单细胞下游特征的靶细胞预富集与全基因组扩增

该协议是从非目标背景细胞的混合物中恢复和制备稀有靶细胞, 用于单细胞水平的分子遗传表征。DNA 质量等于未处理的单个细胞, 并允许单细胞应用 (筛查和靶向分析)。

该程序的总体目标是从细胞悬液中分离细胞，以使其可用于单细胞下游分析。这种方法可以帮助回答液体活检和细胞异质性背景下的关键问题。该技术的主要优点是它允许基于抗体的单细胞分离及其回收，以便随后在单细胞水平进行分子遗传学分析。

一旦获准用于患者，该技术将能够表征癌症患者的循环肿瘤细胞。由于这种方法可以深入了解单细胞之间的异质性，因此它可以应用于包含亚群的各种细胞悬液，例如血液样本、细胞培养物样本或解离的组织和器官。当我们使用体内富集装置时，我们第一次有了这种方法的想法，该装置不能释放细胞以进行下游分析。

这种方法的视觉演示至关重要，因为使用激光显微切割或显微作收获单细胞的步骤很难成功执行，因为收获单细胞的过程容易发生细胞损失并且需要高水平的专业知识。在 1 毫升预热的细胞培养基中，重悬 HT-29 CFSE 标记的细胞，让它们在 37 摄氏度下再生 30 分钟。要收获细胞，请以 300 g 离心 3 分钟。

然后，将细胞沉淀重悬于一毫升即用型 Hoechst 33342 DNA 染色溶液中，在 37 摄氏度下重悬 10 分钟。接下来，将细胞悬液以 300 g 离心 3 分钟。然后，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 4 mL 1X 磷酸盐缓冲盐水中。

然后，使用血细胞计数器计数细胞数，并用荧光显微镜检查荧光标记。接下来，将细胞以 300 g 离心 3 分钟，弃去上清液，以每毫升约 500， 000 个细胞的速度重悬沉淀，并将细胞置于冰上。在 5 毫升外周血中，加入约 500 至 500， 000 个细胞，然后倒置试管混合。

从储藏室中取出电线后，取下固定电线的橡胶帽，用 1X 磷酸盐缓冲盐水清洗电线，然后将其安装在管盖中。然后，在倾斜的滚轮混合器上以每分钟旋转 5 次的速度在室温下孵育试管 30 分钟。孵育后，用 1X 磷酸盐缓冲盐水冲洗金属丝 3 次。

然后，将导线储存在含有 1X 磷酸盐缓冲盐水的 15 毫升试管中，避光保存。使用油笔在载玻片上画一个矩形区域，然后加入 500 微升 1X 磷酸盐缓冲盐水。要将导线的功能部分浸入 1X 磷酸盐缓冲盐水中，请弯曲导线的非功能部分并将其放在载玻片上。

要计算捕获的细胞数量，请目视检查导线的两侧。检查后，将金属丝移回装有 1X 磷酸盐缓冲盐水的 15 毫升试管中，并避光保存。在 1 mL 1X 磷酸盐缓冲盐水中，溶解 4 mg 释放缓冲液组分，然后通过 0.2 μm 无菌过滤器过滤溶液，以获得即用型缓冲液。

接下来，将释放缓冲液在 37 摄氏度下加热 5 分钟。加热后，转移 1.6 mL 释放缓冲液以完全填充 1.5 mL 反应管。接下来，将金属丝的功能部分在 37 摄氏度的释放缓冲液中在水浴中孵育 20 分钟。

孵育后，将金属丝以每分钟 500 转的速度放在摇床上 15 分钟。然后，将线材以 300 g 离心 10 分钟。离心结束后，从试管中取出导线，盖上盖子，然后再次以 300 g 离心试管 10 分钟。

为了减少细胞悬液的体积，丢弃除 100 μL 上清液外的所有上清液用于显微作，或 300 μL 用于随后的细胞离心和激光显微切割。然后，快速进行单细胞采样。对于显微作，将整个 100 微升细胞悬液转移到载玻片上。

然后，将载玻片放在配备显微作器的显微镜上，让细胞静置 5 分钟。然后，在 0.2 mL PCR 管中，吸取 2 μL 细胞裂解预混液并在冰上转移。使用显微作器收集 1 微升 1X 磷酸盐缓冲盐水中的单个细胞。

然后，将细胞直接转移到 2 μL 细胞裂解预混液中。使用台式微量离心机将样品以 2， 000 g 的速度快速离心 3 秒钟，以收集试管底部的液体。然后，将样品转移到冰上并继续进行基于接头接头的全基因组扩增。

最多使用 1 μL 缓冲液仅吸出一个细胞。将细胞转移到裂解液中时，请确保看到溶液中产生气泡，这表明所有吸出的体积都已转移。对于激光显微切割，将整个 300 μL 细胞悬液以 300 g 的体积离心到膜包被的玻片上，离心 5 分钟。

然后，将膜涂层的载玻片放在能够进行激光显微切割的显微镜上。接下来，将 4.5 μL 细胞裂解预混液移液到 0.2 mLPCR 管的盖子中。将盖子放在样品上方，并通过激光显微切割收获单个细胞。

此后，立即检查 PCR 帽中是否有分离的细胞，从激光显微解剖显微镜中取出 PCR 管并关闭管。通过短时间旋转收集管底的所有液体。将样品转移到冰上，然后进行基于接头接头的全基因组扩增。

确保恢复激光显微解剖细胞。因此，用裂解液覆盖整个管帽非常重要。显微解剖后，检查管帽是否有细胞。

为了显示用 CFSE 和 Hoechst 33342 染色的细胞，在给导线充电之前、细胞连接到导线期间、然后从导线上分离，最后在载玻片上进行免疫荧光成像。充电前细胞的免疫荧光图像显示蓝色明亮的核酸染色，而细胞的细胞质显示具有异质细胞间强度的绿色 CFSE 染色。对于附着并随后从金属丝上分离的细胞，也观察到类似的染色模式。

为了检查全基因组扩增产物的质量，运行 1% 琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶显示全基因组扩增的 PCR 产物的 DNA 弥散条带范围为 0.2 至 1 kb 以上。从单细胞获得的 4plex 质控 PCR 产物可产生 100、200、300 和 400 个碱基对的产物。

显示少于 3 个波段的商品将被排除在进一步分析之外。一旦掌握，如果作得当，该技术可以在 4 小时内从细胞悬液中分离出单细胞。在尝试此过程时，重要的是要记住将细胞浸没在缓冲液中，尤其是在细胞连接到导线上以避免伤害细胞期间。

按照此程序，可以执行区域比较基因组杂交、下一代测序和靶标特异性 PCR 等分析方法，以便根据拷贝数变化和突变表征单细胞。观看本视频后，您应该对如何使用功能化线从细胞悬液中分离和回收细胞以及如何对单个细胞进行采样以进行多个下游分子遗传学分析有了很好的了解。不要忘记，与人体血液打交道可能会造成感染，因此在执行此程序时必须戴手套和穿实验服。