生命极端环境下的适应：利用嗜极古菌Sulfolobus acidocaldarius进行的实验进化

我们课题组的研究重点是揭示进化的规律。通过本项目，我们开发了一种新方案，利用受控的实验室实验来研究嗜热微生物的进化过程。这将帮助我们回答诸如它们如何通过适应性进化响应环境变化等科学问题。

一个主要挑战是控制培养条件。嗜热微生物的生长需要高温环境，这会导致较高的蒸发速率，在培养期间存在培养物和生长平板干燥的风险。另一个挑战是一些嗜热微生物生长速度较慢，这使得快速迭代测试变得困难。

本方案解决了在多个温度条件下培养嗜热微生物所面临的主要挑战。我们现在能够更好地控制环境条件，确保所观察到的结果具有一致性，并真实反映所设定的实验条件。这将使我们能够在实时条件下研究嗜热微生物的适应过程。

本方案提供了一种高通量的方法，不仅适用于硫化叶菌的研究，还可推广至多种微生物。利用温控混匀仪，我们能够在不同温度下同时开展实验，而无需使用多台大型摇床培养箱。该方法还降低了能源消耗，为这类研究提供了更为环保的途径。

我们的研究结果为开展硫化叶菌及其他嗜热微生物的进化实验铺平了道路。目前我们所了解的进化知识大多来源于对中温生物的研究，而我们有可能忽略了来自嗜热生物的关键进化规律，这些规律将有助于我们解释地球生命多样性的演化过程。首先，使用本生灯小心加热一根钝头钢丝。

将它插入一个2 ml微量离心管的管盖中，形成一个1 mm宽的孔。将打孔后的管子放入可高压灭菌的容器中进行灭菌。待管子经高压灭菌并冷却后，加入1.5 ml预热的BBM+培养基。然后使用枪头从甘油保存的酸热硫化叶菌（Sulfolobus acidocaldarius）菌种中刮取约50至60 mg的菌体。

将接种物转移至装有BBM+的试管中。保留一支未接种的BBM+试管作为阴性对照。为防止穿刺管盖产生气溶胶逸出，可在管盖顶部放置一层耐热且透气的膜。

将接种后的试管放入恒温混匀仪中进行培养。当培养物达到所需的光密度后，在室温下以 5,000 g 离心两分钟，然后用移液器吸去上清液并弃去。向沉淀中加入 1.5 ml 温热的 BBM+ 培养基，并将细胞沉淀重悬于培养基中。

通过比较使用热混匀仪与传统培养箱的培养效果，发现两者的生长情况相似。首先，使用分光光度计测定嗜酸热硫化叶菌（Sulfolobus acidocaldarius）起始培养物的光密度。接着，将起始培养物进行系列稀释，稀释倍数从10⁻¹至10⁻⁶。

从10⁻⁵和10⁻⁶稀释液中各吸取100微升，分别转移至含有固体BBM+的六孔板的孔中。将六孔板放入装有湿润纱布的盒子中，在75摄氏度的静置培养箱中培养5至7天，直至单菌落出现。为获得所需数量的由单菌落衍生的进化谱系，使用接种环随机挑取一个单菌落，将其重悬于含有穿孔的2毫升离心管中的1.5毫升预热BBM+培养基中。

正确标记试管。在对多个菌落重复重悬操作后，取一支试管加入1.5 ml培养基作为阴性对照。用透气膜密封各试管管口，然后在恒温混匀仪中孵育，直至菌液变浑浊。

将克隆培养物在室温下以 5,000 g 离心一分钟。弃去上清液后，加入 200 µL BBM+ 至离心管中，重悬沉淀。向每根离心管中加入 200 µL 50% 甘油，制备甘油保存液。

然后将储备液保存在 80 摄氏度，直至进一步实验。开始时，使用复苏的祖先型硫化叶菌（Sulfolobus acidocaldarius）种群。加入 BBM+ 培养基将菌液稀释至 OD600 为 0.01。

从七种培养物中分别吸取适当体积的液体，加入三个独立的带穿孔2 ml离心管中。用透气膜密封离心管。然后将每组七份的祖先种群分别放入独立的恒温混匀仪中。

将每个恒温混匀仪设置为所需的温度和400 RPM，以开始进化实验。48小时后，将每个转接零代培养物中的15微升转移至含有1.5 ml预热BBM+培养基的2 ml穿孔管中，该管标记为转接1。用透气膜密封试管，然后将其放回恒温混匀仪中随机位置。

使用基于平板的分光光度计测量转移零代（transfer-zero）的OD600，以完成第一次转移。每两天重复一次培养物转移和光密度测量，持续进行转移，直至达到预期的转移次数。每第10次转移以及最后一次转移后，制备种群的甘油保存液，并在试管上标注祖先种群标识符和转移代数。

应将恒温混匀仪设定在75摄氏度和65摄氏度的恒定温度。第三个恒温混匀仪将逐步降温，以观察其对渐进式温度变化的响应。实验开始时，将复活的祖先菌株及经温度进化后的嗜酸热硫化叶菌（Sulfolobus acidocaldarius）培养物在最终目标温度下进行孵育。

孵育完成后，在600纳米处测定其光密度。接着，为每种培养物向六组试管（每组七支）中各加入1.5 ml BBM+。然后，将每种培养物各15微升分别加入上述六组试管中。

将三个恒温混匀仪设定为75摄氏度，另三个恒温混匀仪设定为65摄氏度。将试管根据温度和重复编号放入对应的恒温混匀仪中。经过48小时培养后，从每种培养物中转移200 µL至96孔板中。使用分光光度计测量光密度。

最后，使用统计软件对数据进行绘图和分析。在实验结束时，恒定75摄氏度条件下的菌系其OD600值相较于初始范围有所上升。相比之下，恒定65摄氏度处理组的菌系则表现出下降趋势。

在降温处理组中，种群数量从初始光密度增加至第6次传代，随后呈现持续下降趋势。