</td><td>162-0112</td><td></td></tr><tr><td>Western Lightning Plus-ECL</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL104001EA</td><td></td></tr><tr><td>BioRad DC 蛋白检测试剂盒</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>BioRad</td><td>161-0302</td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠一水合物（DOC）</td><td>Sigma</td><td>D5670</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630（NP40）</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液，37.5:1</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>161-0158</td><td></td></tr></tbody></table>

肿瘤微环境的模拟：一种用于富集细胞群体及研究细胞间通讯的简单方法

A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

理解癌细胞与周围非癌性间质之间的早期异型相互作用，对于阐明导致间质激活及肿瘤微环境（TME）形成的事件至关重要。多个 体外 和 体内 肿瘤微环境（TME）模型已被开发出来；然而，总体而言，这些模型通常难以在不干扰细胞状态的条件下，有效分离出单一的细胞群体以供进一步研究。为克服这一难题，我们采用了 体外 使用由可渗透微孔膜插入物组成的细胞生长基质构建肿瘤微环境（TME）模型，该模型可在插入物膜的两侧分别共培养细胞，实现紧密但分离的长期共培养，并可简便地获得高度富集的细胞群体。通过该模型，我们能够在与高转移性人乳腺癌细胞共培养（120小时）后，从正常的二倍体人成纤维细胞中获得显著富集的癌症相关成纤维细胞（CAF）群体，且无需使用荧光标记和/或细胞分选技术。此外，通过调节插入物的孔径大小，可控制细胞间通讯的方式。例如，缝隙连接通讯，分泌因子）之间的两种异质细胞群，从而允许研究肿瘤微环境（TME）发育背后的机制，包括缝隙连接通透性的作用。该模型是深入理解癌症-间质启动的初始事件、TME的早期演化过程以及间质对癌细胞治疗反应调节作用的有力工具。

在此，我们采用了一种可渗透的微孔膜插入装置来开发一种 体外 模拟异型细胞共培养系统 体内 肿瘤微环境（图1）。该系统允许在小室的多孔膜两侧长期共培养两种不同的细胞群体（在我们的应用中可长达120小时）。重要的是，该系统能够维持细胞群体的纯度，这一点通过将表达GFP标记的MDA-MB-231细胞接种于0.4、1或3 μm孔径小室的上侧，并使其与接种于小室下侧的AG1522细胞共培养120小时来验证。培养结束后，收集小室下侧的细胞，通过流式细胞术分析是否存在GFP阳性的MDA-MB-231细胞，以判断细胞群体纯度是否丧失。分析结果显示，使用0.4和 1 µm-孔插件，分别；然而，带有插件的 3 µm 孔径无法维持细胞群体的分离，因为孔径过大，足以使大量表达GFP的MDA-MB-231细胞迁移穿过膜图2).
重要的是，通过 原位 通过免疫...

我们采用了一种可渗透的微孔膜插入装置来模拟肿瘤微环境（TME）。该模型包含混合细胞培养体系，可在无需荧光标记或细胞分选的情况下，简便地获得高度富集的单一细胞群体，并允许在正常或应激条件下研究肿瘤微环境中细胞间的相互通讯。

理解癌细胞与周围非癌性间质之间的早期异型相互作用，对于阐明相关事件至关重要……

本简单体外共培养模型的总体目标是模拟体内肿瘤微环境的特征，富集单个细胞群体，并研究细胞间通讯的各种模式。该方法有助于回答癌症和放射生物学领域中的关键问题，特别是关于癌症相关成纤维细胞生成的潜在因素以及对治疗药物的反应机制。该技术的主要优势在于，无需通过诱导应激的荧光标记或细胞分选，即可从混合细胞培养物中获得独立的细胞群体。首先用 5 毫升 PBS 对目标细胞培养物洗涤两次。第二次洗涤后，加入 1 毫升室温的胰蛋白酶-EDTA 溶液，室温下作用 2 分钟以使细胞脱离。然后加入 9 毫升完全培养基终止反应，并轻轻吹打培养瓶表面 10 次，使细胞充分解离。计数后，用新鲜培养基将细胞稀释至2.5 × 10⁵ 个细胞/毫升的浓度，转移至无菌的15毫升离心管中。通过离心沉淀细胞，然后将细胞沉淀重悬于新鲜生长培养基中，该培养基添加有50%胎牛血清，重悬浓度为每70微升培养基含2.5 × 10⁵ 个细胞。接着，将相应实验孔径的插入式培养小室从包装中取出，放入多孔板的各个孔中，并盖上培养板盖。然后用双手握住培养皿，轻轻倒置，使插入物的底部朝上。移除培养皿的底部。用一只手使用无菌镊子固定一个插入物，另一只手缓慢将70微升细胞吸入微量移液器吸头中。然后将细胞缓慢滴加到此时位于上方的插入式培养小室的表面。接种完每个插入式培养小室后，小心地将培养皿底部放回原位，并将倒置的培养皿在37摄氏度、5%二氧化碳及湿度条件下孵育30至45分钟。孵育结束后，在超净生物安全柜中小心地将培养皿重新翻转，使插入式培养小室的底部朝下。然后缓慢而小心地将每个插入物的底部浸入2 mL预热的完全培养基中，并将培养皿放回湿化培养箱。48小时后，将每个孔底部的培养基更换为2 mL新鲜生长培养基。待所有培养基更换完毕后，在1 mL新鲜培养基中将5 × 10⁴个目标第二细胞群体接种至插入物顶部，并将培养皿放回培养箱。24、48 和 96 小时后，将每个插入物上方的培养基更换为 1 毫升新鲜的完全培养基，将每个孔底部的培养基更换为 2 毫升新鲜的完全培养基。共培养 120 小时后，逐个将插入物转移至含有 1 毫升 PBS 的 35 毫米细胞培养皿中。用1毫升PBS清洗插入物的底部和顶部。为收集在插入物底部生长的细胞，将插入物底部朝下放入200微升室温的胰蛋白酶-EDTA溶液中。室温孵育2分钟后，加入800微升完全培养基终止反应。然后将插入物保持轻微倾斜角度，用移液器将上清液轻柔地在细胞表面吹打10次，收集培养皿中的细胞。当所有插入物均处理完毕后，将细胞重悬于生长培养基中，浓度为每毫升含2 × 10⁵个细胞。随后，向无菌的单个玻璃盖玻片上各加入250 µL细胞悬液。将盖玻片放入湿润的培养箱中孵育一小时。孵育结束后，在超净工作台中小心向培养皿中加入两毫升完全培养基，于37摄氏度、5%二氧化碳及湿润环境中继续培养48小时。随

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Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

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