肿瘤微环境的模拟：一种用于富集细胞群体及研究细胞间通讯的简单方法

本简单体外共培养模型的总体目标是模拟体内肿瘤微环境的特征，富集单个细胞群体，并研究细胞间通讯的各种模式。该方法有助于回答癌症和放射生物学领域中的关键问题，特别是关于癌症相关成纤维细胞生成的潜在因素以及对治疗药物的反应机制。该技术的主要优势在于，无需通过诱导应激的荧光标记或细胞分选，即可从混合细胞培养物中获得独立的细胞群体。

首先用 5 毫升 PBS 对目标细胞培养物洗涤两次。第二次洗涤后，加入 1 毫升室温的胰蛋白酶-EDTA 溶液，室温下作用 2 分钟以使细胞脱离。然后加入 9 毫升完全培养基终止反应，并轻轻吹打培养瓶表面 10 次，使细胞充分解离。

计数后，用新鲜培养基将细胞稀释至2.5 × 10⁵ 个细胞/毫升的浓度，转移至无菌的15毫升离心管中。通过离心沉淀细胞，然后将细胞沉淀重悬于新鲜生长培养基中，该培养基添加有50%胎牛血清，重悬浓度为每70微升培养基含2.5 × 10⁵ 个细胞。接着，将相应实验孔径的插入式培养小室从包装中取出，放入多孔板的各个孔中，并盖上培养板盖。

然后用双手握住培养皿，轻轻倒置，使插入物的底部朝上。移除培养皿的底部。用一只手使用无菌镊子固定一个插入物，另一只手缓慢将70微升细胞吸入微量移液器吸头中。

然后将细胞缓慢滴加到此时位于上方的插入式培养小室的表面。接种完每个插入式培养小室后，小心地将培养皿底部放回原位，并将倒置的培养皿在37摄氏度、5%二氧化碳及湿度条件下孵育30至45分钟。孵育结束后，在超净生物安全柜中小心地将培养皿重新翻转，使插入式培养小室的底部朝下。

然后缓慢而小心地将每个插入物的底部浸入2 mL预热的完全培养基中，并将培养皿放回湿化培养箱。48小时后，将每个孔底部的培养基更换为2 mL新鲜生长培养基。待所有培养基更换完毕后，在1 mL新鲜培养基中将5 × 10⁴个目标第二细胞群体接种至插入物顶部，并将培养皿放回培养箱。

24、48 和 96 小时后，将每个插入物上方的培养基更换为 1 毫升新鲜的完全培养基，将每个孔底部的培养基更换为 2 毫升新鲜的完全培养基。共培养 120 小时后，逐个将插入物转移至含有 1 毫升 PBS 的 35 毫米细胞培养皿中。

用1毫升PBS清洗插入物的底部和顶部。为收集在插入物底部生长的细胞，将插入物底部朝下放入200微升室温的胰蛋白酶-EDTA溶液中。室温孵育2分钟后，加入800微升完全培养基终止反应。

然后将插入物保持轻微倾斜角度，用移液器将上清液轻柔地在细胞表面吹打10次，收集培养皿中的细胞。当所有插入物均处理完毕后，将细胞重悬于生长培养基中，浓度为每毫升含2 × 10⁵个细胞。随后，向无菌的单个玻璃盖玻片上各加入250 µL细胞悬液。

将盖玻片放入湿润的培养箱中孵育一小时。孵育结束后，在超净工作台中小心向培养皿中加入两毫升完全培养基，于37摄氏度、5%二氧化碳及湿润环境中继续培养48小时。随后用PBS洗涤细胞三次。

第三次洗涤后，在室温下用含4%多聚甲醛的PBS固定细胞10分钟，随后用Tris缓冲盐水洗涤5次。最后一次洗涤后，在室温下用含0.25% Triton X-100和0.1%皂苷的溶液对细胞进行5分钟的透化处理，接着在封闭液中室温孵育1小时。随后，将待测的一抗用封闭液稀释后，于4°C条件下对样本进行过夜孵育标记。

次日早晨，用洗涤液洗涤三次，每次三分钟，以去除未结合的抗体，随后在封闭液中，于室温下孵育一小时，加入相应的二抗。孵育结束后，按前述方法洗涤去除未结合的二抗，然后将盖玻片用含DAPI的抗荧光淬灭封片剂封固于载玻片上。用透明指甲油密封盖玻片边缘。

然后在配备外部光源用于荧光激发的倒置显微镜下，使用63倍油镜对细胞进行成像。该系统允许将两种不同的细胞群体分别培养在细胞培养小室的多孔膜两侧，培养时间至少达120小时；当使用孔径为0.4或1微米的小室时，可维持膜两侧细胞群体纯度超过99%。然而，使用孔径为3微米的小室时，孔径足够大，可允许细胞穿过膜迁移，这一点在本实验中使用GFP阳性的人乳腺癌细胞系得到了证实。

0.4 微米孔径的插入式培养装置也会限制插入装置两侧细胞培养物之间功能性间隙连接的形成，从而使细胞间的通讯仅限于分泌因子。然而，1 微米和 3 微米孔径的插入装置则允许细胞通过间隙连接实现功能性耦合，这在共培养体系中表现为荧光标记物穿过膜的转移。重要的是，该系统可有效用于在正常人二倍体成纤维细胞与乳腺癌细胞共培养后生成癌症相关成纤维细胞，这一点已通过与人乳腺癌细胞共培养的成纤维细胞中 caveolin-1 表达水平降低得到证实。

在进行该实验操作时，选择孔径大小适合所研究问题的插入式培养小室非常重要。同时，应在能够促进细胞贴附的培养基中观察到插入小室底部出现的首个细胞群体。完成该操作后，可进一步采用其他方法，如免疫印迹、原位免疫荧光染色，或大多数其他基于细胞的检测技术，以探究蛋白质表达水平的变化、侵袭与迁移能力的改变，或对治疗药物反应的差异等更多科学问题。

该技术建立后，为癌症生物学和辐射生物学领域的研究人员探索肿瘤微环境形成与演化的相关因素提供了途径，而在我们的研究中，则有助于揭示电离辐射从受照靶细胞向邻近旁观者细胞传递有害效应的机制。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备混合细胞共培养体系、维持共培养条件，以及从共培养体系中收获高纯度富集的细胞群体以进行后续分析。请务必注意，操作人源细胞株或细胞系可能存在生物安全风险，因此在执行本实验过程中，应穿戴适当的个人防护装备，并严格遵守相应的生物安全规范。

感谢观看，祝您的实验顺利。