Name: 生命极端的适应:极端微生物 Sulfolobus acidocaldarius 的实验进化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 了解嗜热古菌Sulfolobus acidocaldarius的实验进化方法，使用高通量恒温混匀仪进行温度适应研究。该协议实现了精确的环境控制，为实时研究微生物进化动态提供了高效节能的绿色研究途径。

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作者感谢弗莱堡大学的 SV Albers 教授、布鲁塞尔自由大学的 Eveline Peeters 教授以及布鲁塞尔自由大学的 Rani Baes 博士提供的建议和帮助 S.&#160;acidocaldarius DSM639 菌株。本工作由英国皇家学会研究资助（授予 DRG：RGS\R1\231308）和英国研究与创新署-自然环境研究委员会（UKRI-NERC）资助。 &#34;探索前沿&#34; 研究资助（授予 DRG 和 CGK：NE/X012662/1）以及科威特大学博士奖学金（授予 ZA）。

Experimental Evolution Protocol for Thermophile Adaptation Using Low-Cost Thermomixers

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作者声明不存在任何利益冲突。

本研究建立了一种适用于嗜热微生物的实验进化方案，此处针对嗜酸热古菌S. acidocaldarius进行了优化，但也可根据需要调整用于其他需高温生长的微生物。该方案基于最初为中温细菌设计的技术，但经过专门改进，以克服高温好氧培养过程中存在的技术难题2,4,5,24。该方法的建立将有助于探索在极端温度条件下发生的、此前尚未被表征的进化动态，这类条件可能类似于生命进化最早阶段所存在的环境1。
为了从进化实验中获得可靠的结果，必须遵守该实验方案中的若干关键要点。首先是确保各进化谱系之间的独立性，这可通过在实验开始前划线分离至单菌落来实现。这是必要的，以确保在不同谱系中发现的相同突变具有独立的起源。相反，如果使用大量液体培养物分装来启动各个谱系，则可能将共同的遗传变异分配到每个群体中。第二个关键因素是控制污染，可通过设置不含培养物的阴性对照并监测其是否出现生长来实现。与中温微生物实验不同，嗜极微生物的进化实验不太可能受到外部来源的污染，但仍可能发生谱系之间的交叉污染。维持通气与蒸发之间的平衡是另一个重要考虑因素。S.acidocaldarius 是一种专性需氧菌，其生长依赖氧气10,23。手动刺穿聚丙烯微量离心管并用透气膜密封21,25，是实现在不过度蒸发的同时维持通气的关键。这种改进的效果很可能归因于密封管内环境的均一性得以保持（数据未显示）。
根据进化实验所使用的特定环境条件，该方法的两个方面可能需要进行调整或故障排除：稀释倍数和传代间隔时间。在本方法中，每次传代均进行1:100稀释，平均需要 log2(100) = 6.64 次倍增才能恢复到相同的种群规模。这在适应潜力（Wahl 和 Gerrish26 计算了最优稀释倍数）与实验可操作性之间提供了良好平衡。理论上，较大的稀释倍数可使每天发生的世代数更多，因为需要更多的倍增次数才能恢复到相同的种群密度（例如，1:1000 稀释平均需要 log2(1000) = 9.97 次倍增）。然而，如果实际达到的倍增次数少于传代间隔所要求的次数，则种群将逐渐因稀释而被洗脱，除非出现可缩短倍增时间的有益突变。对于每48小时传代一次的情况，要求倍增时间必须小于8小时，这与之前报道的 S. acidocaldarius 在75 °C下异养生长的估计倍增时间（4–6小时）相符23,27。然而，在恒定65 °C和温度下降处理组中，OD600nm 随时间逐渐降低的现象表明，48小时可能不足以完成所需的倍增次数，延长传代周期将更为有利。
与传统的摇床培养箱相比，使用热混仪进行实验进化研究具有若干重要优势，尤其是在研究对温度的适应性时。热混仪是一种比摇床培养箱更具成本效益的替代方案，且占用空间更小。这些特点使得能够高效地并行评估多种温度处理条件。热混仪的能耗也低于摇床培养箱，因此在孵育管数较少的情况下（例如少于100个），使用热混仪有望降低实验对环境的影响。这种能耗差异在与嗜热微生物相关的温度条件下尤为显著，但也适用于一系列较为温和的温度范围（图6），这意味着热混仪也可被用于减少中温微生物实验进化研究的环境影响。综上所述，这些特性表明，在实验进化研究中使用热混仪有望提升该研究方法的可及性，特别是在资源有限的环境中，例如发展中国家的实验室以及中小学教育机构。
尽管该方法为嗜热菌的实验进化提供了可行路径，但与中温菌的实验进化相比仍存在一些局限性。首先，使用热混匀仪建立的独立重复谱系数量，远少于广泛用于中温菌的高通量微孔板方法4。目前，由于高温条件下的蒸发问题，微孔板在达到指数生长期所需的时间范围内尚无法使用。其次，由于市面上尚无可在高温（&#62;45 °C）下运行的基于微孔板的分光光度计，导致关键生长曲线参数（如生长速率、倍增时间及滞后期）的估算变得困难。根据本文所述方法，目前对生长曲线的表征仍需依赖劳动密集型的破坏性取样，因而限制了通量。最后，针对嗜热菌适应菌株竞争适合度的高通量评估技术尚未充分发展。特别是，若能开发出可用于区分不同菌株的耐热荧光蛋白，将有望实现基于流式细胞术的高通量适合度检测28,29；近年来已出现具有不同光谱特性的耐热荧光蛋白，提示这一方向具有潜在的发展前景30,31,32。提高通量是嗜热菌实验进化技术进一步发展的必然方向，这将有助于更全面地描述进化过程。

地球上的早期生命可能起源于极端环境，例如热液喷口，这类环境具有极高的温度和酸性特征1。微生物至今仍栖息于各种极端环境中，包括温泉和火山硫磺喷气孔。阐明在这些极端条件下发生的进化动态，有助于揭示使生物得以在其中生存的特化生理过程。这可能带来广泛的影响，从深化我们对生物多样性起源的理解，到推动具有生物技术应用价值的耐高温酶的开发。
尽管微生物在极端环境中的进化动态研究具有重要意义，但目前对此的理解仍然有限。相比之下，通过应用一种称为实验进化的技术，人们已在中温环境进化方面积累了大量知识。实验进化包括在实验室条件下观察进化变化2,3,4,5，通常涉及对环境的明确定义性改变（例如温度、盐度、引入毒素或竞争生物）7,8,9。当与全基因组测序相结合时，实验进化使我们能够检验进化过程中的关键方面，包括平行性、可重复性以及适应的基因组基础。然而迄今为止，绝大多数实验进化研究均以中温微生物（包括细菌、真菌和病毒2,3,4,5）为对象，而古菌则在很大程度上被排除在外。建立适用于嗜热微生物的实验进化方法，将有助于我们更深入地理解其进化机制，并推动对进化过程更全面的认识。这一进展可能产生广泛的影响，从揭示地球嗜热生命的起源，到涉及高温生物工艺中使用的“极端酶”（extremozymes）的生物技术应用10，以及天体生物学研究11。
古菌Sulfolobus acidocaldarius是开发嗜热微生物实验进化技术的理想模式生物。S. acidocaldarius为好氧生长，最适生长温度为75 °C（生长范围为55 °C至85 °C），且适应高酸性环境（pH 2–3）4,6,12,13,14。值得注意的是，尽管其生长条件极端，S. acidocaldarius的种群密度和突变率仍与中温微生物相当7,15,16,17,18。此外，该菌具有相对较小且注释完善的基因组（菌株DSM639：2.2 Mb，GC含量36.7%，共2,347个基因）12；S. acidocaldarius还具备强大的基因组编辑工具，可通过靶向基因敲除直接评估进化过程19。一个典型的例子是已有多种遗传修饰的S. acidocaldarius菌株可供使用，例如尿嘧啶营养缺陷型菌株MW00119和SK-120，这些菌株可作为可筛选的遗传标记。
对嗜热微生物（如S. acidocaldarius）进行实验进化研究存在显著挑战。此类研究需要在高温下长时间孵育，这会导致液体和固体培养技术均出现明显的蒸发问题。长时间在高温下运行还会损坏常用于液体培养基中实验进化的传统摇床培养箱。若需探索多种温度条件，则必须投入大量资金来购置和维护多台培养箱。此外，高能耗也带来了严重的环境和经济负担。
本研究介绍了一种用于解决嗜热微生物（如S. acidocaldarius）实验进化过程中所遇挑战的方法。该方法在Baes等人开发的用于研究热激反应的技术基础上进一步优化14,21，采用台式恒温混匀仪实现稳定且可靠的高温培养。其可扩展性支持同时评估多种温度处理条件，显著降低了额外培养设备的采购成本。该方法提高了实验效率，有助于对影响嗜热微生物进化动态的因素进行稳健的统计分析和深入研究22。此外，与传统培养箱相比，该方法大幅降低了初期资金投入和能源消耗，提供了一种更具可持续性和环境友好的替代方案。
我们的方法为在极端温度环境中实验性地研究进化动力学奠定了基础，这类环境可能在地球生命早期多样化阶段发挥了关键作用。嗜热生物具有独特的特性，但其极端的生长条件和特殊需求常常限制了它们作为模式系统的可及性。克服这些障碍不仅拓展了研究进化动力学的科研机会，也增强了嗜热生物作为科学研究中模式系统的广泛应用价值。

<table><tbody><tr><td>0.22 &amp;mu;m 注射器驱动膜过滤器</td><td>StarLab</td><td>E4780-1226</td><td>用于过滤不能高压灭菌的培养基组分。</td></tr><tr><td>1 &amp;mu;L 接种环</td><td>Greiner</td><td>731161、731165 或 731101</td><td>用于接种培养物。也可使用其他类型的接种环。</td></tr><tr><td>1000 &amp;mu;L 移液器吸头</td><td>StarLab</td><td>S1111-6811</td><td>也可使用其他移液器吸头。</td></tr><tr><td>2 mL 微量离心管</td><td>StarLab</td><td>S1620-2700</td><td>用于在恒温混匀仪中培养 &lt;em&gt;S. acidocaldarius&lt;/em&gt;。</td></tr><tr><td>200 &amp;mu;L 移液器吸头</td><td>StarLab</td><td>S1111-0816</td><td>也可使用其他移液器吸头。</td></tr><tr><td>50 mL 带锥形底的聚苯乙烯管</td><td>Corning</td><td>430828 或 430829</td><td>可使用其他类型的管。请在 75 &amp;deg;C 下检测其性能。带插塞盖的管可能无法提供足够的通气；使用前请先测试。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>50 mL 注射器</td><td>BD plastipak</td><td>300865</td><td>用于配合注射器驱动过滤器使用。</td></tr><tr><td>96 孔微孔板（未处理，平底）</td><td>Nunc</td><td>260860</td><td>用于在分光光度计中测定 600 nm 处的光密度（OD）。</td></tr><tr><td>可调间距多通道移液器</td><td>Pipet-Lite</td><td>LA8-300XLS</td><td>可选，但在微量离心管与 96 孔板之间转移液体时可节省时间。</td></tr><tr><td>硫酸铵 ((NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Millipore</td><td>168355</td><td>用于配制 Brock 储液 I。</td></tr><tr><td>高压灭菌器</td><td>Priorclave</td><td>B60-SMART 或 SV100-BASE</td><td>也可使用其他类型的高压灭菌器。</td></tr><tr><td>Breathe-EASY 气体可渗透密封膜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z763624-100EA</td><td>裁剪至合适尺寸后用于穿孔的微量离心管。若使用其他气体可渗透膜，需确保其在 75 &amp;deg;C 下性能良好</td></tr><tr><td>二水氯化钙 (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td>用于配制 Brock 储液 I。</td></tr><tr><td>CELLSTAR 六孔板（悬浮/未处理）</td><td>Greiner</td><td>M9062</td><td>其他厂家的六孔板也可能适用。需检测其在高温下的性能。</td></tr><tr><td>七水硫酸钴(II) (CoSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Supelco</td><td>1025560100</td><td>用于配制微量元素储备液。</td></tr><tr><td>二水氯化铜(II) (CuCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>307483</td><td>用于配制微量元素储备液。</td></tr><tr><td>无水 D-(+)-葡萄糖 (C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;12&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;)</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>11462858</td><td>也可使用其他戊糖和己糖（例如 D-木糖、D-阿拉伯糖）。葡萄糖并非 &lt;em&gt;S. acidocaldarius&lt;/em&gt; 的优选碳源（SV Albers，个人交流）</td></tr><tr><td>双蒸水 (ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>琼脂替代物 Gelrite</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>G1101.1000</td><td>Gelrite（结冷胶）因具有更高的熔点，可替代琼脂用于制备固体培养基。</td></tr><tr><td>玻璃 100 mm 培养皿</td><td>Brand</td><td>BR455742</td><td>使用玻璃培养皿是因为大多数标准的 90 mm 聚苯乙烯培养皿在 75 &amp;deg;C 下会变形（取决于品牌）。也可使用六孔板，因其在高温下不会变形。</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>New Brunswick</td><td>Innnova 42R</td><td>也可使用其他类型的培养箱。购买或使用前请确认设备的工作温度，因为许多培养箱无法达到高于 65&amp;deg;C 的温度。</td></tr><tr><td>六水氯化铁(III) (FeCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Supelco</td><td>103943</td><td>用于配制铁储备液</td></tr><tr><td>七水硫酸镁（Epsom 盐）(MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td>用于配制 Brock 储液 I。</td></tr><tr><td>四水氯化锰(II) (MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIALM5005-100G</td><td>用于配制微量元素储备液。</td></tr><tr><td>迷你智能 Wi-Fi 插座，带能耗监测功能</td><td>Tapo</td><td>Tapo P110</td><td>用于监测能耗&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>N-Z-Amine A - 酪蛋白酶解水解物&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0626-500G</td><td>N-Z-Amine-A 用作氨基酸来源。</td></tr><tr><td>回形针（或其他坚固金属丝）</td><td>无</td><td>无</td><td>用于穿刺 2 mL 微量离心管。</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾（单磷酸钾）(KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>用于配制 Brock 储液 I。</td></tr><tr><td>Promega Wizard 基因组 DNA 纯化试剂盒</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td>可选，用于实验室提取基因组 DNA</td></tr><tr><td>二水钼酸钠 (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;MoO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1651-100G</td><td>用于配制微量元素储备液。</td></tr><tr><td>十水四硼酸钠（硼砂）(Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;B&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;&amp;middot;10H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9640</td><td>用于配制微量元素储备液。</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>BMG</td><td>SPECTROstar OMEGA</td><td>用于测定 600 nm 处的光密度（OD）。其他可读取 600 nm OD 值的分光光度计也可使用。</td></tr><tr><td>硫酸（按 1:1 比例用水稀释）(H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>11337588</td><td>用于将 Brock 储液 II/III 的 pH 调整至最终 pH 2&amp;ndash;3。</td></tr><tr><td>恒温混匀仪</td><td>DLab</td><td>HM100-Pro</td><td>也可使用其他类型的恒温混匀仪；关键是要能维持 65&amp;ndash;75 &amp;deg;C 的温度和 400 RPM 的转速</td></tr><tr><td>尿嘧啶 (C&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U0750</td><td>pyrE 基因的缺失是 &lt;em&gt;S. acidocaldarius&lt;/em&gt; 中常见的遗传标记。缺失菌株必须补充尿嘧啶才能生长。对于 DSM639 野生型菌株，补充尿嘧啶并非严格必需，但此处仍包含此步骤，因为后续实验可能涉及缺失菌株。</td></tr><tr><td>二水硫酸钒氧 (VOSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>204862</td><td>用于配制微量元素储备液。</td></tr><tr><td>七水硫酸锌 (ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221376</td><td>用于配制微量元素储备液。</td></tr></tbody></table>

生命极端环境下的适应：利用嗜极古菌sulfolobus acidocaldarius进行的实验进化

Adaptation at the Extremes of Life: Experimental Evolution with the Extremophile Archaeon Sulfolobus acidocaldarius

嗜酸热硫化叶菌（Sulfolobus acidocaldarius）已成为一种极具潜力的嗜热模式系统。研究嗜热微生物如何适应温度变化，不仅对于理解基本的进化过程至关重要，而且对于将S. acidocaldarius开发为生物工程的底盘系统也具有重要意义。然而，开展嗜热微生物实验进化的重大障碍之一，是传统高温培养箱在设备维护和能源消耗方面的高昂成本。为应对这一挑战，本文提出了一套完整的在S. acidocaldarius中进行实验进化的实验方案，该方案采用低成本且节能的台式恒温混匀仪。该方案采用分批培养技术，使用相对较小的培养体积（1.5 mL），可同时追踪多个独立谱系的适应过程。通过增加恒温混匀仪的数量，该方法可轻松实现规模扩展。这种方法通过降低实验研究的初始投入和持续运行成本，显著提高了S. acidocaldarius作为模式系统的可及性。此外，该技术还可推广应用于其他微生物系统，用于研究其对多种环境条件的适应机制。

生长曲线测定 
S. acidocaldarius DSM639 的生长曲线如图3A所示。比较使用恒温混匀仪与传统培养箱进行培养时，发现其生长情况相似。通过将逻辑斯蒂曲线拟合至每条重复的生长曲线，并计算平均值和标准误，估算了平均生长速率参数。在恒温混匀仪和培养箱中达到对数中期的时间分别为 27.2 h ± 1.1 h 和 31.1 h ± 1.9 h。在 75 °C 条件下，恒温混匀仪和培养箱的初始倍增时间估计值分别为 4.29 h ± 0.28 h 和 4.19 h ± 0.44 h，与先前发表的数值一致24。log10(OD600nm) 与 log10(CFU) 之间的关系可通过线性模型良好描述（校正后 R2 = 0.82，F(1,22) = 104，p &lt; 0.00001，斜率 = 1.73 ± 0.17，截距 = 9.73 ± 0.14）。因此，OD600nm 与 CFU 之间的关系由以下公式给出：CFU = 10(1.73 × log10(OD600nm) + 9.73)。OD600nm 为 0.3 时，相当于约 6.7 × 108 CFU/mL（图3B）。
温度演变实验 
使用源自 S. acidocaldarius DSM639 的七个独立谱系，设置了三种温度条件：恒定75 °C、恒定65 °C，以及温度梯度下降（从75 °C降至65 °C，每两次传代降低1 °C）。在为期45天（约在75 °C下经历了150代）的实验过程中，每次传代后均测定OD600nm，结果如图4所示。由于生长周期、温度等因素可能存在微小差异，跨天数的OD600nm测定值本身具有一定的波动性。然而，这些跨天数据仍可用于评估种群的存活性，并反映适应性是否随时间提高。在恒定75 °C条件下，各谱系的OD600nm值从初始范围0.125–0.3上升至实验结束时的0.248–0.471，表明该处理下种群适应性有所提升。相比之下，在恒定65 °C条件下，谱系的OD600nm值从初始范围0.018–0.087下降至最终时间点的0.008–0.04，表明种群未能充分适应这一恒定低温环境；但能够回收到存活个体的事实说明，种群未在连续稀释过程中被完全清除，提示存在一定程度的适应能力。最后，在温度梯度下降处理中，种群的OD600nm值从初始范围0.099–0.279上升至Tx6时（对应288小时，73 °C）的0.3–0.39，随后逐渐下降，至实验结束时降至0.003–0.024的范围。
生长/适合度测定 
在进化实验结束后，对每个衍生群体进行适合度测定。所有七个独立谱系在培养 48 小时后测定 OD600nm，随后在 R 中对每种测定温度拟合线性模型，其中“选择环境”作为主效应，“重复/恒温混匀仪”作为区组效应。以祖先菌株的生长情况作为处理对比的参照基准。数据如图 5所示。
在75 °C下进行检测时，来自恒定75 °C（t检验：t210=3.64，p=0.0003）和恒定65 °C（t检验：t210=2.8，p=0.005）处理的谱系相对于祖先菌株，其适应性平均显著提高；但温度下降处理的谱系则无显著提高（t检验：t210=−0.87，p=0.38）。在65 °C下检测时，所有处理组的谱系其适应性平均均有所提高（恒定75 °C谱系：t检验：t210=4.68，p&lt;0.0001；恒定65 °C谱系：t检验：t210=4.24，p&lt;0.0001；温度下降谱系：t检验：t210=3.15，p=0.002）。然而，在两个检测温度下，不同谱系间的适应性存在显著差异（图5）。部分谱系与祖先菌株相比适应性无明显变化，甚至有所下降；这一现象在温度下降处理的谱系中尤为明显。
值得注意的是，在进化实验过程中，OD600nm 与 CFU/mL 之间的关系可能已发生变化。可通过测定进化谱系的生长参数（按照步骤 3.1–3.10）来评估这一变化。
全基因组测序结果 
采用 breseq（版本 0.38.1）25 对在恒定 75 °C 条件下获得的七个谱系进行全基因组分析，参考基因组为 S. acidocaldarius DSM639（RefSeq 登录号 NC_007181.1）。分析揭示了所有后代谱系基因组中存在多种类型的突变，包括插入、缺失以及单核苷酸多态性（SNP）（表 2）。多个插入突变和非同义突变位于蛋白质编码基因以及基因间区域，后者可能因启动子区域的移码突变而影响基因表达。部分突变在多个后代谱系中一致出现，涉及细胞壁生物合成、转录、代谢、细胞转运和催化活性等多种功能相关的基因（表 2）。其中，在七个谱系中的五个谱系中均发现一段长达 54,667 个碱基对的大片段缺失；该缺失通过各群体的覆盖度缺失图谱得以确认（频率范围为 93.2% 至 100%）。该缺失区域共导致 53 个基因的丢失；这些基因在适应过程中的作用将在后续研究中进一步探究。此外，在本研究使用的 DSM639 菌株与已发表的参考序列之间也发现了一些差异（见补充表 1）。
摇床培养箱与恒温混匀仪的能量消耗对比 
摇床培养箱与恒温混匀仪在一系列常见培养温度下的能耗，通过市售的智能能耗监测插座进行了比较，以及 75 °C 此处使用的温度。在 75 °C，该恒温混匀仪消耗的功率约为1/40th 传统摇床培养箱的能量图6），表明热混仪可能是一种减少与实验进化相关的碳足迹的手段。
<img alt="嗜酸热硫化叶菌进化实验示意图；培养步骤、温度变化、甘油菌种保存。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66271/66271fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：展示在三种温度处理条件下进化实验方案的流程图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/66271fig01largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="温度适应实验示意图；OD600测定，恒温混匀仪设置，微生物生长。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66271/66271fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：生长/适合度测定实验流程图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/66271fig02largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细菌生长曲线图，OD（600 nm）随时间变化及CFU比较，孵育箱法与恒温混匀器法对比。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66271/66271fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3关键生长参数的测定及培养装置的比较 S. acidocaldarius DSM639 三个重复培养物在以下条件下培养： 75 °C 在7个独立的试管中。采用破坏性取样法进行测量（A) OD600nm （均值 ± 标准误） n=3 次技术重复；部分误差线小于绘图符号）；曲线表示拟合的逻辑斯谛生长模型以及（B菌落形成单位（CFUs）；线条代表拟合的对数-对数线性回归模型。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/66271fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细菌培养物的生长分析图；不同温度下的光密度与时间关系。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66271/66271fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：进化实验过程中获得的光密度（OD600nm）代表性结果。在约150代的进化实验中，三种温度处理条件（恒定65 °C、恒定75 °C、从75 °C降至65 °C）下独立谱系的光密度测量结果。曲线表示每个独立谱系随时间变化的Loess平滑拟合。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/66271fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示不同谱系和温度下 600 nm 处光密度的生长实验结果图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66271/66271fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：生长实验的代表性结果。对源自 S. acidocaldarius DSM639 的独立谱系在温度进化实验（恒定 65 °C、恒定 75 °C、从 75 °C 降至 65 °C）后进行的生长实验，与祖先菌株进行比较。对所有谱系均在 65 °C 和 75 °C 下检测其生长情况。彩色数据点表示技术重复的均值 ± 标准误差（灰色显示，祖先菌株 n = 12，每个进化谱系 n = 3）。灰色条形表示祖先适应度的均值 ± 标准误差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/66271fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="比较传统培养箱与恒温混匀仪在不同温度范围下能耗的图表，实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66271/66271fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：传统培养箱与恒温混匀仪设备的能耗对比。 使用市售的智能电量监测插座记录2小时内的能耗。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/66271fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：培养所需培养基配方及储备液 S. acidocaldarius. 所有培养基和储备液均应使用重蒸水配制2O (ddH₂O)2O），然后通过高压灭菌或使用滤器过滤除菌 0.22 µm 过滤，如上所述。有关培养基和贮存液配制的详细说明，请参见方案第1节。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/Table%201.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2：后代谱系全基因组测序的代表性结果。 在持续75 °C处理条件下，从 S. acidocaldarius DSM639 衍生的后代谱系中发现的突变。这些突变是相对于该谱系的直接祖先而言的，而该祖先相对于 S. acidocaldarius DSM639 的参考序列（RefSeq NC_007181）已存在多个变异（祖先中的突变见补充表1）。n 表示发现某一突变的谱系数目。→ 表示位于“正向读码框”的基因；← 表示位于“反向读码框”的基因。†这些变异是相对于 S. acidocaldarius DSM639 分离株中存在的 (A)10→11 移码突变而言的（见补充表1）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/Table%202.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充表 1：与参考序列（RefSeq 编号 NC_007181.1）相比，在 S. acidocaldarius DSM639 菌株中发现的突变。 → 表示位于“正向读码框”的基因；← 表示位于“反向读码框”的基因。‡SACI_RS04020 在 NC_007181.1 中被注释为假基因，但本研究中观察到的 1 个碱基缺失（Δ1 bp）移码突变可能恢复其功能，因为该突变使其编码的蛋白质与 rgy 反向旋转酶基因（RefSeq 编号 WP_176586667.1）具有 100% 的一致性。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/Supplementary%20Table-1.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文介绍了一种利用低成本、节能型台式恒温混匀仪作为培养设备，针对嗜热微生物进行实验进化的适应性演化实验方案。该技术通过表征一种最适生长温度为75 °C的古菌——Sulfolobus acidocaldarius的温度适应性加以示范。

生命极端环境下的适应：利用嗜极古菌Sulfolobus acidocaldarius进行的实验进化

嗜热古菌硫化叶菌（Sulfolobus acidocaldarius）已成为一种极具潜力的嗜热模式系统。研究嗜热微生物如何适应温度变化……

我们课题组的研究重点是揭示进化的规律。通过本项目，我们开发了一种新方案，利用受控的实验室实验来研究嗜热微生物的进化过程。这将帮助我们回答诸如它们如何通过适应性进化响应环境变化等科学问题。一个主要挑战是控制培养条件。嗜热微生物的生长需要高温环境，这会导致较高的蒸发速率，在培养期间存在培养物和生长平板干燥的风险。另一个挑战是一些嗜热微生物生长速度较慢，这使得快速迭代测试变得困难。本方案解决了在多个温度条件下培养嗜热微生物所面临的主要挑战。我们现在能够更好地控制环境条件，确保所观察到的结果具有一致性，并真实反映所设定的实验条件。这将使我们能够在实时条件下研究嗜热微生物的适应过程。本方案提供了一种高通量的方法，不仅适用于硫化叶菌的研究，还可推广至多种微生物。利用温控混匀仪，我们能够在不同温度下同时开展实验，而无需使用多台大型摇床培养箱。该方法还降低了能源消耗，为这类研究提供了更为环保的途径。我们的研究结果为开展硫化叶菌及其他嗜热微生物的进化实验铺平了道路。目前我们所了解的进化知识大多来源于对中温生物的研究，而我们有可能忽略了来自嗜热生物的关键进化规律，这些规律将有助于我们解释地球生命多样性的演化过程。首先，使用本生灯小心加热一根钝头钢丝。将它插入一个2 ml微量离心管的管盖中，形成一个1 mm宽的孔。将打孔后的管子放入可高压灭菌的容器中进行灭菌。待管子经高压灭菌并冷却后，加入1.5 ml预热的BBM+培养基。然后使用枪头从甘油保存的酸热硫化叶菌（Sulfolobus acidocaldarius）菌种中刮取约50至60 mg的菌体。将接种物转移至装有BBM+的试管中。保留一支未接种的BBM+试管作为阴性对照。为防止穿刺管盖产生气溶胶逸出，可在管盖顶部放置一层耐热且透气的膜。将接种后的试管放入恒温混匀仪中进行培养。当培养物达到所需的光密度后，在室温下以 5,000 g 离心两分钟，然后用移液器吸去上清液并弃去。向沉淀中加入 1.5 ml 温热的 BBM+ 培养基，并将细胞沉淀重悬于培养基中。通过比较使用热混匀仪与传统培养箱的培养效果，发现两者的生长情况相似。首先，使用分光光度计测定嗜酸热硫化叶菌（Sulfolobus acidocaldarius）起始培养物的光密度。接着，将起始培养物进行系列稀释，稀释倍数从10⁻¹至10⁻⁶。从10⁻⁵和10⁻⁶稀释液中各吸取100微升，分别转移至含有固体BBM+的六孔板的孔中。将六孔板放入装有湿润纱布的盒子中，在75摄氏度的静置培养箱中培养5至7天，直至单菌落出现。为获得所需数量的由单菌落衍生的进化谱系，使用接种环随机挑取一个单菌落，将其重悬于含有穿孔的2毫升离心管中的1.5毫升预热BBM+培养基中。正确标记试管。在对多个菌落重复重悬操作后，取一支试管加入1.5 ml培养基作为阴性对照。用透气膜密封各试管管口，然后在恒温混匀仪中孵育，直至菌液变浑浊。将克隆培养物在室温下以 5,000 g 离心一分钟。弃去上清液后，加入 200 µL BBM+ 至离心管中，重悬沉淀。向每根离心管中加入 200 µL 50% 甘油，制备甘油保存液。然后将储备液保存在 80 摄氏度，直至进一步实验。开始时，使用复苏的祖先型硫化叶菌（Sulfolobus acidocaldarius）种群。加入 BBM+ 培养基将菌液稀释至 OD600 为 0.01。从七种培养物中分别吸取适当体积的液体，加入三个独立的带穿孔2 ml离心管中。用透气膜密封离心管。然后将每组七份的祖先种群分别放入独立的恒温混匀仪中。将每个恒温混匀仪设置为所需的温度和400 RPM，以开始进化实验。48小时后，将每个转接零代培养物中的15微升转移至含有1.5 ml预热BBM+培养基的2 ml穿孔管中，该管标记为转接1。用透气膜密封试管，然后将其放回恒温混匀仪中随机位置。使用基于平板的分光光度计测量转移零代（transfer-zero）的OD600，以完成第一次转移。每两天重复一次培养物转移和光密度测量，持续进行转移，直至达到预期的转移次数。每第10次转移以及最后一次转移后，制备种群的甘油保存液，并在试管上标注祖先种群标识符和转移代数。应将恒温混匀仪设定在75摄氏度和65摄氏度的恒定温度。第三个恒温混匀仪将逐步降温，以观察其对渐进式温度变化的响应。实验开始时，将复活的祖先菌株及经温度进化后的嗜酸热硫化叶菌（Sulfolobus acidocaldarius）培养物在最终目标温度下进行孵育。孵育完成后，在600纳米处测定其光密度。接着，为每种培养物向六组试管（每组七支）中各加入1.5 ml BBM+。然后，将每种培养物各15微升分别加入上述六组试管中。将三个恒温混匀仪设定为75摄氏度，另三个恒温混匀仪设定为65摄氏度。将试管根据温度和重复编号放入对应的恒温混匀仪中。经过48小时培养后，从每种培养物中转移200 µL至96孔板中。使用分光光度计测量光密度。最后，使用统计软件对数据进行绘图和分析。在实验结束时，恒定75摄氏度条件下的菌系其OD600值相较于初始范围有所上升。相比之下，恒定65摄氏度处理组的菌系则表现出下降趋势。在降温处理组中，种群数量从初始光密度增加至第6次传代，随后呈现持续下降趋势。

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