Name: 单细胞下游特征的靶细胞预富集与全基因组扩增 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 学习使用抗体功能化金属丝从细胞悬液中预富集稀有靶细胞，结合显微操作或激光显微切割进行单细胞分离，并通过全基因组扩增实现下游分子遗传学分析。该方法适用于循环肿瘤细胞等液体活检样本的研究。

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本研究由奥地利科学基金（FWF）资助，项目编号 I 1220-B19（授予 P.S.），属于转化癌症研究 ERANET 项目（TRANSCAN）的一部分&#34;循环肿瘤细胞作为前列腺癌微小残留病的生物标志物（CTC-SCAN）&#34;。博士生 S.C. 在格拉茨医科大学分子医学博士培养项目框架内接受培训。作者衷心感谢 Nina Schlögl、Daniel Kummer、Gabi Wendt、Claudia Chudak、Julia Schulz 和 Johanna Schiller 提供的专业技术协助。作者感谢 Georg Peinhaupt 在图形设计方面的支持。

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<li>Picelli, S., Faridani, O. R., Bjorklund, A. K., Winberg, G., Sagasser, S., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案旨在从功能化导线（以下简称“装置”）上回收细胞，用于体外单细胞基因组分析。我们测试了三种EpCAM阳性细胞系（HT-29、LNCaP和VCaP），但原则上，该方法可适用于任何表达EpCAM的细胞系。EpCAM阳性的目标细胞可以纯细胞悬液形式（见2.1节）或混入过量背景细胞中（例如外周血，见2.2节）加入装置。后者尤其可用于在稀有细胞条件下测试分离能力，而通过所述低体积方法可精确调控附着在导线上的细胞数量（见2.3节）。由于不同细胞系之间可能存在差异，导线加样时的合适细胞密度、旋转速度以及孵育时间需通过免疫荧光显微镜评估附着细胞数量后进行经验性优化。
在单细胞水平上进行基因组下游应用时，需要进行全基因组扩增（WGA）。不同实验室所选用的WGA方法可能有所不同，原则上，本方法适用于所有能够处理通过显微操作或激光显微切割获得样本的WGA技术。在本实验方案中，我们采用基于酶切片段化DNA的WGA方法，因其性能优于基于热片段化的WGA方法7。此外，可选地，单个细胞也可用于等温WGA，以实现后续的DNA谱型分析20,21。
所述方案旨在从用于基因组单细胞分析的新一代功能化导线上回收完整细胞。第一代功能化导线同样也是目前唯一获得CE认证的 体内 目前市场上已有的富集装置已被用于计数转移性癌症患者中的循环肿瘤细胞（CTCs）。既往发表的研究及我们自身的数据表明 体内 相较于当前的金标准技术，该分离技术具有更高的灵敏度2因此，配备这一 体内 具有回收功能的分离技术，通过该设备实现，可将高CTC回收率与单细胞水平的表征相结合。
然而，该设备尚未获得用于患者的批准，因此尚无临床数据。 离体 应用（即 不建议在采样后从外周血中分离循环肿瘤细胞（CTCs），因为该技术是针对肘静脉环境条件优化的。 例如 低直径的导丝（增加循环肿瘤细胞与捕获抗体直接接触的概率）以及长滞留时间（30分钟，允许2-3升血液流经导丝）。然而，如2.2节所述，目标细胞也可从混合样本中分离。7.
该方法目前的一个局限性是在细胞从导线上脱离后，未固定细胞的回收效率较低。然而，这一问题可能通过在脱离处理前增加细胞固定步骤来改善。
总之，本方案是迈向联合使用一种 体内 用于单细胞基因表征的可回收细胞的分离技术。未来还需进一步优化细胞回收与清除效率，以推动其在患者中的应用1,2然而，个性化医疗在治疗监测和治疗决策中的应用已超越了循环肿瘤细胞（CTCs）计数的范畴。因此，该方法是实现单细胞水平CTC基因组学表征的第一步。
完整细胞的获取使得单细胞转录组分析的应用成为可能。然而，回收过程是否会影响RNA完整性仍有待评估。例如 将回收的单细胞直接进行裂解，随后进行逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）22）。如果成功，可对单个细胞进行表征（例如 循环肿瘤细胞（CTCs）的研究可延伸至转录组水平，从而实现更深入的分析。在此方面，采用Smart-seq2进行RNA测序为单细胞RNA的下游分析提供了有力工具，因为在RNA测序文库构建过程中获得的预扩增cDNA可进一步用于定量PCR检测。这将实现对单个分离细胞的靶向分析与筛选分析相结合的综合研究。22,23.
目前功能化的导线基于抗EpCAM抗体，EpCAM是一种广泛用于CTC阳性筛选的上皮标志物24。由于部分CTC可能下调上皮标志物（如细胞角蛋白或EpCAM）的表达25，增加HER2/neu等抗体可提高CTC分离的成功率。Ferreira et al. 于2016年已开发并综述了多种基于抗体的富集策略26。将多种抗体混合固定于导线表面，可能是该技术未来的改进方向，有助于分离出更多数量及更多亚型的CTC。
所有涉及导线操作的步骤均必须保持导线功能部分浸没在溶液中，以维持其功能活性。我们建议在评估过程中（显微镜观察时）将导线置于1×PBS中。 例如步骤3.1–3.3）及储存。为避免染色不当，我们建议在步骤1.2.1和1.2.2中使用 freshly prepared staining solution。染色较弱的细胞会影响导线上细胞计数，并可能导致对贴壁细胞数量的低估。
将导线插入巴斯德吸管以加载细胞悬液时（步骤2.3.4），必须避免用橡胶帽将巴斯德吸管堵住。橡胶帽用于固定导线，使功能部分位于巴斯德吸管的尖端内部。如果橡胶帽过于紧密地连接在巴斯德吸管后端，则无法加载细胞悬液。此时，应适当松动橡胶帽，使被加载细胞悬液排出的空气能够从吸管中逸出。
在步骤 3.2 和 3.3 的细胞计数过程中，弯曲金属丝对其定位至关重要。使用胶带固定金属丝时，应使非功能端位于一侧。在扫描完功能部分的整个长度后，将金属丝旋转 180°，以便扫描功能金属丝的另一半。此步骤对于初始实验评估金属丝上的细胞数量非常重要。一旦确定了特定细胞系和操作流程下的细胞数量，后续操作可重复进行而无需再次计数细胞（例如，仅检查细胞是否存在，或省略此步骤）。在步骤 4.8 减少上清液体积时，精细的移液操作至关重要，以避免细胞损失。确保移液过程平稳，避免对沉淀物造成湍流。

最近，一种名为 CellCollector DC01 的医用导丝被纳入循环肿瘤细胞（CTC）计数的方法体系，该导丝经抗 EpCAM 抗体功能化修饰，可用于从癌症患者外周血中分离 CTC1,2,3在一项正在进行的非转移性前列腺癌研究中，这种功能化导丝检测出的CTC阳性患者数量几乎是CellSearch（循环肿瘤细胞计数的金标准）的两倍，且在CTC阳性患者中检出的CTC数量也更高3由于这一令人鼓舞的表现，从功能化医用导丝上分离细胞以进行单细胞分析将具有重要意义，但目前尚无有效的酶解处理方法结合细胞解离溶液来实现这一目标。例如 胰蛋白酶消化或激光显微切割均无法回收完整的细胞（数据未显示）。
为了实现捕获细胞的脱离，新一代功能化导线配备了一种特定聚合物。该聚合物将捕获抗体与导线连接，并可被释放缓冲液处理，从而实现完整细胞的脱离（称为Device的CellCollector DC03）。这种新型功能化装置能够从掺入牛血清白蛋白（BSA）/磷酸盐缓冲液（PBS）以及外周血中的不同浓度癌细胞系细胞中分离目标细胞。
为便于在装置上进行细胞的视觉识别及回收后的观察，目标癌细胞在回收处理前需用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）和DNA染料进行标记即充电与分离）。该处理对单细胞DNA质量的影响此前已通过全基因组扩增（WGA）后的质控PCR进行评估4,5，染色体微阵列比较基因组杂交6,7&#160;和靶向测序7 与从未处理的细胞悬液中通过显微操作获得的细胞相比，无显著差异7该方法的优势在于稀有靶细胞的预富集与细胞回收相结合，可用于单细胞水平的下游分析图1）。目前获得CE认证的 体内 捕获装置通常用于循环肿瘤细胞的计数，而非单细胞分子表征2,8然而，要深入研究循环肿瘤细胞（CTCs）之间的异质性，仍需在单细胞水平上进行更为全面的分析。即 在单细胞水平上进行靶向测序。其他基于细胞的方法则依赖于通过免疫磁分离法富集 EpCAM 阳性的循环肿瘤细胞，并利用介电电泳技术对单个细胞进行操控，以用于后续的分子遗传学分析9,10循环肿瘤细胞（CTCs）的分子表征对于其在临床环境中的有效应用至关重要，同时在转移级联的基础研究中也具有同等重要性。与CTCs并行，循环肿瘤DNA（ctDNA）的重要性日益凸显，因其能够在最小技术分离步骤下实现对肿瘤负荷的DNA分析。11,12基于细胞的方法可能作为一种补充性手段，因为它能够用于RNA研究13,14 和蛋白15 表达分析，以及循环肿瘤细胞（CTC）来源的细胞培养或异种移植16,17尽管仍需克服细胞回收率低以及用于患者时的审批障碍，但捕获与释放方法在稀有靶细胞的表征研究中迈出了重要的下一步。

<table><tbody><tr><td>Gilupi 释放缓冲液</td><td>Gilupi</td><td>GIL083</td><td>用于将细胞从金属丝上分离</td></tr><tr><td>McCoy's 5A 培养基（1×），添加 L-谷氨酰胺</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>16600-082</td><td>用于HT-29细胞的培养基，根据实验所用细胞系调整培养基</td></tr><tr><td>HEPES缓冲液（1 M）</td><td>PAA</td><td>S11-001</td><td>5A 培养基补充剂</td></tr><tr><td>优级胎牛血清</td><td>聚丙烯酸</td><td>A15-151</td><td>McCoy's 5a 改良培养基添加剂</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（100倍浓缩液）</td><td>Biowest</td><td>L0018-100</td><td>McCoy's 5a 改良培养基添加剂</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（1x PBS）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Biowest</td><td>L0950-100</td><td>细胞解离液（细胞培养）</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>GFL</td><td>1003型</td><td>用于预热溶液</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td>用于细胞孵育（细胞培养）</td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>VWR</td><td>525-0403</td><td></td></tr><tr><td>滚轴混合器</td><td>Stuart Scientific</td><td>SRT6D</td><td>用于将细胞固定在金属丝上，同时防止细胞沉降</td></tr><tr><td>CellTrace CFSE 细胞增殖试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>C34554</td><td>用于标记活细胞（细胞质标记）</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>H3570</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>用于染色DNA（核酸复染）</td></tr><tr><td>离心机（配备可容纳15 mL和50 mL反应管的转子）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Heraeus Megafuge 40R</td><td>用于细胞沉淀</td></tr><tr><td>观察者 Z1（荧光/激光显微切割显微镜）</td><td>卡尔·蔡司显微成像</td><td></td><td>能够进行激光显微切割的倒置（免疫荧光）显微镜；荧光显微镜必须能够检测Hoechst 33342（DAPI滤光片）和CFSE（FITC滤光片）</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-50G</td><td>用于包被玻璃/塑料表面</td></tr><tr><td>MS1 Minishaker</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z404039</td><td>用于涡旋振荡</td></tr><tr><td>Vacutainer EDTA（或 Na-肝素）管</td><td>BD</td><td>366450（或 366480）</td><td>用作体外捕获靶细胞的反应管</td></tr><tr><td>Detektor CANCER03 DC03</td><td>Gilupi</td><td>GIL003</td><td>能够分离和释放EpCAM阳性细胞的功能化导线（也称为捕获）&amp;和释放，C&amp;amp;R)</td></tr><tr><td>注射器针头（G20）</td><td>VWR</td><td>613-0554</td><td>用于刺穿橡胶帽，以便使C的非功能部分&amp;amp;R 引领前行</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Roth</td><td>T729.1</td><td>用于细胞计数</td></tr><tr><td>巴斯德吸管 150 毫米</td><td>Volac</td><td>D810</td><td>用于将细胞低体积接种至 C&amp;和</td></tr><tr><td>润滑笔</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td>用于载玻片上以固定细胞悬液</td></tr><tr><td>无菌注射器滤器（0.2 &amp;micro;m)</td><td>康宁</td><td>431219</td><td>用于过滤新配制的Gilupi释放缓冲液</td></tr><tr><td>Delfia PlateShaker</td><td>Perkin Elmer</td><td>1296-003</td><td>用于细胞脱离过程中的振荡</td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>Eppendorf</td><td>30,125,150</td><td></td></tr><tr><td>Ampli1 WGA试剂盒</td><td>Silicon Biosystems</td><td></td><td>通过 Silicon Biosystems 进行订购</td></tr><tr><td>配备 Mikromanipulator MMJ 和 CellTram vario 的 Axiovert M200 显微镜</td><td>蔡司/艾本德</td><td></td><td>使用手动显微操作</td></tr><tr><td>微毛细管（25 &amp;micro;直径为 m，CustomTip I 型</td><td>Eppendorf</td><td>930001201</td><td>用于细胞的显微操作</td></tr><tr><td>0.2 mL PCR管</td><td>Biozym</td><td>710920</td><td></td></tr><tr><td>细胞离心机及设备</td><td>Hettich</td><td>通用型 32</td><td>使用手控细胞离心机</td></tr><tr><td>Thermo cycler</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>DNA Engine Dyad</td><td>任何带有加热盖的热循环仪均可使用</td></tr><tr><td>微型离心机</td><td>Roth</td><td>CX73.1</td><td>使用手边的台式离心机</td></tr><tr><td>MembraneSlide 1.0 PET</td><td>Zeiss</td><td>415101-4401-050</td><td>用于激光显微切割的膜包被玻片</td></tr><tr><td>UV Stratalinker 1800</td><td>Stratagene</td><td>400072</td><td>使用手持式DNA交联仪</td></tr><tr><td>标准PCR试剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6x DNA上样缓冲液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R0611</td><td>使用现有的上样缓冲液</td></tr><tr><td>DNA标准品</td><td>BioLabs</td><td>N0551G</td><td>使用手边的100 bp DNA分子量标准</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>凝胶电泳工作站</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>使用现有的电泳系统</td></tr><tr><td>Gel Red 核酸染料</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>用于琼脂糖凝胶中DNA可视化的嵌入染料</td></tr></tbody></table>

靶细胞预富集与全基因组扩增用于单细胞下游分析

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

可利用针对目标细胞表面蛋白的特异性抗体，从大量非目标细胞背景中分离出稀有目标细胞。一种新近开发的方法采用经抗上皮细胞黏附分子（EpCAM）抗体功能化的医用导丝，用于 体内 循环肿瘤细胞（CTCs）的分离1一项针对非转移性前列腺癌的患者匹配队列研究表明，该 体内 分离技术与当前循环肿瘤细胞（CTC）计数的金标准相比，能够获得更高比例的CTC阳性患者以及更高的CTC数量。由于现有医疗装置无法回收捕获的细胞，研究人员研制了一种新型功能化导丝（以下简称“装置”），可通过酶处理实现细胞的捕获及后续脱离。细胞可在该装置表面附着，经显微镜观察确认后，通过酶处理将其脱离。回收的细胞通过细胞离心法沉积于膜包被的载玻片上，并利用激光显微切割或显微操作技术进行单个细胞分离。单细胞样本随后进行单细胞全基因组扩增，以支持多种下游分析，包括筛查性及靶向性分析方法。该分离与回收流程可从单个细胞中获得高质量DNA，且不影响后续的全基因组扩增（WGA）。单个细胞扩增所得DNA可进一步用于筛查和/或靶向分析，如芯片比较基因组杂交（array-CGH）或测序。该装置允许 离体 从人工稀有细胞样本中分离（即 500个靶细胞加入至5 mL外周血中）。尽管细胞的脱落率尚可接受（50–90%），但脱落细胞在载玻片上的回收率则因所用细胞系的不同而存在较大差异（&#60;10 - &#62;50%），需要进一步关注。该设备尚未获得用于患者的批准。

经CFSE和核酸染色后的细胞可使用配备DAPI和FITC滤光片的免疫荧光显微镜进行观察。细胞核在DAPI通道中呈现明亮的复染，而细胞质则显示CFSE的均匀标记，细胞间的荧光强度存在异质性。图 2A 和 2E). 预期附着在导线上的细胞具有相似的形态和染色强度图2B 和 2F）以及从金属丝上脱离并回收到载玻片上（图2D 和 2H).
高细胞密度（例如 &gt;1 000 000 个细胞/mL）可能导致在加载细胞时细胞完全覆盖金属丝表面。然而，较低的细胞密度、孵育过程中转速的变化以及不同细胞系的使用均会影响分离效率，需分别进行测试。当按照第2.1节所述，将金属丝与5 mL浓度为100 000 个细胞/mL的HT-29细胞孵育时，每根金属丝平均捕获254 ± 103个细胞（n = 5）。在使用LNCaP细胞进行的相同实验中，每根金属丝平均捕获440 ± 319个细胞（n = 5）。
按照第2.2节方案，将500、5 000和50 000个HT-29细胞置于5 mL外周血背景中与导线接触，分别捕获到75 ± 18个细胞、25 ± 9个细胞和47 ± 57个细胞（n = 3，每组）。若按照第2.3节方案，将15 µL细胞悬液（1 000 000个细胞/mL）加样至导线，则最多可有约1 000个（HT-29）细胞黏附于导线表面。
HT-29 细胞的细胞解离效率为 81%（范围 54.9%–93.2%，n = 5），LNCaP 和 VCaP 细胞分别为 81%（范围 63.51%–92.87%，n = 6）和 91%（范围 84.7%–95.3%，n = 6）。类似地，不同细胞系解离后细胞的回收率也存在差异：通过细胞离心法回收的 HT-29 细胞平均回收率为 28%；LNCaP 细胞的回收率低于 10%，而 VCaP 细胞的平均回收率为 55%。
约75%的单细胞在进行全基因组扩增（WGA）后可产生高质量的WGA产物：表现为1）WGA产物在0.1至&gt;1 kb范围内呈弥散条带（图4，上图），以及2）在4重质量控制PCR中出现三个或四个条带（图4，下图）。WGA产物可用于：1）满足单细胞阵列比较基因组杂交（array-CGH）分析质量标准的array-CGH检测6,7，以及2）经再扩增后的靶向下一代测序（NGS）7。
<img alt="细胞培养示意图；利用微加工技术进行单细胞分离；用于下游分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：用于分离和回收目标细胞以进行单细胞分析的工作流程。 (A) 将细胞培养至90%融合度，并 (B) 收集以获得单细胞悬液。用CFSE和核酸染料染色后，(C) 将功能化导线与细胞共同孵育，孵育可在反应管中使用5 mL体积进行，也可在巴斯德吸管尖端中使用低体积进行。后者允许应用低至15 µL的细胞悬液体积。(D) 细胞需在充电后4小时内解离。因此，将导线放入装有释放缓冲液的1.5 mL反应管中。在摇床上孵育15分钟后，再离心10分钟，随后取出导线，并将细胞悬液再次离心以沉淀细胞。(E) 回收的细胞可转移至载玻片进行单细胞显微操作（上图），或通过细胞离心法沉降到覆膜载玻片上，随后进行激光显微切割（下图）。(F) 最后，通过全基因组扩增（WGA）对收获的单细胞进行扩增。WGA产物适用于后续的aCGH和靶向NGS分析。EpCAM表位：细胞表面绿色圆圈。功能化导线：装置，灰色三螺旋导线。聚合物：紫色线条。抗EpCAM抗体：橙色。释放缓冲液活性：红色箭头。用于固定细胞悬液位置的记号油脂：深蓝色椭圆。回收的细胞悬液：浅蓝色。显微操作用毛细管：黑色线条。放大图：通过显微操作收获的回收细胞，以及细胞离心后沉积在覆膜载玻片上的回收细胞（灰色实心椭圆）。放大图：正在接受激光显微切割的回收细胞（灰色圆形线：来自覆膜载玻片的膜，作为激光显微切割的支撑结构），物镜及激光束（蓝色线条从下方接近覆膜载玻片）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞捕获与释放、荧光显微镜、HT-29 和 LNCaP、微流控装置分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：标记细胞的可视化。 (A,E) 加电前的细胞：细胞用 CFSE 标记，并用 DNA 插入染料复染，显示不同强度的 CFSE（绿色）信号。(B,F) 被导线捕获的标记细胞。(C,G) 细胞脱离程序后的导线。(D,H) 从导线脱离的细胞，通过细胞离心收集到载玻片上。CFSE：FITC 通道（绿色）。DNA 染色：DAPI 通道（蓝色）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="功能化微萃取针示意图，分析化学中针头结构的特写。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：金属丝及储存腔室。 (A) 金属丝的腔室结构。(B) 功能化部分的细节。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="PCR凝胶电泳结果；DNA条带，四重质量控制，基因组扩增弥散。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图4：单个显微操作细胞获得的全基因组扩增产物的质量控制。 上图：来自单个细胞的全基因组扩增产物通常表现为大小在0.2 kb至&gt;1.0 kb之间的DNA弥散条带，峰值强度约在0.5 kb处。编号为1、7和13的样品（以星号标示）显示出次优或无DNA弥散条带。下图：若四重PCR能够扩增出四个PCR产物（分别位于100、200、300和400 bp）中的三个或四个，则表明全基因组扩增产物质量足够。样品1、7、10和13显示的条带少于三条，应排除在后续分析之外。M泳道为100 bp DNA标记物，星号标示全基因组扩增产物质量不足的样品。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>引物序列</td>
			<td>注意</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5′-gtt cca ata tga ttc cac cc-3′</td>
			<td>100 bp 正向引物</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5′-ctc ctg gaa gat ggt gat gg-3′</td>
			<td>100 bp 反向引物</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5′-agg tgg agc gag gct agc-3′</td>
			<td>200 bp 正向引物</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5′-ttt tgc ggt gga aat gtc ct-3′</td>
			<td>200 bp 反向引物</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5′-agg tga gac att ctt gct gg-3′</td>
			<td>300 bp 正向引物</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5′-tcc act aac cag tca gcg tc-3′</td>
			<td>300 bp 反向引物</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5′-aca gtc cat gcc atc act gc-3′</td>
			<td>400 bp 正向引物</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5′-gct tga caa agt ggt cgt tg-3′</td>
			<td>400 bp 反向引物</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：四重质量控制PCR的引物序列

本方案旨在从含有非靶标背景细胞的混合物中分离并制备稀有靶细胞，用于单细胞水平的分子遗传学表征。所获得的DNA质量与未经处理的单细胞相当，适用于单细胞分析（包括基于筛查和靶向分析的应用）。

稀有靶细胞可通过特异性识别靶细胞表面蛋白的抗体，从大量非靶细胞背景中分离出来。近年来……

本实验的总体目标是从细胞悬液中分离细胞，以便进行单细胞水平的后续分析。该方法有助于解答液体活检和细胞异质性研究中的关键问题。该技术的主要优势在于，能够基于抗体实现单个细胞的分离，并可回收这些细胞用于后续的单细胞分子遗传学分析。一旦获得在患者中使用的许可，该技术将能够对癌症患者的循环肿瘤细胞进行表征。由于该方法可揭示单个细胞间的异质性，因此可应用于含有亚群的各种细胞悬液，例如血液样本、细胞培养物样本或解离的组织与器官样本。我们最初产生该方法的构想，是在使用一种体内富集装置时，该装置无法释放细胞以用于后续分析。该方法的可视化演示至关重要，因为使用激光显微切割或显微操作技术获取单个细胞的步骤较难成功，该过程容易造成细胞丢失，且需要较高的操作技巧。在1 mL预热的细胞培养基中重悬HT-29 CFSE标记的细胞，并于37摄氏度孵育30分钟使其恢复。收集细胞时，以300 ×g离心3分钟。然后，在37摄氏度下，将细胞沉淀重悬于1毫升即用型Hoechst 33342 DNA染色溶液中，孵育10分钟。接着，将细胞悬液在300 ×g离心3分钟。随后，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于4毫升1×磷酸盐缓冲液中。然后，使用血细胞计数板对细胞进行计数，并用荧光显微镜检测荧光标记情况。接着，以 300 ×g 离心 3 分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于约每毫升 500,000 个细胞的溶液中，并将细胞置于冰上。在 5 毫升外周血中加入约 500 至 500,000 个细胞，然后通过轻轻颠倒试管进行混匀。从储存室中取出导线后，移除固定导线的橡胶帽，用1×磷酸盐缓冲液清洗导线，并将其安装在管盖中。然后，在室温下以每分钟5转的速度将试管置于倾斜的滚轴混合器上孵育30分钟。孵育结束后，用1×磷酸盐缓冲液将导线冲洗三次。然后，将导线置于含有1×磷酸盐缓冲液的15毫升离心管中，避光保存。使用记号笔在载玻片上画出矩形区域，随后向该区域加入500微升1×磷酸盐缓冲液。为使导线的功能部分完全浸入1×磷酸盐缓冲液中，需将导线的非功能部分弯曲，并将其放置在载玻片上。为了计数捕获的细胞数量，需目视检查导线的两侧。检查后，将导线重新放回含有1×磷酸盐缓冲液的15毫升离心管中，并置于避光处保存。在1毫升1×磷酸盐缓冲液中溶解4毫克释放缓冲液组分，然后通过0.2微米无菌滤器过滤溶液，得到可直接使用的缓冲液。接下来，将释放缓冲液在 37 摄氏度下预热 5 分钟。预热后，转移 1.6 毫升释放缓冲液，完全填充一个 1.5 毫升的反应管。随后，将导线的功能部分放入释放缓冲液中，在 37 摄氏度水浴中孵育 20 分钟。孵育结束后，将金属丝置于摇床中，以每分钟500转的速度振荡15分钟。然后在300 ×g下离心10分钟。离心结束后，将金属丝从离心管中移出，盖紧管盖，再以300 ×g离心10分钟。为减少细胞悬液的体积，进行显微操作时保留100微升上清液，其余弃去；若后续进行细胞离心和激光显微切割，则保留300微升上清液，其余弃去。随后立即进行单细胞取样。对于显微操作，将全部100微升细胞悬液转移至玻片上。然后，将玻璃载玻片置于配备有显微操作仪的显微镜上，静置细胞5分钟使其沉降。接着，在0.2毫升的PCR管中，用移液器加入2微升细胞裂解主混合液，并立即置于冰上。使用显微操作仪在1X磷酸盐缓冲液（PBS）1微升中捕获单个细胞。然后，将细胞直接转移至2 µL细胞裂解主混合液中。使用台式微量离心机在2,000 ×g条件下短暂离心3秒，使液体沉降至管底。随后将样品置于冰上，立即进行基于接头-连接子的全基因组扩增。每次最多使用一微升缓冲液吸取一个细胞。将细胞转移至裂解液时，应观察到溶液中产生气泡，以确认已完全转移所吸取的全部体积。对于激光显微切割，需将全部300微升细胞悬液在300 ×g 条件下离心5分钟，使细胞沉降到膜包被的载玻片上。然后，将带有膜的载玻片置于具备激光显微切割功能的显微镜上。接着，用移液器将4.5 µL细胞裂解主混合液加入0.2 mL PCR管的管盖中。将管盖置于样品上方，通过激光显微切割捕获单个细胞。紧接着，检查PCR管盖内是否有分离的细胞，将PCR管从激光显微切割显微镜上取下并盖紧管盖。通过短暂离心将管底所有液体收集至管底。将样本置于冰上，立即进行基于接头-连接子的全基因组扩增。确保回收激光显微切割的细胞。因此，用裂解液完全覆盖整个管盖非常重要。显微切割后，检查管盖上是否存在细胞。为了显示用CFSE和Hoechst 33342染色的细胞，分别在对导线充电前、细胞附着于导线时、从导线脱离后以及最终在载玻片上时进行了免疫荧光成像。充电前细胞的免疫荧光图像显示细胞核呈明亮的蓝色荧光，而细胞质则呈现绿色CFSE荧光，且细胞间的荧光强度存在异质性。附着于导线并随后从导线脱离的细胞也表现出类似的染色模式。为了检测全基因组扩增产物的质量，进行了1%琼脂糖凝胶电泳。琼脂糖凝胶显示，全基因组扩增的PCR产物呈现出大小范围从0.2至大于1千碱基的DNA弥散条带。从单细胞获得的4重质量控制PCR产物分别为100、200、300和400个碱基对。少于三条带的产品将被排除在进一步分析之外。一旦掌握该技术，若操作得当，可在四小时内从细胞悬液中分离出单个细胞。在进行此操作时，重要的是要始终将细胞浸没在缓冲液中，尤其是在细胞附着于金属丝期间，以避免对细胞造成损伤。通过该实验流程，可进一步采用区域比较基因组杂交、下一代测序以及靶向特异性PCR等分析方法，基于拷贝数变异和突变对单个细胞进行表征。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用功能化金属丝从细胞悬液中分离并回收细胞，以及如何对单个细胞进行取样，以用于多种下游分子遗传学分析。请注意，操作人源血液存在感染风险，因此在进行本实验时必须佩戴手套并穿着实验服。

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