使用恒化器进行微生物适应性实验室进化的操作步骤

本实验的总体目标是在实验室条件下使微生物发生进化。该方法有助于回答微生物学领域的关键问题，例如肾上腺功能关系、应激反应、代谢工程，以及当然的进化过程。该技术的主要优势是在特定的实验室条件下持续筛选出最适应环境的后代。

按照文本方案中的描述，首先准备实验设备以及初始培养基、应激培养基和高应激培养基。挑取单个菌落或野生型大肠杆菌（E.coli），接种至含有4毫升初始培养基的15毫升试管中。将试管置于摇床培养箱中，在37摄氏度、220转/分钟的条件下培养12小时。

将恒化器瓶置于37摄氏度条件下孵育，同时提供通气和搅拌，持续六小时。孵育结束后，无菌操作将泵的硅胶管末端连接至恒化器瓶。再无菌转移一毫升预培养液至恒化器瓶中。

启动出液泵，收集处于指数生长期的菌液。检测出液管路中菌液在600纳米处的光密度值，然后启动进液泵。

每24小时从出口管路检测一次培养物在600纳米处的光密度。在恒化器运行96小时（即9.6个完全换液周期）后，将储液瓶更换为最高浓度的高应激培养基。当您将储液瓶更换为更高应激的培养基时，细胞可能会受到应激冲击。

如果细胞密度过低，暂停输入高应激培养基一段时间，以恢复细胞密度。如果光密度低于0.2，则停止进样泵六小时。重新启动进样泵，并确认光密度恢复至0.2以上。

逐步更换至含有更高胁迫剂浓度的储液器，逐渐增加胁迫剂浓度。每当适应培养物达到一个胁迫适应里程碑时，取样并保存以用于后续基因组分析。样品保存时，将0.5毫升培养样品与0.5毫升灭菌的80%甘油溶液混合，并于-80摄氏度保存。

制备含有与培养基中相同胁迫剂及相同浓度的1.6%琼脂平板培养基。取0.1毫升来自恒化器的流出培养物，涂布于平板上，并在37摄氏度下培养16小时。培养结束后，用无菌牙签挑取平板上的单菌落，接种至含有与恒化器中相同胁迫剂及相同培养基浓度的15毫升试管中。

孵育六小时。取一毫升培养液转移至含有50毫升培养基的250毫升锥形瓶中。每小时收集0.5毫升培养液，测定600纳米处的光密度。

在施加胁迫条件下，比较适应菌株与野生型菌株的生长速率。野生型大肠杆菌菌株在高琥珀酸胁迫条件下进化了270天，相当于经历了近930代。每当增加更高的琥珀酸胁迫时，生物量浓度会立即下降，随后恢复。

图中所示为耐受高琥珀酸胁迫的突变株在恒化器中的示意图。在胁迫条件下，大多数野生型细胞被洗脱，而突变株生长更旺盛。最终，突变后代的种群数量增加。

第二和第三种突变被持续筛选并最终在恒化器中占据主导地位。该图显示，在高琥珀酸盐胁迫条件下，适应后的菌株能够立即生长，而野生型菌株则不能。类似策略可应用于利用恒化器并结合不同胁迫因子的实验室适应性进化研究。

观看本视频后，您应能充分理解如何在特定条件下培养并进化微生物。掌握该技术后，整个实验过程可在数月内完成。在操作过程中，需注意避免因一次性施加过多压力而导致恒化器中的细胞被洗脱，并应每天定时检测光密度。

在此操作步骤之后，可进行基因组分析和转录组分析等方法，以回答其他问题，例如哪些突变有助于耐受胁迫的进化？