程序的微生物实验室自适应演化的恒化
September 20th, 2016
在这里，我们提出了一个协议，以获得使用恒化培养条件下微生物实验室适应性进化。此外，演进的株的基因组分析进行了讨论。
该程序的总体目标是使微生物能够在实验室条件下进化。这种方法可以帮助回答微生物学领域的关键问题，例如肾上腺功能关系、应激反应、代谢工程，当然还有进化。该技术的主要优点是在特定的实验室条件下连续选择最受青睐的后代。
从准备设备开始此过程，以及初始培养基、应力培养基和高应力培养基，如文本方案中所述。将单个菌落或野生型大肠杆菌接种在含有 4 mL 初始培养基的 15 mL 试管中。将试管在摇动培养箱中以 37 摄氏度和 220 rpm 的速度孵育 12 小时。
将提供通气和搅拌的化学恒温器罐在 37 摄氏度下孵育 6 小时。孵育后，在无菌条件下将硅胶管的末端从泵连接到化学恒温器罐。在无菌条件下将 1 毫升预培养物转移到化学恒温器罐中。
启动出口泵并收集指数期的培养物。检查来自出口管的 600 纳米培养物的光密度。然后，启动入口泵。
每 24 小时检查一次距离出口管 600 纳米处培养物的光密度。在作化学止温器 96 小时（即 9.6 次完全周转）后，将储液槽更换为最低浓度的高应力介质。当您将储液槽更换为更高应力的培养基时，细胞可能会受到电击。
如果细胞密度过低，请停止补料较高应激培养基一段时间以恢复细胞密度。如果光密度低于 0.2，则停止进料口泵 6 小时。重新启动入口泵并检查光密度是否超过 0.2。
通过逐渐更改为包含较高压力源浓度的储层来逐渐增加应力源的浓度。每当适应培养物达到应激源适应里程碑时，采集其样本并储存以供进一步基因组分析。对于样品储存，将 0.5 mL 培养样品与 0.5 mL无菌 80% 甘油溶液混合，并在 80 摄氏度下储存。
制备 1.6%ager 平板培养基，其中含有与培养基中浓度相同的压力源。从化学恒温器中接种 0.1 毫升出口培养物，并在 37 摄氏度下孵育 16 小时。孵育后，使用无菌牙签从平板上挑选单个菌落，并将它们接种在 15 毫升试管中，该试管含有与趋化器中相同的应激源和相同的培养基浓度。
孵育 6 小时。将 1 毫升培养液转移到含有 50 毫升培养基的 250 毫升锥形瓶中。每小时收获 0.5 毫升培养液，并测量 600 纳米的光密度。
将适应菌株的生长速率与给定压力源的野生型菌株的生长速率进行比较。野生型大肠杆菌菌株在高琥珀酸胁迫条件下进化了 270 天，相当于近 930 代。每当添加较高的琥珀酸胁迫时，生物量浓度立即降低，然后恢复。
此处显示的是具有耐受高琥珀酸应激的突变体的化学恒温器的示意图。大多数野生型细胞在应激条件下被洗掉，突变体生长得更多。最终，突变后代的种群数量增加。
第二个和第三个突变被连续选择并最终主导化疗恒温器。该图表明，适应菌株在高琥珀酸胁迫条件下无延迟生长，而野生型菌株则没有。类似的策略可以应用于使用具有各种压力源的化学恒温器的适应性实验室进化。
看完这个视频后，你应该对如何在特定条件下获取和进化微生物有很好的了解。一旦掌握，这项技术可以在几个月内完成。在尝试此程序时，重要的是要记住不要通过一次增加过多的压力来洗掉止化器细胞，并记住每天检查光密度。
遵循此程序，可以执行基因组分析和转录组分析等方法，以回答其他问题，例如什么突变有助于耐压进化？
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概述
本文介绍了一种使用化学恒态培养法进行微生物适应性实验室进化的协议。它讨论了进化菌株的基因组分析及其在微生物学中的意义。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 实验室进化
- 基因组分析
背景
- 适应性实验室进化使微生物能够在受控条件下进化。
- 这种方法可以提供关于应激反应和代谢工程的洞见。
- 对后代的持续选择增强了对进化过程的研究。
- 初始培养基的准备对成功实施至关重要。
研究目的
- 使微生物能够在实验室环境中进化。
- 调查应激反应与进化适应之间的关系。
- 促进代谢工程研究。
使用的方法
- 初始、应激和高应激培养基的准备。
- 用初始培养基在试管中接种大肠杆菌。
- 在指定条件下在振荡培养箱中孵育。
- 持续监测微生物进化。
主要结果
- 在受控条件下微生物成功进化。
- 关于应激反应机制的见解。
- 在代谢工程中的潜在应用。
- 基因组分析揭示了进化菌株的适应性。
结论
- 该协议能够有效地进行微生物的实验室进化。
- 研究结果有助于理解微生物的适应性。
- 这种方法可以应用于微生物学中的各种研究问题。
常见问题
Executive Industry Relevance
Adaptive laboratory evolution using chemostat culture enables continuous selection of microbial strains under controlled stress conditions, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. This approach generates diverse populations through high cell division rates, improving predictive confidence for strain engineering and pathway optimization. The method facilitates translational continuity by linking laboratory evolution to genomic and transcriptomic analysis for identifying adaptive mutations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through stressor-induced evolution and pathway clarification.
- Operational Value: Supports biological de-risking by identifying dominant adaptive strains under selective pressure.
- Predictive Value: Generates diverse mutant populations for functional target validation and lead identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with stabilized stress-tolerant phenotypes for downstream screening.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through continuous culture and defined stressor gradients.
- Scalability: Enables platform reuse across multiple stressors and microbial hosts for screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects evolved strain phenotypes to genomic changes, supporting translational biomarker alignment.
- Operational Value: Provides evolutionary continuity from discovery through preclinical validation via traceable adaptation milestones.
- Risk Mitigation: Informs risk-adjusted advancement decisions by linking stress tolerance to specific mutations.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to lead identification and preclinical validation, supported by continuous selection and genomic analysis outputs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through controlled stressor exposure and mutant enrichment.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible cultures with quantitative optical density monitoring for strain comparison.
- Analytics: Enables comparative genomic and transcriptome analysis to identify mutations contributing to stress tolerance.
- Translational Research: Connects laboratory evolution to preclinical continuity through documented adaptation milestones and cryopreserved samples.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evolving microorganisms under varying stressors across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in strain engineering by revealing mechanisms of stress adaptation.
- Operational Value: Reduces labor intensity post-setup through automated continuous culture and defined sampling intervals.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking evolutionary outcomes to genomic drivers of fitness.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of strains based on validated adaptive mutations and growth performance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiology, chemostat operation, and aseptic technique.
- Depends on instrumentation for precise pump control, aeration, agitation, and optical density monitoring.
- Necessitates cross-team standardization for media preparation, stressor gradients, and sampling protocols.
- Involves adaptation considerations when transferring evolved strains to shake-flask or plate-based validation assays.
- Includes practical limitations such as cell washout risk under excessive stress and the need for daily optical density checks to maintain culture stability.
