肿瘤微环境的模仿:产生富集的细胞群及侦查间通讯的简单方法

这种简单的体外共培养模型的总体目标是模拟体内肿瘤微环境的特征，丰富单个细胞群，并研究细胞间通讯的各种模式。这种方法可以帮助回答癌症和放射生物学领域的关键问题，特别是关于癌症相关成纤维细胞产生的潜在因素和对治疗剂的反应。该技术的主要优点是它允许从混合细胞培养物中生成单个细胞群，而无需应激诱导荧光标记或细胞分选。

首先用 5 ml PBS 洗涤目标细胞培养物 2 次。第二次洗涤后，用 1 mL 室温胰蛋白酶-EDTA 在室温下分离细胞 2 分钟。然后用 9 毫升完全生长培养基淬灭反应，在培养瓶表面轻轻移液 10 次以解离细胞。

计数后，在新鲜培养基中将细胞稀释至每毫升浓度 10 至 5 个细胞的 2.5 倍，并将细胞转移至无菌 15 毫升离心管中。通过离心细胞，并将沉淀重悬于补充有 50% 胎牛血清的新鲜生长培养基中，每 70 μL 培养基浓度为 10 至 5 个细胞。接下来，将适当实验孔径的小室从包装中转移到多孔培养皿的各个孔中，并盖上培养皿。

然后用双手握住培养皿，轻轻倒置培养皿，直到插入物底部朝上。取出盘子的底部。一只手使用无菌镊子，将一个插件固定到位，然后用另一只手将 70 微升细胞缓慢吸入微量移液器吸头中。

然后慢慢地将细胞分配到现在插入片段顶部的表面上。接种每个插入物后，小心地放回培养皿底部，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳和湿度下孵育倒置的培养皿 30 至 45 分钟。孵育结束时，在层流生物安全柜中小心地将培养皿倒置，使插入片段的底部现在朝下。

然后缓慢而小心地将每个插入物的底部浸入两毫升预热的完全培养基中，然后将培养皿放回加湿培养箱中。48 小时后，用 2 毫升新鲜生长培养基替换每个孔底部的培养基。当所有培养基都已刷新后，将 2.5 乘以 10 的第二种目标细胞群的第五个细胞接种到 1 毫升新鲜培养基中，然后放回培养皿中。

24、48 和 96 小时后，用 1 毫升新鲜的完全培养基替换每个插件顶部的培养基。每个孔底部的培养基中加入 2 毫升新鲜完全培养基。共培养 120 小时后，将一个插入片段一次转移到含有 1 mL PBS 的单个 35 mm 细胞培养皿中。

并用 1 毫升 PBS 清洗插入物的底部和顶部。要收集在插入片段底部生长的细胞，请将插入片段底部朝下放入 200 μL 室温胰蛋白酶-EDTA 中。在室温下放置 2 分钟后，用 800 μL 完全生长培养基终止反应。

然后以一个小角度握住插入物，轻轻地将上清液移液到细胞表面 10 次，将细胞收集在培养皿中。当所有插入片段都被剥离后，以每毫升生长培养基的 2 倍 10 至第五个细胞的浓度重悬细胞。并将 250 μL 细胞添加到无菌的单个玻璃盖玻片上。

将盖玻片放入加湿培养箱中 1 小时。孵育结束时，在层流生物安全柜中，小心地向培养皿中加入 2 毫升完全生长培养基，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳和湿度下孵育 48 小时。然后用 PBS 洗涤细胞 3 次。

第三次洗涤后，将细胞在室温下用 4% 甲醛的 PBS 溶液固定 10 分钟，然后用 Tris 缓冲盐水洗涤五次。最后一次洗涤后，用添加 0.1 皂苷的 0.25% Triton X-100 在室温下透化细胞 5 分钟，然后在封闭溶液中在室温下孵育 1 小时。接下来，用感兴趣的一抗标记样品，在 4 摄氏度下封闭过夜。

第二天早上，在洗涤液中洗涤 3 分钟，去除未结合的抗体，然后在封闭液中适当的二抗室温孵育 1 小时。孵育结束时，如刚才所示洗涤未结合的二抗，并使用含有 DAPI 的抗淬灭封固剂将盖玻片固定在单个载玻片上。用透明指甲油密封盖玻片边缘。

然后在配备外部荧光激发光源的倒置显微镜上以 63 倍油放大倍率对细胞进行成像。该系统允许两种不同的细胞群在细胞培养小室的多孔膜的两侧生长至少 120 小时，当使用具有 0.4 或 1 微米孔径的小室时，膜两侧的细胞群保持高于 99% 的纯度。然而，具有三个微米孔的插入片段足够大，可以让细胞跨膜迁移，正如在本实验中使用 GFP 阳性人乳腺癌细胞系观察到的那样。

0.4 微米孔插入片段还限制了插入片段两侧细胞培养物之间功能性间隙连接的形成，从而限制了与分泌因子的通讯。然而，具有 1 微米和 3 微米孔的插入片段允许细胞通过间隙连接进行功能偶联，如在这些共培养物中荧光标记跨膜转移所示。重要的是，该系统可用于在正常人二倍体成纤维细胞与乳腺癌细胞共培养后有效地从它们产生癌症相关的成纤维细胞，与人乳腺癌细胞共培养的成纤维细胞上 caveolin-1 的表达降低证明了这一点。

在尝试此过程时，选择孔径足以满足所探讨的问题的插入片段非常重要。并在插入片段的底部看到第一个细胞群，以促进它们的附着。在此程序之后，可以进行其他方法，如免疫印迹、原位免疫荧光或大多数其他基于细胞的检测，以回答有关蛋白质表达改变、侵袭和迁移变化或对治疗剂反应差异的其他问题。

发展之后，这项技术为癌症生物学和放射生物学领域的研究人员铺平了道路，以探索导致肿瘤微环境发展、进化的因素，以及在我们的例子中，电离辐射从靶细胞到附近旁观细胞的有害影响的传播。观看此视频后，您应该对如何制备混合细胞共培养、维持共培养以及从共培养中收获高纯度富集细胞群以进行进一步分析有很好的了解。不要忘记，与人类细胞株或细胞系一起工作可能很危险，在执行此程序时应佩戴适当的个人防护设备，并遵守适当的生物安全法规。

感谢您的观看，祝您的实验好运。